用于治疗神经退行性变疾病的 α- 突出核蛋白和其疫苗的 模拟表位 本发明涉及一种待用于预防和 / 或治疗突触核蛋白病 (synucleinopathy) 的医药。 突触核蛋白病是一组具有下述共同病理学特征的不同神经退行性变疾病 ： 在神经 病理学检查中可检测出含有异常 α- 突出核蛋白 (α-syn) 蛋白质聚集于选定种群的神经 元和神经胶质细胞中的特征性损伤。 α-syn( 起初鉴别为 PARK1 和 PARK4) 是广泛表达于新 皮质、 海马、 齿状回、 嗅球、 纹状体、 丘脑和小脑的 140 个氨基酸的蛋白质。α-syn 还在造血 细胞， 包括 B-、 T- 和 NK 细胞， 以及单核细胞和血小板中高表达。其在这些细胞中确切的作 用尚为未知， 但已发现其涉及巨核细胞 ( 血小板的前体 ) 的分化。
最常见的突触核蛋白病包括但不仅限于 Lewy 体病 (Lewy body disorder， LBD)， 如 帕金森氏病 (PD)， 帕金森氏病伴痴呆 (PDD)， 痴呆伴 Lewy 体， 以及多系统萎缩 (MSA) 或神经 退行性变伴脑铁聚集 I 型 (Brain Iron AccumulationType I， NBIA Type 1)。对这些疾病 的现行治疗手段包括针对症状的药物， 如 L- 多巴、 抗胆碱能药以及单胺氧化酶抑制剂。然 而， 所有现行的治疗手段仅仅导致症状缓解， 而无法在患者中诱导长期持续的疾病减轻作 用。
Lewy 体病是以震颤、 强直、 运动徐缓 (bradykinesia) 和脑中多巴胺能神经元的丧 失为特征的进行性的神经退行性变疾病。 在 DLB 和 PDD 的情况下， 症状还包括认知缺损。 在 西方国家高于 60 岁年龄的人群中高至 2％发展出 PD/LPD 的典型症状。目前， 仅有针对症 状的治疗方法。 不幸的是， 这些疗法仅仅提供对早期症状的暂时缓解， 而无法停止疾病的进 行。
PD/LBD 的发病机理仍然未完全理解， 但看来该疾病的发展牵涉到遗传易感性和环 境因素。虽有遗传学方面的所有进展， PD/LBD 仍主要是未知原因的散发病症 ( 亦称为自发 性 PD/LPD)。罹患该疾病的患者在脑的皮质和皮质下区域内发展出称为 Lewy 体 (LB) 的特 征性的泛素化 (ubiquitinated) 胞内包涵物 (inclusion)。特别是在具有高多巴胺能神经 元或神经投射 (neuronalprojection) 的区域显示这种类型的病理学特征。
近来， 数个研究显示突触蛋白 α-syn 在 LBD 发病中起中心作用。 在 LBD 中， α-syn 在遍及受影响的脑区域中的 LB 中积聚。此外， 可以表明 α-syn 中的单个点突变 (single point mutation) 以及双倍或多倍增殖 (duplication ormultiplication) 与罕见的家 族型帕金森氏综合症相关。重要的是， 基于来自转基因 (tg) 小鼠以及果蝇 (Drosophila melanogaster) 的过表达研究的结果， 理解了其在 PD/LBD 发病中关键作用， 这是由于这些 动物模型模拟了 PD 的数种特征。
另一种非常重要的突触核蛋白病是多系统萎缩 (MSA)。MSA 是以耐 L-DOPA 帕金 森氏综合症、 小脑性共济失调和家族性自主神经异常症状为特征的自发的神经退行性变疾 病。 患者遭受影响不同脑区域， 包括纹状体、 黑质、 小脑、 脑桥以及下橄榄体和脊髓的多系统 神经元丧失 (neuronal loss) 的痛苦。MSA 以遍及中央神经系统的 α-syn- 阳性的神经胶 质细胞质包涵物 (glialcytoplasmic inclusion， GCI) 和罕见的神经元包涵物 (neuronal
inclusion) 为特征。这些包涵物与纹状体黑质变性 (striatonigral degeneration)、 橄榄 体脑桥小脑萎缩相关， 并涉及延髓和脊髓中的自主神经核。 GCI 对于 MSA 发病的重要性已被 广泛接受， 并因近来对分析在少突胶质细胞中 α-syn 过表达的作用的转基因小鼠模型的 分析而格外显得重要。在过表达人类 α-syn 的 tg 小鼠中， 观察到了似 GCI 聚集物和 MSA 的生物化学标记。
尽管 α-syn 积聚导致在突触核蛋白病中神经退行性变典型特征以及突触核蛋白 病的特征性症状的准确机理尚未完全理解， 最近的研究暗示 α-syn 寡聚物的异常形成和 积聚涉及突触核蛋白病中根本的退行性变过程。 现在相信上述的寡聚物形成， 例如， 在突出 末端和轴突中的， 在 PD/LBD 发展中起重要作用。因此减少 α-syn 的沉积和寡聚化应对于 治疗突触核蛋白病， 特别是自发性的 LBD/PD 和 MSA 是有利的， 并且可以首次提供除仅仅减 轻症状的现行治疗策略， 如施用 L-DOPA 外的治疗这些神经退行性变疾病的策略。
在 Iwatsubo T.(Neuropathology 27(5)(2007) ： 474-478) 中， 检查了 α- 突触核 蛋白以及其磷酸化与 α- 突触核蛋白病的发病的关联。该出版物的作者发现沉积于突触核 蛋白病病变中的 α- 突触核蛋白的丝氨酸 129 广泛的被磷酸化。
US 2007/213253 涉及突变的人类 α- 突触核蛋白， 以及自其衍生， 可用于抑制野 生型人类 α- 突触核蛋白聚集的肽。
在 WO 2004/041067 中， 公开了供预防或治疗与 α- 突触核蛋白聚集相关疾病的手 段和方法， 包括使用 α- 突触核蛋白片段。
在 US 2003/166558 中， 描述了可用于诱导针对蛋白质沉积物免疫应答的肽。
US 2005/198694 涉及包括至少 100 个氨基酸并具有 C- 末端 1 到 23 个氨基酸缺失 的 α- 突触核蛋白片段。
尽管使用神经营养因子和移植多巴胺能细胞的实验性疗法产生让人觉得有前途 的结果， 仍需要设计用来减少 α-syn 神经元积聚的替代手段。
近来， 主动和被动免疫疗法作为针对神经退行性变疾病， 如阿尔茨海默氏症 (AD)， 朊疾病 (Prion Disease) 以及亨廷顿舞蹈症 (Chorea Huntington) 和淀粉状蛋白侧索硬化 (amyloid lateral sclerosis， ALS) 的潜在的新治疗策略逐渐引人注目。举例而言， 最近 的对 AD 的 tg 模型的研究显示， 针对 β- 淀粉状蛋白 1-42(Aβ) 的抗体促进淀粉状蛋白自 脑中去除， 导致认知能力的改善。重要的是， Aβ 分子主要位于胞外， 因此构成免疫系统可 接近的表位。与上述免疫疗法的 “经典” 靶相对， 进行实验衡量减少胞内病源分子积聚的潜 在免疫疗法。已显示靶向朊蛋白和亨廷顿蛋白 (huntingtin) 的免疫接种手段在 tg 小鼠的 神经元中对减少上述两种类似 α-syn 在胞内积聚的分子是有效的。此外， 最近的实验还描 述了抗 -Tau 和抗 SOD1 疗法分别作为在 AD 和 ALS 中针对胞内病原性蛋白质聚集物的新颖 治疗策略。因此， 已积累了具有说服力的证据证明脑细胞中的胞内聚集可作为免疫疗法的 靶。事实上， 近来显示了相似的治疗突触核蛋白病的潜力。过表达人类 α-syn 的 tg 小鼠 经人类 α-syn 蛋白质接种。在接种后产生高相对亲和力的小鼠中， 在神经元细胞体和突触 中聚集的 α-syn 积聚减少， 其与神经退行性变减少相关。进一步， 由经免疫化的动物产生 的抗体亦检测到了以异常聚集形式存在与神经元膜相关的 α-syn， 并促进这些聚集物的降 解， 可能是通过溶酶体途径。使用以外源施加的 α-syn 特异性抗体的被动免疫疗法观察到 相似的作用。这些结果表明接种对减少 α-syn 聚集物的神经元积聚是有效的， 且对该方法的进一步发展可对治疗 LBD 和突触核蛋白病产生有益作用。
本发明的目标是提供基于育苗预防和治疗突触核蛋白病的药物。
因此本发明涉及使用至少一种包含下述氨基酸序列的化合物 ：
(X1)nX2X3PVX4X5X6(X7)m ( 式 1)，
其中
X1 是任何氨基酸残基，
X2 是选自下组的氨基酸残基 ： 天冬氨酸 (D) 和谷氨酸 (E)，
X3 是任何氨基酸残基，
X4 是任何氨基酸残基，
X5 是选自下组的氨基酸残基 ： 脯氨酸 (P) 和丙氨酸 (A)，
X6 是选自下组的氨基酸残基 ： 天冬氨酸 (D) 和谷氨酸 (E)，
X7 是任何氨基酸残基，
n 和 m， 彼此独立， 是 0 或大于 0 的整数，
且其中式 I 的氨基酸序列并不包括 α- 突触核蛋白具有氨基酸序列 DMPVDPDN 的 8 聚体多肽片段， 且并不与其等同， 所述化合物具有对针对包含氨基酸序列 DMPVDPDN 的 α- 突触核蛋白表位具有特异性的抗体的结合能力， 以供产生供预防和 / 或治疗突触核蛋 白病的药物。 本发明的化合物能够诱导在体内产生导向 ( 结合 )α- 突触核蛋白， 特别是包含氨 基酸序列 DMPVDPDN 的 α- 突触核蛋白表位的抗体 ( 亦包括含所述氨基酸序列的 α- 突触 核蛋白片段 )。然而， 导向 ( 结合 ) 所述表位的抗体， 与针对 α- 突触核蛋白相比较， 针对 β- 突触核蛋白不显示或仅显示显著较低的免疫反应性。与之相对， 由用含 DMPVDPDN 的原 始 α- 突触核蛋白表位的免疫化诱导的抗体令人惊讶的结合于 α- 突触核蛋白和 β- 突触 核蛋白两者。因此， 与原始 α- 突触核蛋白或其片段不同， 本发明的化合物提供了针对所述 与疾病相关分子的特异性， 并避免了与和疾病不相关的 β- 突触核蛋白的交叉反应性。这 就效率和安全性而言显示了强烈的优越性， 尤其是后者， 因为已有对 β- 突触核蛋白的神 经保护特性的描述。Hashimoto M.et al.， J Biol Chem.2004May28 ； 279(22) ： 23622-9. Hashimoto M， Neuron.2001Oct 25 ； 32(2) ： 213-23。
由施用本发明化合物诱导的 α- 突触核蛋白特异性抗体可能不仅结合于单体形 式的 α- 突触核蛋白， 还与其多聚形式结合。这使得减少在待治疗的个体体内 α- 突触核 蛋白寡聚物的量成为可能。减少 alpha- 突触核蛋白对于治疗突触核蛋白特别有益。
所述氨基酸序列 (X1)nX2X3PVX4X5X6(X7)m 视为包含氨基酸序列 DMPVDPDN 的 α- 突触 核蛋白表位的模拟表位。根据本发明， 术语 “模拟表位” 指具有对其模拟的表位具有拓扑学 等价物的构型的分子。 所述模拟表位与免疫特异性的结合于所期望抗原的抗体上同一个抗 原结合区相结合。所述模拟表位将在对其模拟的抗原具有反应性的宿主中产生免疫应答。 所述模拟表位亦可作为其模拟的表位的竞争者在涉及所述表位和结合于所述表位的抗体 的体外抑制分析法 ( 例如， ELISA 抑制分析法 ) 中起作用。然而， 本发明的模拟表位并不一 定在体外抑制分析法中阻止与其模拟的表位的结合， 或与之竞争， 尽管当其施用于哺乳动 物时， 能够诱导特异性免疫应答。
如本文所使用的术语 “表位” 指由特定抗体分子识别的抗原的免疫原区域。一般
而言， 抗原具有一个或更多表位， 每个表位能够结合识别该特定表位的抗体。
本发明的模拟表位可通过本领域众所周知的化学合成方法或者作为分离的肽， 或 者作为另一个肽或多肽的一部分人工产生。或者， 所述肽模拟表位可在产生所述肽模拟表 位的微生物中产生， 并随即将其分离， 并且， 若需要， 对其进行进一步纯化。 所述肽模拟表位 可在微生物， 如细菌、 酵母或真菌中产生， 或在重组病毒载体如腺病毒、 痘病毒、 疱疹病毒、 Simliki 森林病毒、 杆状病毒、 细菌噬菌体、 辛德比斯病毒或仙台病毒中产生。 供产生所述肽 模拟表位的合适细菌包括大肠杆菌 (E.coli)、 枯草杆菌 (B.subtilis) 或其他任何能够表 达肽， 如所述肽模拟表位的细菌。供表达所述肽模拟表位的合适的酵母类型包括酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、 粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、 假丝酵母属 (Candida)、 巴斯德毕赤氏酵母 (Pichia pastoris) 或任何其它能够表达肽的酵母。相应的 方法在本领域是众所周知的。此外， 供分离和纯化重组产生的肽的方法在本领域也是众所 周知的， 并包括， 例如， 凝胶过滤、 亲和层析、 离子交换层析等等。
为了促进所述肽模拟表位的分离， 可制备其中所述肽模拟表位在翻译中融合 ( 共 价连接 ) 于可通过亲和层析进行分离的异源多肽所得的融合多肽。通常所述的异源多肽 为 His- 标记 ( 例如， His6 ； 六个组氨酸残基 )、 GST- 标记 ( 谷胱甘肽 -S- 转移酶 ) 等等。所 述融合多肽不仅促进所述模拟表位的纯化， 还可以阻止所述模拟表位多肽在纯化过程中降 解。如果期望在纯化过程后去除所述异源多肽， 所述融合多肽可在所述肽模拟表位和所述 异源多肽间的连接处包含剪切位点。 所述剪切位点由可用对在所述位点的氨基酸序列具有 特异性的酶 ( 例如， 蛋白酶 ) 剪切的氨基酸序列组成。 本发明的模拟表位亦可在其 N- 和 / 或 C- 末端或附近修饰， 从而使得在所述位置 结合了半胱氨酸残基。在优选实施方案中， 末端位置 ( 位于所述肽的 N- 和 C- 末端 ) 的半 胱氨酸残基用于通过二硫键来环化所述肽。
本发明的模拟表位亦可用于不同的分析法和试剂盒， 特别是在免疫分析法和试剂 盒中。 因此， 特别优选所述模拟表位是另一个肽或多肽的一部分， 特别是在免疫分析法中用 作报道物的酶。上述报道酶包括， 例如， 碱性磷酸酯酶或辣根过氧化物酶。
本发明的 α- 突触核蛋白优选为其氨基酸序列在 α- 突触核蛋白或 α- 突触核 蛋白片段的氨基酸序列间变化的抗原性多肽。在此方面， 具有发明性的模拟表位可能不仅 包含一个或更多天然出现的氨基酸残基， 还包括一种或更多非天然出现的氨基酸残基 ( 亦 即， 非选自 20 个 “经典” 氨基酸 ) 的氨基酸取代， 或者其可完全由上述非天然的氨基酸组成。 另外， 诱导抗 -α- 突触核蛋白抗体的具有发明性的抗原可由 D- 或 L- 氨基酸或 DL- 氨基酸 的组合来组成， 并且视需要， 其可通过进一步修饰、 环闭合 (ring closure) 或衍生化进行改 变。合适的抗 -α- 突触核蛋白抗体诱导抗原可自可市购的肽文库提供。优选的， 这些肽为 至少 7 个氨基酸， 且优选的长度可高达 16， 优选高达 14 或 20 个氨基酸残基 ( 例如， 7或8 到 20 个， 7 或 8 到 16 个等等 )。然而， 根据本发明， 更长的肽亦可用作抗 -α- 突触核蛋白 抗体诱导抗原。进一步， 本发明的模拟表位亦可为多肽一部分并因此在其 N- 和 / 或 C- 末 端包含至少一个另外的氨基酸残基。
为了制备 α- 突触核蛋白模拟表位 ( 亦即， 抗 -α- 突触核蛋白抗体诱导抗原 )， 理所当然噬菌体文库、 肽文库亦为合适的， 例如由组合化学方法产生的或通过针对变化 最大的结构进行高通量筛选技术方法获取的 Display ： ALaboratory Manual by Carlos
F.Barbas(Editor)， et al. ； Willats WG Phagedisplay ： practicalities and prospects. Plant Mol.Biol.2002Dec. ； 50(6) ： 837-54)。
进一步， 根据本发明， 亦可使用基于核酸的抗 -α- 突触核蛋白 - 抗体诱导抗原 “适体” ( (aptamer))， 且其可使用变化最大的 ( 寡聚核苷酸 ) 文库 ( 例如， 具有 2-180 个核酸 残基的 ) 发现 ( 例如 Burgstaller 等， Curr.Opin.Drug Discov.Dev.5(5)(2002)， 690-700 ； Famulok et al.， Acc.Chem.Res.33(2000)， 591-599 ； Mayer 等， PNAS 98(2001))。在基于核 酸的抗 -α- 突触核蛋白抗体诱导抗原中， 核酸骨架可通过， 例如天然磷酸二酯化合物， 或 亦可通过磷硫酰化合物 (phosphorotioate) 或化学变化的组合 ( 例如， PNA) 来提供， 其中 根据本发明， 可主要使用 U、 T、 A、 C、 G、 H 和 mC 作为碱基。根据本发明可使用的核苷酸的 2’ 残基优选为 H、 OH、 F、 Cl、 NH2、 O- 甲基、 O- 乙基、 O- 丙基或 O- 丁基， 其中所述合适亦可经区 别修饰， 亦即， 例如用保护基团， 其通常用于寡聚核苷酸合成。因此， 基于适体的抗 -α- 突 触核蛋白抗体诱导抗原亦为本发明范围内的优选抗 -α- 突触核蛋白抗体诱导抗原。
根据本发明， 术语 “突触核蛋白病” 包括以病理性突触核蛋白聚集为特征的所有的 神经退行性变疾病。数种神经退行性变疾病包括帕金森氏症 (PD)、 Lewy 体病 (LBD)、 弥散 性 Lewy 体病 (DLBD)、 痴呆伴 Lewy 体病 (DLB)、 帕金森氏综合症伴痴呆 (PDD)、 多系统萎缩 (MSA) 和神经退行性变伴脑铁积聚类型 I(NBIA Type I) 共同归组为突触核蛋白病。 本发明的化合物不仅可用于治疗突触核蛋白病， 还可以用于在有发展突触核蛋白 病风险的个人 ( 例如， 易患， 例如因遗传原因易于发展突触核蛋白病 ) 中预防所述疾病。
本发明中公开的氨基酸残基的缩写遵循 IUPAC 的推荐 ：
氨基酸 丙氨酸 精氨酸 天冬氨酸 天冬酰胺 半胱氨酸 谷氨酸 谷氨酰胺 甘氨酸 组氨酸 异亮氨酸三字母代码 Ala Arg Asn Asp Cys Glu Gln Gly His Ile一字母代码 A R N D C E Q G H I8CN 101969989 A说亮氨酸 赖氨酸 甲硫氨酸 苯丙氨酸 脯氨酸 氨基酸 丝氨酸 苏氨酸 色氨酸 酪氨酸 缬氨酸明Leu Lys Met Phe Pro书L K M F P 一字母代码 S T W Y V6/17 页三字母代码 Ser Thr Trp Tyr Val
根据本发明的优选实施方案， X1 和 / 或 X7 是乙酰化的氨基酸残基或半胱氨酸 (C)。
根据本发明的另一个优选实施方案， X2 是谷氨酸， 且所述谷氨酸亦可经衍生化产 生焦谷氨酸。若 X2 包含叫谷氨酸， X1 是 0。
根据本发明进一步的另一个优选实施方案， X3 是选自下组的氨基酸残基 ： 谷氨酰 胺 (Q)、 丝氨酸 (S)、 苏氨酸 (T)、 精氨酸 (R)、 天冬酰胺 (N)、 缬氨酸 (V)、 组氨酸 (H)、 甲硫氨 酸 (M)、 酪氨酸 (Y)、 丙氨酸 (A) 和亮氨酸 (L)。
根据本发明的优选实施方案， X4 是选自下组的氨基酸残基 ： 谷氨酰胺 (Q)、 色氨酸 (W)、 苏氨酸 (T)、 精氨酸 (R)、 天冬氨酸 (D)、 异亮氨酸 (I)、 缬氨酸 (V)、 组氨酸 (H)、 脯氨酸 (P)、 酪氨酸 (Y)、 丙氨酸 (A)、 丝氨酸 (S) 和亮氨酸 (L)。
本发明的化合物亦可为 7 到 16 个氨基酸残基的多肽的一部分。因此 n 和 m 可彼 此独立的为选自下组的整数 ： 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 20 和 25。
本发明的化合物可由氨基酸序列 (X1)nX2X3PVX4X5X6(X7)m 组成， 其中 n 和 m 彼此独 立的为 0 或 1， 或者是包含至少 7 个氨基酸残基， 优选至少 10 个氨基酸残基， 较优选至少 15 个氨基酸残基和 / 或最多 50 个氨基酸残基， 有序最多 30 个氨基酸残基， 较优选为 16 个氨 基酸残基的多肽的一部分。
根据本发明的优选实施方案， 所述化合物包含具有选自下组的氨基酸序列的 肽： (C)DQPVLPD 、 (C)DMPVLPD 、 (C)DSPVLPD 、 (C)DSPVWAE 、 (C)DTPVLAE 、 (C)DQPVLPDN 、 (C)DMPVLPDN、 (C)DSPVLPDN、 (C)DQPVTAEN、 (C)DSPVWAEN、 (C)DTPVLAEN、 (C)HDRPVTPD、 (C)DRPVTPD、 (C)DVPVLPD、 (C)DTPVYPD、 (C)DTPVIPD、 (C)HDRPVTPDN、 (C)DRPVTPDN、 (C) DNPVHPEN、 (C)DVPVLPDN、 (C)DTPVYPDN、 (C)DTPVIPDN、 (C)DQPVLPDG、 (C)DMPVLPDG、 (C)
DSPVLPDG、 (C)DSPVWAEG、 (C)DRPVAPEG、 (C)DHPVHPDS、 (C)DMPVSPDR、 (C)DSPVPPDD、 (C) DQPVYPDI、 (C)DRPVYPDI、 (C)DHPVTPDR、 (C)EYPVYPES、 (C)DTPVLPDS、 (C)DMPVTPDT、 (C) DAPVTPDT、 (C)DSPVVPDN、 (C)DLPVTPDR、 (C)DSPVHPDT、 (C)DAPVRPDS、 (C)DMPVWPDG、 (C) DAPVYPDG 、 (C)DRPVQPDR 、 (C)YDRPVQPDR 、 (C)DMPVDPEN 、 (C)DMPVDADN 、 DQPVLPD(C) 、 DMPVLPD(C)、 (C)EMPVDPDN 以及 (C)DNPVHPE。
令人惊讶的是， 发现包括上面列举的氨基酸序列或由其组成的本发明化合物特别 适用于生产待用于治疗或预防突触核蛋白病的医药。这些肽 ( 模拟表位 ) 能够在体内诱导 形成导向包含氨基酸序列 DMPVDPDN 的人类 α- 突触核蛋白原始表位以及人类 α- 突触核 蛋白自身的抗体。然而， 所述肽 ( 模拟表位 ) 针对人类 β- 突触核蛋白不能够诱导， 或仅能 诱导非常有限的免疫反应性。 令人惊讶的是， 由原始 α- 突触核蛋白诱导抗体 ( 包含氨基酸 序列 DMPVDPDN) 特异性的结合于 α- 突触核蛋白以及 β- 突触核蛋白。因此， 所述肽 ( 模 拟表位 ) 与所述原始肽相较， 诱导更加精确 (refined) 的免疫应答 ( 抗体 )。然而， 模拟表 位诱导的免疫应答并不一定区分 α- 突触核蛋白 (synuclein) 和 β- 突触核蛋白。在个体 中， 肽诱导的抗体负责去除 α- 突触核蛋白 ( 其涉及 α- 突触核蛋白聚集物， Lewy 体的形 成 )， 和 / 或 α- 突触核蛋白聚集物 (Lewy 体 ) 的解离。 上面列举的肽可在其 N- 末端包含或不包含半胱氨酸残基， 当然所述 C- 残基亦可 添加至 C- 末端。 因此， 本发明涵盖下列其 N- 末端或 C- 末端无半胱氨酸残基的肽 ： DQPVLPD、 DMPVLPD、 DSPVLPD、 DSPVWAE、 DTPVLAE、 DQPVLPDN、 DMPVLPDN、 DSPVLPDN、 DQPVTAEN、 DSPVWAEN、 DTPVLAEN 、 HDRPVTPD 、 DRPVTPD 、 DVPVLPD 、 DTPVYPD 、 DTPVIPD 、 HDRPVTPDN 、 DRPVTPDN 、 DNPVHPEN、 DVPVLPDN、 DTPVYPDN、 DTPVIPDN、 DQPVLPDG、 DMPVLPDG、 DSPVLPDG、 DSPVWAEG、 DRPVAPEG、 DHPVHPDS、 DMPVSPDR、 DSPVPPDD、 DQPVYPDI、 DRPVYPDI、 DHPVTPDR、 EYPVYPES、 DTPVLPDS、 DMPVTPDT、 DAPVTPDT、 DSPVVPDN、 DLPVTPDR、 DSPVHPDT、 DAPVRPDS、 DMPVWPDG、 DAPVYPDG、 DRPVQPDR、 YDRPVQPDR、 DMPVDPEN、 DMPVDADN、 EMPVDPDN 以及 DNPVHPE。
本发明的化合物可用于制备医药， 特别是疫苗， 其可用于治疗 α- 突触核蛋白 病， 藉此， 所述医药特别适于治疗选自下组的突触核蛋白病 ： 帕金森氏症 (PD)、 Lewy 体病 (LBD)、 弥散性 Lewy 体病 (DLBD)、 痴呆伴 Lewy 体病 (DLB)、 帕金森氏综合症伴痴呆 (PDD)、 多 系统萎缩 (MSA) 和神经退行性变伴脑铁积聚类型 I(NBIA Type I)。
根据本发明的优选实施方案， 所述化合物与药学上可接受的载体， 优选 KLH( 钥 孔戚血蓝素 (Keyhole Limpet Hemocyanin))、 破伤风毒素、 白蛋白结合蛋白、 牛血清白蛋 白、 树状体 (dendrimer)(MAP ； Biol.Chem.358 ： 581)、 肽接头 ( 或其两端区域 ) 以及 Singh 等， Nat.Biotech.17(1999)， 1075-1081( 特别是该文件中表 1 所描述的 ) 和 O′ Hagan 等， Nature Reviews， Drug Discovery 2(9)(2003)， 727-735( 特别是其中所描述的内源免疫增 强化合物和递送系统 ) 所描述的佐剂物质以及其他， 或上述混合物相偶联。在此背景下的 结合化学反应 (conjugation chemistry)( 例如， 通过异型双功能 (heterobifunctional) 化合物， 如 GMBS， 当然亦包括其他描述于 “Bioconjugate Techniques” ， Greg T.Hermanson 中的 ) 可选自本领域技术人员已知的反应。另外， 疫苗合剂 (vaccinecomposition) 可 用佐剂， 优选低溶解度铝成分来进行配制。当然， 佐剂如 MF59 磷酸铝、 磷酸钙、 细胞因子 ( 例如， IL-2、 IL-12、 GM-CSF)、 皂苷 ( 例如， QS21)、 MDP 衍生物、 CpG 寡聚物、 IC31、 LPS、 MPL、 聚 磷 杂 烯 (polyphosphazene)、 乳 化 剂 ( 例 如， Freund’ s、 SAF)、 脂 质 体、 病毒颗粒
(virosome)、 免疫刺激复合物 (iscoms)、 蜗形物 (cochleate)、 PLG 微颗粒、 泊洛沙姆颗粒 (poloxamerparticle)、 类病毒颗粒、 热不稳定性肠毒素 (LT)、 伤寒毒素 (CT)、 变异体毒素 ( 例如， LTK63 和 LTR72)、 微颗粒和 / 或多聚化脂质体亦可使用。
本发明的化合物优选通过接头结合于所述载体或佐剂， 所述接头选自下组 ： NHS- 聚环氧乙烷 (PEO)( 例如 NHS-PEO4- 马来酰亚胺 )。
包含本发明化合物 ( 模拟表位 ) 的疫苗和所述药学上可接受的载体可通过任何合 适方法的使用法， 例如、 i.d.、 i.v.、 i.p.、 i.m.、 鼻内、 经口、 皮下等等， 并在任何合适的递送 装置进行给药 (O′ Hagan 等， Nature Reviews， DrugDiscovery 2(9)， (2003)， 727-735)。 本发明的化合物优选配制为供静脉内、 皮下、 皮内或肌肉内给药 ( 参见， 例如 “Handbook of Pharmaceutical ManufacturingFormulations” ， Sarfaraz Niazi， CRC Press Inc， 2004)。
一 般 而 言， 所 述 疫 苗 含 有 自 0.1ng 到 10mg， 优 选 10ng 到 1mg， 特 别 是 100ng 到 100μg， 或者， 例如 100fmol 到 10μmol， 优选 10pmol 到 1μmol， 特别是 100pmol 到 100nmol 的本发明的化合物。一般而言， 所述疫苗亦含有辅助性的物质， 例如缓冲液， 稳定剂等等。
本发明的另一个方面涉及具有选自下组氨基酸序列的肽 ： (C)DQPVLPD、 (C) DMPVLPD、 (C)DSPVLPD、 (C)DSPVWAE、 (C)DTPVLAE、 (C)DQPVLPDN、 (C)DMPVLPDN、 (C)DSPVLPDN、 (C)DQPVTAEN、 (C)DSPVWAEN、 (C)DTPVLAEN、 (C)HDRPVTPD、 (C)DRPVTPD、 (C)DVPVLPD、 (C) DTPVYPD、 (C)DTPVIPD、 (C)HDRPVTPDN、 (C)DRPVTPDN、 (C)DNPVHPEN、 (C)DVPVLPDN、 (C) DTPVYPDN、 (C)DTPVIPDN、 (C)DQPVLPDG、 (C)DMPVLPDG、 (C)DSPVLPDG、 (C)DSPVWAEG、 (C) DRPVAPEG、 (C)DHPVHPDS、 (C)DMPVSPDR、 (C)DSPVPPDD、 (C)DQPVYPDI、 (C)DRPVYPDI、 (C) DHPVTPDR、 (C)EYPVYPES、 (C)DTPVLPDS、 (C)DMPVTPDT、 (C)DAPVTPDT、 (C)DSPVVPDN、 (C) DLPVTPDR、 (C)DSPVHPDT、 (C)DAPVRPDS、 (C)DMPVWPDG、 (C)D APVYPDG、 (C)DRPVQPDR、 (C) YDRPVQPDR、 (C)DMPVDPEN、 (C)DMPVDADN、 DQPVLPD(C)、 DMPVLPD(C)、 (C)EMPVDPDN 以及 (C) DNPVHPE。
根据本发明的优选实施方案， 所述肽与药学上可接受的载体， 优选 KLH( 钥孔戚血 蓝素 ) 偶联。
本发明的另一个方面涉及药学配制剂， 优选疫苗， 包括至少一个本发明的肽， 且选 自下组 ： (C)DQPVLPD、 (C)DMPVLPD、 (C)DSPVLPD、 (C)DSPVWAE、 (C)DTPVLAE、 (C)DQPVLPDN、 (C)DMPVLPDN、 (C)DSPVLPDN、 (C)DQPVTAEN、 (C)DSPVWAEN、 (C)DTPVLAEN、 (C)HDRPVTPD、 (C)DRPVTPD、 (C)DVPVLPD、 (C)DTPVYPD、 (C)DTPVIPD、 (C)HDRPVTPDN、 (C)DRPVTPDN、 (C) DNPVHPEN、 (C)DVPVLPDN、 (C)DTPVYPDN、 (C)DTPVIPDN、 (C)DQPVLPDG、 (C)DMPVLPDG、 (C) DSPVLPDG、 (C)DSPVWAEG、 (C)DRPVAPEG、 (C)DHPVHPDS、 (C)DMPVSPDR、 (C)DSPVPPDD、 (C) DQPVYPDI、 (C)DRPVYPDI、 (C)DHPVTPDR、 (C)EYPVYPES、 (C)DTPVLPDS、 (C)DMPVTPDT、 (C) DAPVTPDT、 (C)DSPVVPDN、 (C)DLPVTPDR、 (C)DSPVHPDT、 (C)DAPVRPDS、 (C)DMPVWPDG、 (C) DAPVYPDG 、 (C)DRPVQPDR 、 (C)YDRPVQPDR 、 (C)DMPVDPEN 、 (C)DMPVDADN 、 DQPVLPD(C) 、 DMPVLPD(C)、 (C)EMPVDPDN 和 (C)DNPVHP E。
本发明的医药配制剂， 其可作为供， 例如， 皮下、 静脉内和 / 或肌肉内给药的疫苗 进行配制， 可用于治疗任何类型的突触核蛋白。
本发明进一步在下述附图和实施例中加以说明， 但并不仅限于此。
图 1 显示通过 ELISA 使用对人类 α- 突触核蛋白 115-122 位具有特异性的单克隆抗体检测 α- 突触核蛋白的特异性表位。
肽 p4446(α- 突触核蛋白 )、 p4449 和 p4448( 人类表位 ) 由所述抗体检测。 阴性对 照肽 p4447(β- 突触核蛋白 ) 和 p4450、 p4451( 小鼠表位 ) 未检测出来。不相干的肽 p1252 在所述 ELISA 分析法中不显示结合。数据以线性尺度表示。
图 2 显示通过 ELISA 使用对人类 α- 突触核蛋白 115-122 位具有特异性的单克隆 抗体检测模拟表位。 显示了两个模拟表位 (p4553， p4557) 的数据。 肽 p4557 与原始肽 p4448 相较， 显示较弱的结合。肽 p4553 对检测抗体显示强结合。不相干的肽 p1253 并未在 ELISA 分析法中根据预测显示任何结合。当接种小鼠时， 两个模拟表位均诱导＞ 1/20000 的效价， 并视为强结合剂。
图 3 显示通过 ELISA 使用对人类 α- 突触核蛋白 115-122 位具有特异性的单克隆 抗体检测检测模拟表位的竞争作用。描述的值是通过 ELISA 使用 40μg 肽在抑制分析法中 测定的。 与原始肽 p4448 相较， 不相干的肽 p1253 和模拟表位 p4492 并不显示竞争作用。 模 拟表位 p4490 和 p4491 显示与原始肽 p4448 相似的竞争作用。竞争作用通过在 ELISA 中与 原始表位比较在 40μg 肽浓度下的 OD 来进行计算。将所有的模拟表位与该参照比较得到 竞争指数 (competition index)。1 左右的指表明高抑制能力。具有 5 以上的竞争指数的 肽评价为非竞争性的。 图 4 显示针对注射入的肽和不相关肽的免疫应答。
A) 在四次接种后经免疫化的小鼠血清针对其注射入的肽 ( 原始表位 (p4448) 和 模 拟 表 位 ( 分 别 为 p4456、 p4466 和 p4467)) 显 示 高 效 价。 用 ELISA 测 定 的 效 价 为 1 ∶ 10000(1 ∶ 10.000) 左右 (OD 半最大值 )， 数据以对数尺度表示。作为 ELISA 的阳性对 照， 使用 α- 突触核蛋白特异性单克隆抗体 (CTRLpos)。
B) 免疫化的小鼠同样的血清未能检测出不相关的肽 (p1253)。用 ELISA 测定的效 价小于 1 ∶ 100(OD 半最大值 )， 低于来自针对所述不相干的肽有特异性的单克隆抗体的信 号 (CTRL pos) 超过一百倍。作为阳性对照， 不使用第一抗体 (primary antibody)。数据以 线性尺度表示。
图 5 显示在重复的模拟表位免疫化后针对突触核蛋白免疫应答。
A) 在其相应组中所有的动物汇集的血清显示针对 p4448， 一种位于 α- 突触核蛋 白 C- 末端的蛋白质的抗体效价。数据以对数尺度表示。
B) 经免疫化的小鼠 (p4448、 p4457 和 p4463) 的汇集的血清在四次接种后显示针对 α- 突触核蛋白的效价。经免疫化的小鼠 (p4466 和 p4467) 的汇集的血清未检测出 α 或 β- 突触核蛋白 ( 用 ELISA 测定的效价远小于 1 ∶ 100 的半最大值 )。经原始表位 (p4448) 免疫化的汇集的血清检测出 α 和 β- 突触核蛋白。 以 ELISA 测定的效价， 其中小于 1 ∶ 100 半最大值的用星号标出， 对应于接近背景的值。所述经测试的模拟表位中大部分诱导不与 β- 突触核蛋白交叉反应的抗体。数据以对数尺度表示。
图 6A 显示使用可市购的、 特异性检测人类 α-syn 的抗体的阳性对照染色。在 6B 中， 同样的抗体用于对非转基因小鼠脑的同一区域进行染色， 未能检测出任何 α-syn 阳 性组织， 这是因为该动物不表达人类 α-syn。在 6C 中， 与 6A 中存在的染色相似的特异性 α-syn 染色通过经模拟表位诱导的血清 (p4498 诱导血清 ) 引发 (elicit)。在鼠类丘脑中 的 α-syn 阳性染色以如示于 6A 和 6C 的斑点状染色样式为特征。箭头指示分别见于 6A 和
6C 的上述 α-syn 阳性包涵物的三个实例。 实施例 可用于本发明的模拟表位鉴定的抗体检测人类 α- 突触核蛋白衍生氨基酸序列 DMPVDPDN( ＝原始表位， SEQ ID No.1) 和全长人类 α- 突触核蛋白。 其并不识别人类 β- 突 触核蛋白。所述抗体可为单克隆或多克隆抗体制备物或其任何抗体部分或衍生物， 且特异 性的结合于人类 α- 突触核蛋白的 DMPVDPDN 表位， 亦即， 其确实结合于肽和全长蛋白质， 但 不结合于人类 β- 突触核蛋白。
所述模拟表位用上述单克隆抗体 ( 检测在人类 α- 突触核蛋白蛋白质氨基酸 115-112 内的序列 ) 和肽文库识别并进一步表征。
实施例 1 ： 产生特异性检测原始人类 α- 突触核蛋白表位 C-DMPVDPDN 和人类 α- 突触核蛋白但非人类 β- 突触核蛋白的单克隆抗体
由融合蛋白 “AFFiRiS 3” 衍生的单克隆抗体 ： Balb/c 小鼠用与 BTG( 牛甲状腺球 蛋白 ) 和 CFA( 弗氏完全佐剂， 首次注射 ) 偶联， 以及 IFA( 弗氏不完全佐剂， 三次加强注射 ) 作为佐剂的原始 α- 突触核蛋白表位 C-DMPVDPDN 免疫化。DMPVDPDN 肽特异性的产生抗体 的杂交瘤通过 ELISA(DMPVDPDN 肽覆被的 ELISA 平板 ) 检测。人类 α- 突触核蛋白 ( 重组 蛋白质 ) 用作阳性对照肽 ： 包括了识别固化于 ELISA 平板上的所述重组蛋白质的杂交瘤， 这 是因为其特异性的结合肽和全长 α- 突触核蛋白。人类 β- 突触核蛋白 ( 重组蛋白质 ) 用 作阴性对照 ： 排除了识别固化于 ELISA 平板上的两种肽的杂交瘤， 这是因为其不区分两种 不同的突触核蛋白蛋白质。
对所得杂交瘤克隆 (AFFiRiS3/9( 内部名 “A509” ； IgG1) 分析其对天然人类 α- 突 触核蛋白表位 DMPVDPDN 的特异性检测。 A509 在 ELISA 中识别注射入的表位以及全长 α- 突 触核蛋白蛋白质 ( 重组蛋白质， 自 rPeptide， Bogart， GA， USA 获得 )。然而其并不在 ELISA 中识别 β- 突触核蛋白 ( 重组蛋白质， 自 rPeptide， Bogart， GA， USA 获得 )。进一步， 所述 A509 抗体并不检测编码 α- 突触核蛋白小鼠变体的肽。同样的结果可用可市购的 mAB 克 隆 ( 亦即， α- 突触核蛋白 (LB509) 单克隆抗体， 目录号 SIG-39725 ； Covance(Princton， NJ， USA)) 获取。
实施例 2 ： 噬菌体呈递， 体外结合和抑制性 ELISA
用于该实施例的噬菌体呈递文库为 ： Ph.D.7 ： New England BioLabsE8102L( 线性 七聚体文库 )and Ph.D.12 ： New England BioLabs E8111L( 线性十二聚体文库 )。噬菌体 呈递根据生产商的实验规程完成 (www.neb.com)。
在 2 到 3 后续轮次的淘洗 (panning) 后， 挑取单独的噬菌体克隆， 并对噬菌体上清 在覆被以用于淘洗过程的抗体的平板上进行 ELISA。对在该 ELISA 中为阳性的噬菌体克隆 ( 对靶有强信号， 但对非特异性的对照无信号 ) 进行测序。通过 DNA 序列推导出肽序列。合 成这些肽， 并用结合和抑制性 ELISA 对其进行表征。 对一些肽， 在其 C- 末端附加额外的 AA。 此外， 一些新颖的模拟表位通过合并来自在所述筛选中识别的模拟表位的序列信息进行构 建。两个含有新设计出的模拟表位的组均用于支持对模拟表位疫苗共有序列的识别。
1. 体外结合分析法 (ELISA)
将自噬菌体呈递衍生的肽以及其在 C- 末端延长的变体与 BSA 并结合于 ELISA 平
板 (1μM ； 如相应的附图所示 ) 并随后与供对识别出的肽的结合能力进行分析的筛选过程 中使用的单克隆抗体一起温育。
2. 体外抑制性分析法 (ELISA)
将自噬菌体呈递衍生的不同量的肽 ( 浓度范围从 40μg 到 0.3μg( 系列稀释 ) 如 相应的附图所示 ) 与用于所述筛选过程的单克隆抗体一起温育。减弱所述抗体对覆被于 ELISA 平板上的所述原始的人类 α- 突触核蛋白表位 ( 人类 α- 突触核蛋白蛋白质的氨基 酸 115-122) 后续结合的肽在该分析法中视为抑制性的。
实施例 3 ： 模拟表位的体内测试 ： 对免疫原性和交叉反应性的分析
1. 模拟表位的体内测试
将抑制性以及非抑制性肽与 KLH 偶联并与合适的佐剂 ( 氢氧化铝 ) 一起注射入小 鼠 ( 野生型 C57/B16 小鼠 ； 皮下注射入胁腹部 (flank))。对动物以两周的间隔进行 4-6 次 接种， 并同样每两周取一次血清。对每份血清确定其针对注射入的肽以及不相关的肽的效 价。自血清 3 起分别确定针对重组人类 α- 突触核蛋白蛋白质和重组人类 β- 突触核蛋白 的效价。针对原始人类 α- 突触核蛋白表位 (aa115-122) 对汇集的血清进行测试。一般而 言， 血清通过针对与其牛血清白蛋白 (BSA) 偶联的肽和固化于 ELISA 平板的重组全长蛋白 质之间的反应进行分析。效价通过使用抗小鼠 IgG 特异性抗体加以确定。详细结果参见图 4 和 5。
2. 模拟表位的原位测试
亦对选定的引发 α-syn 交叉反应性的血清分析其在小鼠脑切片中原位检测人类 α-syn 的能力。详细结果参见图 6。
3. 结果
3.1 识别 α- 突触核蛋白特异性 mAB ：
图 1 描绘了对自融合蛋白 AFFiRiS 3 衍生的 α- 突触核蛋白特异性单克隆抗体 AFFiRiS3/9( 内部名 “A509” ； IgG1) 的识别。
3.2.1 噬菌体呈递文库 Ph.D.7 和 12
3.2.1.1 用针对 DMPVDPDN 的单克隆抗体进行筛选
在该筛选中通过筛选 PhD7 和 PhD12 噬菌体呈递文库识别出 51 个序列 ： 表 1 总结 了识别出的肽及其与所述原始表位相比较的结合能力 ：
图1： 结合于亲本抗体的 α- 突触核蛋白模拟表位 ：
肽的内部编号 p4456 p4457 p4458 p4460SEQ ID No. 2 3 4 5序列 CDQPVLPD CDMPVLPD CDSPVLPD CDSPVWAE结合能力 3 3 3 114CN 101969989 A说6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28明书CDTPVLAE CDQPVLPDN CDMPVLPDN CDSPVLPDN CDQPVTAEN CDSPVWAEN CDTPVLAEN CHDRPVTPD CDRPVTPD CDNPVHPE CDVPVLPD CDTPVYPD CDTPVIPD CHDRPVTPDN CDRPVTPDN CDNPVHPEN CDVPVLPDN CDTPVYPDN CDTPVIPDN CDQPVLPDG CDMPVLPDG CDSPVLPDG CDSPVWAEG 1 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 312/17 页p4461 p4462 p4463 p4464 p4465 p4466 p4467 p4484 p4485 P4486 p4487 p4488 p4489 p4490 p4491 p4492 p4493 p4494 p4495 p4496 p4497 p4498 p449915CN 101969989 A说29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51明书CDRPVAPEG CDHPVHPDS CDMPVSPDR CDSPVPPDD CDQPVYPDI CDRPVYPDI CDHPVTPDR CEYPVYPES CDTPVLPDS CDMPVTPDT CDAPVTPDT CDSPVVPDN CDLPVTPDR CDSPVHPDT CDAPVRPDS CDMPVWPDG CDAPVYPDG CDRPVQPDR CYDRPVQPDR CDMPVDPEN CDMPVDADN DQPVLPDC DMPVLPDC 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 313/17 页p4553 p4554 p4555 p4556 p4557 p4558 p4559 p4560 p4561 p4562 p4563 p4564 p4566 p4567 p4568 p4569 p4570 p4571 p4572 p4635 p4636 p4640 p464116CN 101969989 A说52明书CEMPVDPDN 314/17 页P4648
表 1 的图例 ： 结合能力的编码通过下述结合编码进行 ： 1： X 描述亲本 AB 的稀释因子。
结合编码 0 1 2 3
OD 半最大值 1 ： X 无结合 弱结合 中等结合 如原始表位的结合 ( 强结合 ) ： 0 ： ＜ 5000 ： 5000-20000 ： 20000-1280003.3 在用针对 α- 突触核蛋白的单克隆抗体筛选噬菌体呈递文库中识别出的模拟 表位的体外表征
图 2 和 3 显示了用于体外表征模拟表位的结合和抑制性分析法的代表性实例。获 得的数据分别在表 1 和表 2 中总结。
在列举的 51 个序列中， 29 个序列在体外竞争性实验中抑制 α- 突触核蛋白特异性 单克隆抗体的结合 ； 另外识别出 22 个不在体外竞争性实验中抑制单克隆抗体结合， 但仍旧 保留针对亲本抗体结合能力的序列。
表2： 在本发明中识别的在抑制性分析法中给出阳性结果的 α- 突触核蛋白表位
表 2 的图例 ： 抑制能力的编码通过下述编码进行 ：
弱抑制指与原始表位相比较需要更多肽来降低 AB 结合 ； 强抑制指对于模拟表位 和原始表位需要相同量的肽来降低 AB 结合。将模拟表位与作为标准的所述原始肽相比较。 在所述分析法中使用 40μg 的 OD 用于计算与原始多肽相比较的竞争能力。
竞争编码 0 1 2
无抑制 (40μg 肽的 OD 高于原始肽的 5 倍 ) 较原始表位弱 (40μg 肽的 OD 低于原始肽的 5 倍 ) 强抑制 ( 如原始表位 ； 40μg 肽的 OD 低于原始肽的 2 倍 )表3： 非模拟表位的肽和蛋白质3.4. 在用针对 α- 突触核蛋白的单克隆抗体进行的噬菌体呈递文库筛选中识别 出的模拟表位的体内表征
对每组 5-6 只雌性 C57/B16 小鼠皮下用 30μg 与 KLH 偶联的肽进行免疫化。对对 照组施用 p4448-KLH 偶联物。使用明矾作为佐剂 ( 总是每个小鼠 1mg)。施用的肽均能够 结合于与人类 α- 突触核蛋白的 aa115-122 特异性结合的单克隆抗体， 尽管一些肽并不抑 制原始表位在体外对其亲本抗体的结合 ( 通过体外抑制性分析法 )。确定抗体效价的体外 ELISA 分析法用单独小鼠的血清或汇集的血清 ( 参见图 5) 在每次接种后以两周的间隔进行 ( 分别参见图 4 和图 5)。ELISA 平板的孔用模拟表位 -BSA 偶联物和不相关的肽 -BSA 偶联 物 ( 阴性对照 ) 覆被。阳性对照通过用亲本抗体与相应的模拟表位 -BSA 聚合物反应来进 行。检测用抗小鼠 IgG 进行。此外， 重组蛋白质固化于 ELISA 平板上， 并用血清相应的进行 反应。
对于所有在 C57/B16 小鼠中测试的模拟表位， 针对单独注射入的肽反应的抗体可 在反复接种后检测出来。此外， 在 4 个描绘的模拟表位中的 2 个 ( 分别参见图 5 和表 1) 发 展出与人类 α- 突触核蛋白但非人类 β- 突触核蛋白反应的抗体。2/4 不显示与重组蛋白 质的交叉反应性。重要的是， 原始表位 DMPVDPDN 导致不区分两种重组突触核蛋白蛋白质的 免疫应答。
图 4 和 5 显示用于体内表征模拟表位的分析法的代表性实例。图 4 通过分析针对 注射入的肽和含有不相关序列的不相关的肽的免疫应答来显示体内表征由模拟表位接种
引发的免疫应答的实例。 原始表位 p4448， 即阳性对照肽， 和模拟表位 p4456、 p4466 和 p4467 引发针对注射入的肽 ( 其自身 ) 的免疫应答， 但无法诱导针对不相关序列 (p1253) 的非特 异性免疫应答。
图 5 显示体内表征由模拟表位接种引发针对全长 α- 突触核蛋白和 β- 突触核蛋 白的免疫应答的实例。所有在该实例中测试的疫苗针对原始 α- 突触核蛋白表位 115-122 导致可检测出的免疫应答。几乎所有在该实例中测试的模拟表位和所述原始表位 ( 例外 ： p4466 和 p4467) 还进一步显示与全长 α- 突触核蛋白的反应性。然而， 原始表位诱导的免 疫应答还检测全长 β- 突触核蛋白， 从而减弱了针对 α- 突触核蛋白的特异性以及区分两 种蛋白质的能力。 与该发现相反， 大部分 ( 但并非所有的 ) 模拟表位诱导的血清无法检测出 β- 突触核蛋白， 从而保留了区分两种突触核蛋白蛋白质的能力， 并保证活性免疫化程序针 对 α- 突触核蛋白的高特异性， 以获取效率和优异的安全性模式 (profile)。
3.5. 模拟表位的原位测试
引发 α-syn 特异性免疫应答的模拟表位亦可在转基因小鼠脑组织中检测出 α-syn 免疫反应性包涵物。如图 6 所描绘， 来自经模拟表位接种的动物的血清能够对来 自过表达人类 α-syn 的小鼠的脑切片中存在的 α-syn 阳性结构进行染色。简言之， 对 人类 α-syn 在 ELISA 中具有阳性反应性的血清已用于免疫组织化学 (IHC)。对加载于 Superfrost Plus 玻璃载玻片上经石蜡包埋的小鼠脑的 7μM 切片进行 IHC。切片与血清 ( 在 PBS 中 1 ∶ 100 和 1 ∶ 400 稀释 ) 一起温育， 并随后根据免疫组织化学的标准试验规程 使用 VECTASTAIN ABC 系统进行染色， 使用 DAB 和 MOM 封闭 ( 所有的反应使用分别自 Vector 实验室获取的可市购的的试剂并根据生产商的实验设计来进行 )。 复染色使用苏木精进行。 载玻片加载于 Entellan 并随后使用常规亮视野显微镜进行归档。对人类 α-syn 具有特异 性的单克隆抗体 (LB509， Covance) 以 1/250 的最终稀释用作突触核蛋白检测的阳性对照。
本发明涉及一种待用于预防和 / 或治疗突触核蛋白病 (synucleinopathy) 的医药。 突触核蛋白病是一组具有下述共同病理学特征的不同神经退行性变疾病 ： 在神经 病理学检查中可检测出含有异常 α- 突出核蛋白 (α-syn) 蛋白质聚集于选定种群的神经 元和神经胶质细胞中的特征性损伤。 α-syn( 起初鉴别为 PARK1 和 PARK4) 是广泛表达于新 皮质、 海马、 齿状回、 嗅球、 纹状体、 丘脑和小脑的 140 个氨基酸的蛋白质。α-syn 还在造血 细胞， 包括 B-、 T- 和 NK 细胞， 以及单核细胞和血小板中高表达。其在这些细胞中确切的作 用尚为未知， 但已发现其涉及巨核细胞 ( 血小板的前体 ) 的分化。
最常见的突触核蛋白病包括但不仅限于 Lewy 体病 (Lewy body disorder， LBD)， 如 帕金森氏病 (PD)， 帕金森氏病伴痴呆 (PDD)， 痴呆伴 Lewy 体， 以及多系统萎缩 (MSA) 或神经 退行性变伴脑铁聚集 I 型 (Brain Iron AccumulationType I， NBIA Type 1)。对这些疾病 的现行治疗手段包括针对症状的药物， 如 L- 多巴、 抗胆碱能药以及单胺氧化酶抑制剂。然 而， 所有现行的治疗手段仅仅导致症状缓解， 而无法在患者中诱导长期持续的疾病减轻作 用。
最常见的突触核蛋白病包括但不仅限于 Lewy 体病 (Lewy body disorder， LBD)， 如 帕金森氏病 (PD)， 帕金森氏病伴痴呆 (PDD)， 痴呆伴 Lewy 体， 以及多系统萎缩 (MSA) 或神经 退行性变伴脑铁聚集 I 型 (Brain Iron AccumulationType I， NBIA Type 1)。对这些疾病 的现行治疗手段包括针对症状的药物， 如 L- 多巴、 抗胆碱能药以及单胺氧化酶抑制剂。然 而， 所有现行的治疗手段仅仅导致症状缓解， 而无法在患者中诱导长期持续的疾病减轻作 用。
Lewy 体病是以震颤、 强直、 运动徐缓 (bradykinesia) 和脑中多巴胺能神经元的丧 失为特征的进行性的神经退行性变疾病。 在 DLB 和 PDD 的情况下， 症状还包括认知缺损。 在 西方国家高于 60 岁年龄的人群中高至 2％发展出 PD/LPD 的典型症状。目前， 仅有针对症 状的治疗方法。 不幸的是， 这些疗法仅仅提供对早期症状的暂时缓解， 而无法停止疾病的进 行。
PD/LBD 的发病机理仍然未完全理解， 但看来该疾病的发展牵涉到遗传易感性和环 境因素。虽有遗传学方面的所有进展， PD/LBD 仍主要是未知原因的散发病症 ( 亦称为自发 性 PD/LPD)。罹患该疾病的患者在脑的皮质和皮质下区域内发展出称为 Lewy 体 (LB) 的特 征性的泛素化 (ubiquitinated) 胞内包涵物 (inclusion)。特别是在具有高多巴胺能神经 元或神经投射 (neuronalprojection) 的区域显示这种类型的病理学特征。
近来， 数个研究显示突触蛋白 α-syn 在 LBD 发病中起中心作用。 在 LBD 中， α-syn 在遍及受影响的脑区域中的 LB 中积聚。此外， 可以表明 α-syn 中的单个点突变 (single point mutation) 以及双倍或多倍增殖 (duplication ormultiplication) 与罕见的家 族型帕金森氏综合症相关。重要的是， 基于来自转基因 (tg) 小鼠以及果蝇 (Drosophila melanogaster) 的过表达研究的结果， 理解了其在 PD/LBD 发病中关键作用， 这是由于这些 动物模型模拟了 PD 的数种特征。
另一种非常重要的突触核蛋白病是多系统萎缩 (MSA)。MSA 是以耐 L-DOPA 帕金 森氏综合症、 小脑性共济失调和家族性自主神经异常症状为特征的自发的神经退行性变疾 病。 患者遭受影响不同脑区域， 包括纹状体、 黑质、 小脑、 脑桥以及下橄榄体和脊髓的多系统 神经元丧失 (neuronal loss) 的痛苦。MSA 以遍及中央神经系统的 α-syn- 阳性的神经胶 质细胞质包涵物 (glialcytoplasmic inclusion， GCI) 和罕见的神经元包涵物 (neuronal
PD/LBD 的发病机理仍然未完全理解， 但看来该疾病的发展牵涉到遗传易感性和环 境因素。虽有遗传学方面的所有进展， PD/LBD 仍主要是未知原因的散发病症 ( 亦称为自发 性 PD/LPD)。罹患该疾病的患者在脑的皮质和皮质下区域内发展出称为 Lewy 体 (LB) 的特 征性的泛素化 (ubiquitinated) 胞内包涵物 (inclusion)。特别是在具有高多巴胺能神经 元或神经投射 (neuronalprojection) 的区域显示这种类型的病理学特征。
近来， 数个研究显示突触蛋白 α-syn 在 LBD 发病中起中心作用。 在 LBD 中， α-syn 在遍及受影响的脑区域中的 LB 中积聚。此外， 可以表明 α-syn 中的单个点突变 (single point mutation) 以及双倍或多倍增殖 (duplication ormultiplication) 与罕见的家 族型帕金森氏综合症相关。重要的是， 基于来自转基因 (tg) 小鼠以及果蝇 (Drosophila melanogaster) 的过表达研究的结果， 理解了其在 PD/LBD 发病中关键作用， 这是由于这些 动物模型模拟了 PD 的数种特征。
另一种非常重要的突触核蛋白病是多系统萎缩 (MSA)。MSA 是以耐 L-DOPA 帕金 森氏综合症、 小脑性共济失调和家族性自主神经异常症状为特征的自发的神经退行性变疾 病。 患者遭受影响不同脑区域， 包括纹状体、 黑质、 小脑、 脑桥以及下橄榄体和脊髓的多系统 神经元丧失 (neuronal loss) 的痛苦。MSA 以遍及中央神经系统的 α-syn- 阳性的神经胶 质细胞质包涵物 (glialcytoplasmic inclusion， GCI) 和罕见的神经元包涵物 (neuronal
inclusion) 为特征。这些包涵物与纹状体黑质变性 (striatonigral degeneration)、 橄榄 体脑桥小脑萎缩相关， 并涉及延髓和脊髓中的自主神经核。 GCI 对于 MSA 发病的重要性已被 广泛接受， 并因近来对分析在少突胶质细胞中 α-syn 过表达的作用的转基因小鼠模型的 分析而格外显得重要。在过表达人类 α-syn 的 tg 小鼠中， 观察到了似 GCI 聚集物和 MSA 的生物化学标记。
尽管 α-syn 积聚导致在突触核蛋白病中神经退行性变典型特征以及突触核蛋白 病的特征性症状的准确机理尚未完全理解， 最近的研究暗示 α-syn 寡聚物的异常形成和 积聚涉及突触核蛋白病中根本的退行性变过程。 现在相信上述的寡聚物形成， 例如， 在突出 末端和轴突中的， 在 PD/LBD 发展中起重要作用。因此减少 α-syn 的沉积和寡聚化应对于 治疗突触核蛋白病， 特别是自发性的 LBD/PD 和 MSA 是有利的， 并且可以首次提供除仅仅减 轻症状的现行治疗策略， 如施用 L-DOPA 外的治疗这些神经退行性变疾病的策略。
在 Iwatsubo T.(Neuropathology 27(5)(2007) ： 474-478) 中， 检查了 α- 突触核 蛋白以及其磷酸化与 α- 突触核蛋白病的发病的关联。该出版物的作者发现沉积于突触核 蛋白病病变中的 α- 突触核蛋白的丝氨酸 129 广泛的被磷酸化。
US 2007/213253 涉及突变的人类 α- 突触核蛋白， 以及自其衍生， 可用于抑制野 生型人类 α- 突触核蛋白聚集的肽。
在 WO 2004/041067 中， 公开了供预防或治疗与 α- 突触核蛋白聚集相关疾病的手 段和方法， 包括使用 α- 突触核蛋白片段。
在 US 2003/166558 中， 描述了可用于诱导针对蛋白质沉积物免疫应答的肽。
US 2005/198694 涉及包括至少 100 个氨基酸并具有 C- 末端 1 到 23 个氨基酸缺失 的 α- 突触核蛋白片段。
尽管使用神经营养因子和移植多巴胺能细胞的实验性疗法产生让人觉得有前途 的结果， 仍需要设计用来减少 α-syn 神经元积聚的替代手段。
近来， 主动和被动免疫疗法作为针对神经退行性变疾病， 如阿尔茨海默氏症 (AD)， 朊疾病 (Prion Disease) 以及亨廷顿舞蹈症 (Chorea Huntington) 和淀粉状蛋白侧索硬化 (amyloid lateral sclerosis， ALS) 的潜在的新治疗策略逐渐引人注目。举例而言， 最近 的对 AD 的 tg 模型的研究显示， 针对 β- 淀粉状蛋白 1-42(Aβ) 的抗体促进淀粉状蛋白自 脑中去除， 导致认知能力的改善。重要的是， Aβ 分子主要位于胞外， 因此构成免疫系统可 接近的表位。与上述免疫疗法的 “经典” 靶相对， 进行实验衡量减少胞内病源分子积聚的潜 在免疫疗法。已显示靶向朊蛋白和亨廷顿蛋白 (huntingtin) 的免疫接种手段在 tg 小鼠的 神经元中对减少上述两种类似 α-syn 在胞内积聚的分子是有效的。此外， 最近的实验还描 述了抗 -Tau 和抗 SOD1 疗法分别作为在 AD 和 ALS 中针对胞内病原性蛋白质聚集物的新颖 治疗策略。因此， 已积累了具有说服力的证据证明脑细胞中的胞内聚集可作为免疫疗法的 靶。事实上， 近来显示了相似的治疗突触核蛋白病的潜力。过表达人类 α-syn 的 tg 小鼠 经人类 α-syn 蛋白质接种。在接种后产生高相对亲和力的小鼠中， 在神经元细胞体和突触 中聚集的 α-syn 积聚减少， 其与神经退行性变减少相关。进一步， 由经免疫化的动物产生 的抗体亦检测到了以异常聚集形式存在与神经元膜相关的 α-syn， 并促进这些聚集物的降 解， 可能是通过溶酶体途径。使用以外源施加的 α-syn 特异性抗体的被动免疫疗法观察到 相似的作用。这些结果表明接种对减少 α-syn 聚集物的神经元积聚是有效的， 且对该方法的进一步发展可对治疗 LBD 和突触核蛋白病产生有益作用。
本发明的目标是提供基于育苗预防和治疗突触核蛋白病的药物。
因此本发明涉及使用至少一种包含下述氨基酸序列的化合物 ：
(X1)nX2X3PVX4X5X6(X7)m ( 式 1)，
其中
X1 是任何氨基酸残基，
X2 是选自下组的氨基酸残基 ： 天冬氨酸 (D) 和谷氨酸 (E)，
X3 是任何氨基酸残基，
X4 是任何氨基酸残基，
X5 是选自下组的氨基酸残基 ： 脯氨酸 (P) 和丙氨酸 (A)，
X6 是选自下组的氨基酸残基 ： 天冬氨酸 (D) 和谷氨酸 (E)，
X7 是任何氨基酸残基，
n 和 m， 彼此独立， 是 0 或大于 0 的整数，
且其中式 I 的氨基酸序列并不包括 α- 突触核蛋白具有氨基酸序列 DMPVDPDN 的 8 聚体多肽片段， 且并不与其等同， 所述化合物具有对针对包含氨基酸序列 DMPVDPDN 的 α- 突触核蛋白表位具有特异性的抗体的结合能力， 以供产生供预防和 / 或治疗突触核蛋 白病的药物。 本发明的化合物能够诱导在体内产生导向 ( 结合 )α- 突触核蛋白， 特别是包含氨 基酸序列 DMPVDPDN 的 α- 突触核蛋白表位的抗体 ( 亦包括含所述氨基酸序列的 α- 突触 核蛋白片段 )。然而， 导向 ( 结合 ) 所述表位的抗体， 与针对 α- 突触核蛋白相比较， 针对 β- 突触核蛋白不显示或仅显示显著较低的免疫反应性。与之相对， 由用含 DMPVDPDN 的原 始 α- 突触核蛋白表位的免疫化诱导的抗体令人惊讶的结合于 α- 突触核蛋白和 β- 突触 核蛋白两者。因此， 与原始 α- 突触核蛋白或其片段不同， 本发明的化合物提供了针对所述 与疾病相关分子的特异性， 并避免了与和疾病不相关的 β- 突触核蛋白的交叉反应性。这 就效率和安全性而言显示了强烈的优越性， 尤其是后者， 因为已有对 β- 突触核蛋白的神 经保护特性的描述。Hashimoto M.et al.， J Biol Chem.2004May28 ； 279(22) ： 23622-9. Hashimoto M， Neuron.2001Oct 25 ； 32(2) ： 213-23。
由施用本发明化合物诱导的 α- 突触核蛋白特异性抗体可能不仅结合于单体形 式的 α- 突触核蛋白， 还与其多聚形式结合。这使得减少在待治疗的个体体内 α- 突触核 蛋白寡聚物的量成为可能。减少 alpha- 突触核蛋白对于治疗突触核蛋白特别有益。
所述氨基酸序列 (X1)nX2X3PVX4X5X6(X7)m 视为包含氨基酸序列 DMPVDPDN 的 α- 突触 核蛋白表位的模拟表位。根据本发明， 术语 “模拟表位” 指具有对其模拟的表位具有拓扑学 等价物的构型的分子。 所述模拟表位与免疫特异性的结合于所期望抗原的抗体上同一个抗 原结合区相结合。所述模拟表位将在对其模拟的抗原具有反应性的宿主中产生免疫应答。 所述模拟表位亦可作为其模拟的表位的竞争者在涉及所述表位和结合于所述表位的抗体 的体外抑制分析法 ( 例如， ELISA 抑制分析法 ) 中起作用。然而， 本发明的模拟表位并不一 定在体外抑制分析法中阻止与其模拟的表位的结合， 或与之竞争， 尽管当其施用于哺乳动 物时， 能够诱导特异性免疫应答。
如本文所使用的术语 “表位” 指由特定抗体分子识别的抗原的免疫原区域。一般
而言， 抗原具有一个或更多表位， 每个表位能够结合识别该特定表位的抗体。
本发明的模拟表位可通过本领域众所周知的化学合成方法或者作为分离的肽， 或 者作为另一个肽或多肽的一部分人工产生。或者， 所述肽模拟表位可在产生所述肽模拟表 位的微生物中产生， 并随即将其分离， 并且， 若需要， 对其进行进一步纯化。 所述肽模拟表位 可在微生物， 如细菌、 酵母或真菌中产生， 或在重组病毒载体如腺病毒、 痘病毒、 疱疹病毒、 Simliki 森林病毒、 杆状病毒、 细菌噬菌体、 辛德比斯病毒或仙台病毒中产生。 供产生所述肽 模拟表位的合适细菌包括大肠杆菌 (E.coli)、 枯草杆菌 (B.subtilis) 或其他任何能够表 达肽， 如所述肽模拟表位的细菌。供表达所述肽模拟表位的合适的酵母类型包括酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、 粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、 假丝酵母属 (Candida)、 巴斯德毕赤氏酵母 (Pichia pastoris) 或任何其它能够表达肽的酵母。相应的 方法在本领域是众所周知的。此外， 供分离和纯化重组产生的肽的方法在本领域也是众所 周知的， 并包括， 例如， 凝胶过滤、 亲和层析、 离子交换层析等等。
为了促进所述肽模拟表位的分离， 可制备其中所述肽模拟表位在翻译中融合 ( 共 价连接 ) 于可通过亲和层析进行分离的异源多肽所得的融合多肽。通常所述的异源多肽 为 His- 标记 ( 例如， His6 ； 六个组氨酸残基 )、 GST- 标记 ( 谷胱甘肽 -S- 转移酶 ) 等等。所 述融合多肽不仅促进所述模拟表位的纯化， 还可以阻止所述模拟表位多肽在纯化过程中降 解。如果期望在纯化过程后去除所述异源多肽， 所述融合多肽可在所述肽模拟表位和所述 异源多肽间的连接处包含剪切位点。 所述剪切位点由可用对在所述位点的氨基酸序列具有 特异性的酶 ( 例如， 蛋白酶 ) 剪切的氨基酸序列组成。 本发明的模拟表位亦可在其 N- 和 / 或 C- 末端或附近修饰， 从而使得在所述位置 结合了半胱氨酸残基。在优选实施方案中， 末端位置 ( 位于所述肽的 N- 和 C- 末端 ) 的半 胱氨酸残基用于通过二硫键来环化所述肽。
本发明的模拟表位亦可用于不同的分析法和试剂盒， 特别是在免疫分析法和试剂 盒中。 因此， 特别优选所述模拟表位是另一个肽或多肽的一部分， 特别是在免疫分析法中用 作报道物的酶。上述报道酶包括， 例如， 碱性磷酸酯酶或辣根过氧化物酶。
本发明的 α- 突触核蛋白优选为其氨基酸序列在 α- 突触核蛋白或 α- 突触核 蛋白片段的氨基酸序列间变化的抗原性多肽。在此方面， 具有发明性的模拟表位可能不仅 包含一个或更多天然出现的氨基酸残基， 还包括一种或更多非天然出现的氨基酸残基 ( 亦 即， 非选自 20 个 “经典” 氨基酸 ) 的氨基酸取代， 或者其可完全由上述非天然的氨基酸组成。 另外， 诱导抗 -α- 突触核蛋白抗体的具有发明性的抗原可由 D- 或 L- 氨基酸或 DL- 氨基酸 的组合来组成， 并且视需要， 其可通过进一步修饰、 环闭合 (ring closure) 或衍生化进行改 变。合适的抗 -α- 突触核蛋白抗体诱导抗原可自可市购的肽文库提供。优选的， 这些肽为 至少 7 个氨基酸， 且优选的长度可高达 16， 优选高达 14 或 20 个氨基酸残基 ( 例如， 7或8 到 20 个， 7 或 8 到 16 个等等 )。然而， 根据本发明， 更长的肽亦可用作抗 -α- 突触核蛋白 抗体诱导抗原。进一步， 本发明的模拟表位亦可为多肽一部分并因此在其 N- 和 / 或 C- 末 端包含至少一个另外的氨基酸残基。
为了制备 α- 突触核蛋白模拟表位 ( 亦即， 抗 -α- 突触核蛋白抗体诱导抗原 )， 理所当然噬菌体文库、 肽文库亦为合适的， 例如由组合化学方法产生的或通过针对变化 最大的结构进行高通量筛选技术方法获取的 Display ： ALaboratory Manual by Carlos
F.Barbas(Editor)， et al. ； Willats WG Phagedisplay ： practicalities and prospects. Plant Mol.Biol.2002Dec. ； 50(6) ： 837-54)。
进一步， 根据本发明， 亦可使用基于核酸的抗 -α- 突触核蛋白 - 抗体诱导抗原 “适体” ( (aptamer))， 且其可使用变化最大的 ( 寡聚核苷酸 ) 文库 ( 例如， 具有 2-180 个核酸 残基的 ) 发现 ( 例如 Burgstaller 等， Curr.Opin.Drug Discov.Dev.5(5)(2002)， 690-700 ； Famulok et al.， Acc.Chem.Res.33(2000)， 591-599 ； Mayer 等， PNAS 98(2001))。在基于核 酸的抗 -α- 突触核蛋白抗体诱导抗原中， 核酸骨架可通过， 例如天然磷酸二酯化合物， 或 亦可通过磷硫酰化合物 (phosphorotioate) 或化学变化的组合 ( 例如， PNA) 来提供， 其中 根据本发明， 可主要使用 U、 T、 A、 C、 G、 H 和 mC 作为碱基。根据本发明可使用的核苷酸的 2’ 残基优选为 H、 OH、 F、 Cl、 NH2、 O- 甲基、 O- 乙基、 O- 丙基或 O- 丁基， 其中所述合适亦可经区 别修饰， 亦即， 例如用保护基团， 其通常用于寡聚核苷酸合成。因此， 基于适体的抗 -α- 突 触核蛋白抗体诱导抗原亦为本发明范围内的优选抗 -α- 突触核蛋白抗体诱导抗原。
根据本发明， 术语 “突触核蛋白病” 包括以病理性突触核蛋白聚集为特征的所有的 神经退行性变疾病。数种神经退行性变疾病包括帕金森氏症 (PD)、 Lewy 体病 (LBD)、 弥散 性 Lewy 体病 (DLBD)、 痴呆伴 Lewy 体病 (DLB)、 帕金森氏综合症伴痴呆 (PDD)、 多系统萎缩 (MSA) 和神经退行性变伴脑铁积聚类型 I(NBIA Type I) 共同归组为突触核蛋白病。 本发明的化合物不仅可用于治疗突触核蛋白病， 还可以用于在有发展突触核蛋白 病风险的个人 ( 例如， 易患， 例如因遗传原因易于发展突触核蛋白病 ) 中预防所述疾病。
本发明中公开的氨基酸残基的缩写遵循 IUPAC 的推荐 ：
氨基酸 丙氨酸 精氨酸 天冬氨酸 天冬酰胺 半胱氨酸 谷氨酸 谷氨酰胺 甘氨酸 组氨酸 异亮氨酸三字母代码 Ala Arg Asn Asp Cys Glu Gln Gly His Ile一字母代码 A R N D C E Q G H I8CN 101969989 A说亮氨酸 赖氨酸 甲硫氨酸 苯丙氨酸 脯氨酸 氨基酸 丝氨酸 苏氨酸 色氨酸 酪氨酸 缬氨酸明Leu Lys Met Phe Pro书L K M F P 一字母代码 S T W Y V6/17 页三字母代码 Ser Thr Trp Tyr Val
根据本发明的优选实施方案， X1 和 / 或 X7 是乙酰化的氨基酸残基或半胱氨酸 (C)。
根据本发明的另一个优选实施方案， X2 是谷氨酸， 且所述谷氨酸亦可经衍生化产 生焦谷氨酸。若 X2 包含叫谷氨酸， X1 是 0。
根据本发明进一步的另一个优选实施方案， X3 是选自下组的氨基酸残基 ： 谷氨酰 胺 (Q)、 丝氨酸 (S)、 苏氨酸 (T)、 精氨酸 (R)、 天冬酰胺 (N)、 缬氨酸 (V)、 组氨酸 (H)、 甲硫氨 酸 (M)、 酪氨酸 (Y)、 丙氨酸 (A) 和亮氨酸 (L)。
根据本发明的优选实施方案， X4 是选自下组的氨基酸残基 ： 谷氨酰胺 (Q)、 色氨酸 (W)、 苏氨酸 (T)、 精氨酸 (R)、 天冬氨酸 (D)、 异亮氨酸 (I)、 缬氨酸 (V)、 组氨酸 (H)、 脯氨酸 (P)、 酪氨酸 (Y)、 丙氨酸 (A)、 丝氨酸 (S) 和亮氨酸 (L)。
本发明的化合物亦可为 7 到 16 个氨基酸残基的多肽的一部分。因此 n 和 m 可彼 此独立的为选自下组的整数 ： 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 20 和 25。
本发明的化合物可由氨基酸序列 (X1)nX2X3PVX4X5X6(X7)m 组成， 其中 n 和 m 彼此独 立的为 0 或 1， 或者是包含至少 7 个氨基酸残基， 优选至少 10 个氨基酸残基， 较优选至少 15 个氨基酸残基和 / 或最多 50 个氨基酸残基， 有序最多 30 个氨基酸残基， 较优选为 16 个氨 基酸残基的多肽的一部分。
根据本发明的优选实施方案， 所述化合物包含具有选自下组的氨基酸序列的 肽： (C)DQPVLPD 、 (C)DMPVLPD 、 (C)DSPVLPD 、 (C)DSPVWAE 、 (C)DTPVLAE 、 (C)DQPVLPDN 、 (C)DMPVLPDN、 (C)DSPVLPDN、 (C)DQPVTAEN、 (C)DSPVWAEN、 (C)DTPVLAEN、 (C)HDRPVTPD、 (C)DRPVTPD、 (C)DVPVLPD、 (C)DTPVYPD、 (C)DTPVIPD、 (C)HDRPVTPDN、 (C)DRPVTPDN、 (C) DNPVHPEN、 (C)DVPVLPDN、 (C)DTPVYPDN、 (C)DTPVIPDN、 (C)DQPVLPDG、 (C)DMPVLPDG、 (C)
DSPVLPDG、 (C)DSPVWAEG、 (C)DRPVAPEG、 (C)DHPVHPDS、 (C)DMPVSPDR、 (C)DSPVPPDD、 (C) DQPVYPDI、 (C)DRPVYPDI、 (C)DHPVTPDR、 (C)EYPVYPES、 (C)DTPVLPDS、 (C)DMPVTPDT、 (C) DAPVTPDT、 (C)DSPVVPDN、 (C)DLPVTPDR、 (C)DSPVHPDT、 (C)DAPVRPDS、 (C)DMPVWPDG、 (C) DAPVYPDG 、 (C)DRPVQPDR 、 (C)YDRPVQPDR 、 (C)DMPVDPEN 、 (C)DMPVDADN 、 DQPVLPD(C) 、 DMPVLPD(C)、 (C)EMPVDPDN 以及 (C)DNPVHPE。
令人惊讶的是， 发现包括上面列举的氨基酸序列或由其组成的本发明化合物特别 适用于生产待用于治疗或预防突触核蛋白病的医药。这些肽 ( 模拟表位 ) 能够在体内诱导 形成导向包含氨基酸序列 DMPVDPDN 的人类 α- 突触核蛋白原始表位以及人类 α- 突触核 蛋白自身的抗体。然而， 所述肽 ( 模拟表位 ) 针对人类 β- 突触核蛋白不能够诱导， 或仅能 诱导非常有限的免疫反应性。 令人惊讶的是， 由原始 α- 突触核蛋白诱导抗体 ( 包含氨基酸 序列 DMPVDPDN) 特异性的结合于 α- 突触核蛋白以及 β- 突触核蛋白。因此， 所述肽 ( 模 拟表位 ) 与所述原始肽相较， 诱导更加精确 (refined) 的免疫应答 ( 抗体 )。然而， 模拟表 位诱导的免疫应答并不一定区分 α- 突触核蛋白 (synuclein) 和 β- 突触核蛋白。在个体 中， 肽诱导的抗体负责去除 α- 突触核蛋白 ( 其涉及 α- 突触核蛋白聚集物， Lewy 体的形 成 )， 和 / 或 α- 突触核蛋白聚集物 (Lewy 体 ) 的解离。 上面列举的肽可在其 N- 末端包含或不包含半胱氨酸残基， 当然所述 C- 残基亦可 添加至 C- 末端。 因此， 本发明涵盖下列其 N- 末端或 C- 末端无半胱氨酸残基的肽 ： DQPVLPD、 DMPVLPD、 DSPVLPD、 DSPVWAE、 DTPVLAE、 DQPVLPDN、 DMPVLPDN、 DSPVLPDN、 DQPVTAEN、 DSPVWAEN、 DTPVLAEN 、 HDRPVTPD 、 DRPVTPD 、 DVPVLPD 、 DTPVYPD 、 DTPVIPD 、 HDRPVTPDN 、 DRPVTPDN 、 DNPVHPEN、 DVPVLPDN、 DTPVYPDN、 DTPVIPDN、 DQPVLPDG、 DMPVLPDG、 DSPVLPDG、 DSPVWAEG、 DRPVAPEG、 DHPVHPDS、 DMPVSPDR、 DSPVPPDD、 DQPVYPDI、 DRPVYPDI、 DHPVTPDR、 EYPVYPES、 DTPVLPDS、 DMPVTPDT、 DAPVTPDT、 DSPVVPDN、 DLPVTPDR、 DSPVHPDT、 DAPVRPDS、 DMPVWPDG、 DAPVYPDG、 DRPVQPDR、 YDRPVQPDR、 DMPVDPEN、 DMPVDADN、 EMPVDPDN 以及 DNPVHPE。
本发明的化合物可用于制备医药， 特别是疫苗， 其可用于治疗 α- 突触核蛋白 病， 藉此， 所述医药特别适于治疗选自下组的突触核蛋白病 ： 帕金森氏症 (PD)、 Lewy 体病 (LBD)、 弥散性 Lewy 体病 (DLBD)、 痴呆伴 Lewy 体病 (DLB)、 帕金森氏综合症伴痴呆 (PDD)、 多 系统萎缩 (MSA) 和神经退行性变伴脑铁积聚类型 I(NBIA Type I)。
根据本发明的优选实施方案， 所述化合物与药学上可接受的载体， 优选 KLH( 钥 孔戚血蓝素 (Keyhole Limpet Hemocyanin))、 破伤风毒素、 白蛋白结合蛋白、 牛血清白蛋 白、 树状体 (dendrimer)(MAP ； Biol.Chem.358 ： 581)、 肽接头 ( 或其两端区域 ) 以及 Singh 等， Nat.Biotech.17(1999)， 1075-1081( 特别是该文件中表 1 所描述的 ) 和 O′ Hagan 等， Nature Reviews， Drug Discovery 2(9)(2003)， 727-735( 特别是其中所描述的内源免疫增 强化合物和递送系统 ) 所描述的佐剂物质以及其他， 或上述混合物相偶联。在此背景下的 结合化学反应 (conjugation chemistry)( 例如， 通过异型双功能 (heterobifunctional) 化合物， 如 GMBS， 当然亦包括其他描述于 “Bioconjugate Techniques” ， Greg T.Hermanson 中的 ) 可选自本领域技术人员已知的反应。另外， 疫苗合剂 (vaccinecomposition) 可 用佐剂， 优选低溶解度铝成分来进行配制。当然， 佐剂如 MF59 磷酸铝、 磷酸钙、 细胞因子 ( 例如， IL-2、 IL-12、 GM-CSF)、 皂苷 ( 例如， QS21)、 MDP 衍生物、 CpG 寡聚物、 IC31、 LPS、 MPL、 聚 磷 杂 烯 (polyphosphazene)、 乳 化 剂 ( 例 如， Freund’ s、 SAF)、 脂 质 体、 病毒颗粒
(virosome)、 免疫刺激复合物 (iscoms)、 蜗形物 (cochleate)、 PLG 微颗粒、 泊洛沙姆颗粒 (poloxamerparticle)、 类病毒颗粒、 热不稳定性肠毒素 (LT)、 伤寒毒素 (CT)、 变异体毒素 ( 例如， LTK63 和 LTR72)、 微颗粒和 / 或多聚化脂质体亦可使用。
本发明的化合物优选通过接头结合于所述载体或佐剂， 所述接头选自下组 ： NHS- 聚环氧乙烷 (PEO)( 例如 NHS-PEO4- 马来酰亚胺 )。
包含本发明化合物 ( 模拟表位 ) 的疫苗和所述药学上可接受的载体可通过任何合 适方法的使用法， 例如、 i.d.、 i.v.、 i.p.、 i.m.、 鼻内、 经口、 皮下等等， 并在任何合适的递送 装置进行给药 (O′ Hagan 等， Nature Reviews， DrugDiscovery 2(9)， (2003)， 727-735)。 本发明的化合物优选配制为供静脉内、 皮下、 皮内或肌肉内给药 ( 参见， 例如 “Handbook of Pharmaceutical ManufacturingFormulations” ， Sarfaraz Niazi， CRC Press Inc， 2004)。
一 般 而 言， 所 述 疫 苗 含 有 自 0.1ng 到 10mg， 优 选 10ng 到 1mg， 特 别 是 100ng 到 100μg， 或者， 例如 100fmol 到 10μmol， 优选 10pmol 到 1μmol， 特别是 100pmol 到 100nmol 的本发明的化合物。一般而言， 所述疫苗亦含有辅助性的物质， 例如缓冲液， 稳定剂等等。
本发明的另一个方面涉及具有选自下组氨基酸序列的肽 ： (C)DQPVLPD、 (C) DMPVLPD、 (C)DSPVLPD、 (C)DSPVWAE、 (C)DTPVLAE、 (C)DQPVLPDN、 (C)DMPVLPDN、 (C)DSPVLPDN、 (C)DQPVTAEN、 (C)DSPVWAEN、 (C)DTPVLAEN、 (C)HDRPVTPD、 (C)DRPVTPD、 (C)DVPVLPD、 (C) DTPVYPD、 (C)DTPVIPD、 (C)HDRPVTPDN、 (C)DRPVTPDN、 (C)DNPVHPEN、 (C)DVPVLPDN、 (C) DTPVYPDN、 (C)DTPVIPDN、 (C)DQPVLPDG、 (C)DMPVLPDG、 (C)DSPVLPDG、 (C)DSPVWAEG、 (C) DRPVAPEG、 (C)DHPVHPDS、 (C)DMPVSPDR、 (C)DSPVPPDD、 (C)DQPVYPDI、 (C)DRPVYPDI、 (C) DHPVTPDR、 (C)EYPVYPES、 (C)DTPVLPDS、 (C)DMPVTPDT、 (C)DAPVTPDT、 (C)DSPVVPDN、 (C) DLPVTPDR、 (C)DSPVHPDT、 (C)DAPVRPDS、 (C)DMPVWPDG、 (C)D APVYPDG、 (C)DRPVQPDR、 (C) YDRPVQPDR、 (C)DMPVDPEN、 (C)DMPVDADN、 DQPVLPD(C)、 DMPVLPD(C)、 (C)EMPVDPDN 以及 (C) DNPVHPE。
根据本发明的优选实施方案， 所述肽与药学上可接受的载体， 优选 KLH( 钥孔戚血 蓝素 ) 偶联。
本发明的另一个方面涉及药学配制剂， 优选疫苗， 包括至少一个本发明的肽， 且选 自下组 ： (C)DQPVLPD、 (C)DMPVLPD、 (C)DSPVLPD、 (C)DSPVWAE、 (C)DTPVLAE、 (C)DQPVLPDN、 (C)DMPVLPDN、 (C)DSPVLPDN、 (C)DQPVTAEN、 (C)DSPVWAEN、 (C)DTPVLAEN、 (C)HDRPVTPD、 (C)DRPVTPD、 (C)DVPVLPD、 (C)DTPVYPD、 (C)DTPVIPD、 (C)HDRPVTPDN、 (C)DRPVTPDN、 (C) DNPVHPEN、 (C)DVPVLPDN、 (C)DTPVYPDN、 (C)DTPVIPDN、 (C)DQPVLPDG、 (C)DMPVLPDG、 (C) DSPVLPDG、 (C)DSPVWAEG、 (C)DRPVAPEG、 (C)DHPVHPDS、 (C)DMPVSPDR、 (C)DSPVPPDD、 (C) DQPVYPDI、 (C)DRPVYPDI、 (C)DHPVTPDR、 (C)EYPVYPES、 (C)DTPVLPDS、 (C)DMPVTPDT、 (C) DAPVTPDT、 (C)DSPVVPDN、 (C)DLPVTPDR、 (C)DSPVHPDT、 (C)DAPVRPDS、 (C)DMPVWPDG、 (C) DAPVYPDG 、 (C)DRPVQPDR 、 (C)YDRPVQPDR 、 (C)DMPVDPEN 、 (C)DMPVDADN 、 DQPVLPD(C) 、 DMPVLPD(C)、 (C)EMPVDPDN 和 (C)DNPVHP E。
本发明的医药配制剂， 其可作为供， 例如， 皮下、 静脉内和 / 或肌肉内给药的疫苗 进行配制， 可用于治疗任何类型的突触核蛋白。
本发明进一步在下述附图和实施例中加以说明， 但并不仅限于此。
图 1 显示通过 ELISA 使用对人类 α- 突触核蛋白 115-122 位具有特异性的单克隆抗体检测 α- 突触核蛋白的特异性表位。
肽 p4446(α- 突触核蛋白 )、 p4449 和 p4448( 人类表位 ) 由所述抗体检测。 阴性对 照肽 p4447(β- 突触核蛋白 ) 和 p4450、 p4451( 小鼠表位 ) 未检测出来。不相干的肽 p1252 在所述 ELISA 分析法中不显示结合。数据以线性尺度表示。
图 2 显示通过 ELISA 使用对人类 α- 突触核蛋白 115-122 位具有特异性的单克隆 抗体检测模拟表位。 显示了两个模拟表位 (p4553， p4557) 的数据。 肽 p4557 与原始肽 p4448 相较， 显示较弱的结合。肽 p4553 对检测抗体显示强结合。不相干的肽 p1253 并未在 ELISA 分析法中根据预测显示任何结合。当接种小鼠时， 两个模拟表位均诱导＞ 1/20000 的效价， 并视为强结合剂。
图 3 显示通过 ELISA 使用对人类 α- 突触核蛋白 115-122 位具有特异性的单克隆 抗体检测检测模拟表位的竞争作用。描述的值是通过 ELISA 使用 40μg 肽在抑制分析法中 测定的。 与原始肽 p4448 相较， 不相干的肽 p1253 和模拟表位 p4492 并不显示竞争作用。 模 拟表位 p4490 和 p4491 显示与原始肽 p4448 相似的竞争作用。竞争作用通过在 ELISA 中与 原始表位比较在 40μg 肽浓度下的 OD 来进行计算。将所有的模拟表位与该参照比较得到 竞争指数 (competition index)。1 左右的指表明高抑制能力。具有 5 以上的竞争指数的 肽评价为非竞争性的。 图 4 显示针对注射入的肽和不相关肽的免疫应答。
A) 在四次接种后经免疫化的小鼠血清针对其注射入的肽 ( 原始表位 (p4448) 和 模 拟 表 位 ( 分 别 为 p4456、 p4466 和 p4467)) 显 示 高 效 价。 用 ELISA 测 定 的 效 价 为 1 ∶ 10000(1 ∶ 10.000) 左右 (OD 半最大值 )， 数据以对数尺度表示。作为 ELISA 的阳性对 照， 使用 α- 突触核蛋白特异性单克隆抗体 (CTRLpos)。
B) 免疫化的小鼠同样的血清未能检测出不相关的肽 (p1253)。用 ELISA 测定的效 价小于 1 ∶ 100(OD 半最大值 )， 低于来自针对所述不相干的肽有特异性的单克隆抗体的信 号 (CTRL pos) 超过一百倍。作为阳性对照， 不使用第一抗体 (primary antibody)。数据以 线性尺度表示。
图 5 显示在重复的模拟表位免疫化后针对突触核蛋白免疫应答。
A) 在其相应组中所有的动物汇集的血清显示针对 p4448， 一种位于 α- 突触核蛋 白 C- 末端的蛋白质的抗体效价。数据以对数尺度表示。
B) 经免疫化的小鼠 (p4448、 p4457 和 p4463) 的汇集的血清在四次接种后显示针对 α- 突触核蛋白的效价。经免疫化的小鼠 (p4466 和 p4467) 的汇集的血清未检测出 α 或 β- 突触核蛋白 ( 用 ELISA 测定的效价远小于 1 ∶ 100 的半最大值 )。经原始表位 (p4448) 免疫化的汇集的血清检测出 α 和 β- 突触核蛋白。 以 ELISA 测定的效价， 其中小于 1 ∶ 100 半最大值的用星号标出， 对应于接近背景的值。所述经测试的模拟表位中大部分诱导不与 β- 突触核蛋白交叉反应的抗体。数据以对数尺度表示。
图 6A 显示使用可市购的、 特异性检测人类 α-syn 的抗体的阳性对照染色。在 6B 中， 同样的抗体用于对非转基因小鼠脑的同一区域进行染色， 未能检测出任何 α-syn 阳 性组织， 这是因为该动物不表达人类 α-syn。在 6C 中， 与 6A 中存在的染色相似的特异性 α-syn 染色通过经模拟表位诱导的血清 (p4498 诱导血清 ) 引发 (elicit)。在鼠类丘脑中 的 α-syn 阳性染色以如示于 6A 和 6C 的斑点状染色样式为特征。箭头指示分别见于 6A 和
6C 的上述 α-syn 阳性包涵物的三个实例。 实施例 可用于本发明的模拟表位鉴定的抗体检测人类 α- 突触核蛋白衍生氨基酸序列 DMPVDPDN( ＝原始表位， SEQ ID No.1) 和全长人类 α- 突触核蛋白。 其并不识别人类 β- 突 触核蛋白。所述抗体可为单克隆或多克隆抗体制备物或其任何抗体部分或衍生物， 且特异 性的结合于人类 α- 突触核蛋白的 DMPVDPDN 表位， 亦即， 其确实结合于肽和全长蛋白质， 但 不结合于人类 β- 突触核蛋白。
所述模拟表位用上述单克隆抗体 ( 检测在人类 α- 突触核蛋白蛋白质氨基酸 115-112 内的序列 ) 和肽文库识别并进一步表征。
实施例 1 ： 产生特异性检测原始人类 α- 突触核蛋白表位 C-DMPVDPDN 和人类 α- 突触核蛋白但非人类 β- 突触核蛋白的单克隆抗体
由融合蛋白 “AFFiRiS 3” 衍生的单克隆抗体 ： Balb/c 小鼠用与 BTG( 牛甲状腺球 蛋白 ) 和 CFA( 弗氏完全佐剂， 首次注射 ) 偶联， 以及 IFA( 弗氏不完全佐剂， 三次加强注射 ) 作为佐剂的原始 α- 突触核蛋白表位 C-DMPVDPDN 免疫化。DMPVDPDN 肽特异性的产生抗体 的杂交瘤通过 ELISA(DMPVDPDN 肽覆被的 ELISA 平板 ) 检测。人类 α- 突触核蛋白 ( 重组 蛋白质 ) 用作阳性对照肽 ： 包括了识别固化于 ELISA 平板上的所述重组蛋白质的杂交瘤， 这 是因为其特异性的结合肽和全长 α- 突触核蛋白。人类 β- 突触核蛋白 ( 重组蛋白质 ) 用 作阴性对照 ： 排除了识别固化于 ELISA 平板上的两种肽的杂交瘤， 这是因为其不区分两种 不同的突触核蛋白蛋白质。
对所得杂交瘤克隆 (AFFiRiS3/9( 内部名 “A509” ； IgG1) 分析其对天然人类 α- 突 触核蛋白表位 DMPVDPDN 的特异性检测。 A509 在 ELISA 中识别注射入的表位以及全长 α- 突 触核蛋白蛋白质 ( 重组蛋白质， 自 rPeptide， Bogart， GA， USA 获得 )。然而其并不在 ELISA 中识别 β- 突触核蛋白 ( 重组蛋白质， 自 rPeptide， Bogart， GA， USA 获得 )。进一步， 所述 A509 抗体并不检测编码 α- 突触核蛋白小鼠变体的肽。同样的结果可用可市购的 mAB 克 隆 ( 亦即， α- 突触核蛋白 (LB509) 单克隆抗体， 目录号 SIG-39725 ； Covance(Princton， NJ， USA)) 获取。
实施例 2 ： 噬菌体呈递， 体外结合和抑制性 ELISA
用于该实施例的噬菌体呈递文库为 ： Ph.D.7 ： New England BioLabsE8102L( 线性 七聚体文库 )and Ph.D.12 ： New England BioLabs E8111L( 线性十二聚体文库 )。噬菌体 呈递根据生产商的实验规程完成 (www.neb.com)。
在 2 到 3 后续轮次的淘洗 (panning) 后， 挑取单独的噬菌体克隆， 并对噬菌体上清 在覆被以用于淘洗过程的抗体的平板上进行 ELISA。对在该 ELISA 中为阳性的噬菌体克隆 ( 对靶有强信号， 但对非特异性的对照无信号 ) 进行测序。通过 DNA 序列推导出肽序列。合 成这些肽， 并用结合和抑制性 ELISA 对其进行表征。 对一些肽， 在其 C- 末端附加额外的 AA。 此外， 一些新颖的模拟表位通过合并来自在所述筛选中识别的模拟表位的序列信息进行构 建。两个含有新设计出的模拟表位的组均用于支持对模拟表位疫苗共有序列的识别。
1. 体外结合分析法 (ELISA)
将自噬菌体呈递衍生的肽以及其在 C- 末端延长的变体与 BSA 并结合于 ELISA 平
板 (1μM ； 如相应的附图所示 ) 并随后与供对识别出的肽的结合能力进行分析的筛选过程 中使用的单克隆抗体一起温育。
2. 体外抑制性分析法 (ELISA)
将自噬菌体呈递衍生的不同量的肽 ( 浓度范围从 40μg 到 0.3μg( 系列稀释 ) 如 相应的附图所示 ) 与用于所述筛选过程的单克隆抗体一起温育。减弱所述抗体对覆被于 ELISA 平板上的所述原始的人类 α- 突触核蛋白表位 ( 人类 α- 突触核蛋白蛋白质的氨基 酸 115-122) 后续结合的肽在该分析法中视为抑制性的。
实施例 3 ： 模拟表位的体内测试 ： 对免疫原性和交叉反应性的分析
1. 模拟表位的体内测试
将抑制性以及非抑制性肽与 KLH 偶联并与合适的佐剂 ( 氢氧化铝 ) 一起注射入小 鼠 ( 野生型 C57/B16 小鼠 ； 皮下注射入胁腹部 (flank))。对动物以两周的间隔进行 4-6 次 接种， 并同样每两周取一次血清。对每份血清确定其针对注射入的肽以及不相关的肽的效 价。自血清 3 起分别确定针对重组人类 α- 突触核蛋白蛋白质和重组人类 β- 突触核蛋白 的效价。针对原始人类 α- 突触核蛋白表位 (aa115-122) 对汇集的血清进行测试。一般而 言， 血清通过针对与其牛血清白蛋白 (BSA) 偶联的肽和固化于 ELISA 平板的重组全长蛋白 质之间的反应进行分析。效价通过使用抗小鼠 IgG 特异性抗体加以确定。详细结果参见图 4 和 5。
2. 模拟表位的原位测试
亦对选定的引发 α-syn 交叉反应性的血清分析其在小鼠脑切片中原位检测人类 α-syn 的能力。详细结果参见图 6。
3. 结果
3.1 识别 α- 突触核蛋白特异性 mAB ：
图 1 描绘了对自融合蛋白 AFFiRiS 3 衍生的 α- 突触核蛋白特异性单克隆抗体 AFFiRiS3/9( 内部名 “A509” ； IgG1) 的识别。
3.2.1 噬菌体呈递文库 Ph.D.7 和 12
3.2.1.1 用针对 DMPVDPDN 的单克隆抗体进行筛选
在该筛选中通过筛选 PhD7 和 PhD12 噬菌体呈递文库识别出 51 个序列 ： 表 1 总结 了识别出的肽及其与所述原始表位相比较的结合能力 ：
图1： 结合于亲本抗体的 α- 突触核蛋白模拟表位 ：
肽的内部编号 p4456 p4457 p4458 p4460SEQ ID No. 2 3 4 5序列 CDQPVLPD CDMPVLPD CDSPVLPD CDSPVWAE结合能力 3 3 3 114CN 101969989 A说6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28明书CDTPVLAE CDQPVLPDN CDMPVLPDN CDSPVLPDN CDQPVTAEN CDSPVWAEN CDTPVLAEN CHDRPVTPD CDRPVTPD CDNPVHPE CDVPVLPD CDTPVYPD CDTPVIPD CHDRPVTPDN CDRPVTPDN CDNPVHPEN CDVPVLPDN CDTPVYPDN CDTPVIPDN CDQPVLPDG CDMPVLPDG CDSPVLPDG CDSPVWAEG 1 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 312/17 页p4461 p4462 p4463 p4464 p4465 p4466 p4467 p4484 p4485 P4486 p4487 p4488 p4489 p4490 p4491 p4492 p4493 p4494 p4495 p4496 p4497 p4498 p449915CN 101969989 A说29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51明书CDRPVAPEG CDHPVHPDS CDMPVSPDR CDSPVPPDD CDQPVYPDI CDRPVYPDI CDHPVTPDR CEYPVYPES CDTPVLPDS CDMPVTPDT CDAPVTPDT CDSPVVPDN CDLPVTPDR CDSPVHPDT CDAPVRPDS CDMPVWPDG CDAPVYPDG CDRPVQPDR CYDRPVQPDR CDMPVDPEN CDMPVDADN DQPVLPDC DMPVLPDC 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 313/17 页p4553 p4554 p4555 p4556 p4557 p4558 p4559 p4560 p4561 p4562 p4563 p4564 p4566 p4567 p4568 p4569 p4570 p4571 p4572 p4635 p4636 p4640 p464116CN 101969989 A说52明书CEMPVDPDN 314/17 页P4648
表 1 的图例 ： 结合能力的编码通过下述结合编码进行 ： 1： X 描述亲本 AB 的稀释因子。
结合编码 0 1 2 3
OD 半最大值 1 ： X 无结合 弱结合 中等结合 如原始表位的结合 ( 强结合 ) ： 0 ： ＜ 5000 ： 5000-20000 ： 20000-1280003.3 在用针对 α- 突触核蛋白的单克隆抗体筛选噬菌体呈递文库中识别出的模拟 表位的体外表征
图 2 和 3 显示了用于体外表征模拟表位的结合和抑制性分析法的代表性实例。获 得的数据分别在表 1 和表 2 中总结。
在列举的 51 个序列中， 29 个序列在体外竞争性实验中抑制 α- 突触核蛋白特异性 单克隆抗体的结合 ； 另外识别出 22 个不在体外竞争性实验中抑制单克隆抗体结合， 但仍旧 保留针对亲本抗体结合能力的序列。
表2： 在本发明中识别的在抑制性分析法中给出阳性结果的 α- 突触核蛋白表位
表 2 的图例 ： 抑制能力的编码通过下述编码进行 ：
弱抑制指与原始表位相比较需要更多肽来降低 AB 结合 ； 强抑制指对于模拟表位 和原始表位需要相同量的肽来降低 AB 结合。将模拟表位与作为标准的所述原始肽相比较。 在所述分析法中使用 40μg 的 OD 用于计算与原始多肽相比较的竞争能力。
竞争编码 0 1 2
无抑制 (40μg 肽的 OD 高于原始肽的 5 倍 ) 较原始表位弱 (40μg 肽的 OD 低于原始肽的 5 倍 ) 强抑制 ( 如原始表位 ； 40μg 肽的 OD 低于原始肽的 2 倍 )表3： 非模拟表位的肽和蛋白质3.4. 在用针对 α- 突触核蛋白的单克隆抗体进行的噬菌体呈递文库筛选中识别 出的模拟表位的体内表征
对每组 5-6 只雌性 C57/B16 小鼠皮下用 30μg 与 KLH 偶联的肽进行免疫化。对对 照组施用 p4448-KLH 偶联物。使用明矾作为佐剂 ( 总是每个小鼠 1mg)。施用的肽均能够 结合于与人类 α- 突触核蛋白的 aa115-122 特异性结合的单克隆抗体， 尽管一些肽并不抑 制原始表位在体外对其亲本抗体的结合 ( 通过体外抑制性分析法 )。确定抗体效价的体外 ELISA 分析法用单独小鼠的血清或汇集的血清 ( 参见图 5) 在每次接种后以两周的间隔进行 ( 分别参见图 4 和图 5)。ELISA 平板的孔用模拟表位 -BSA 偶联物和不相关的肽 -BSA 偶联 物 ( 阴性对照 ) 覆被。阳性对照通过用亲本抗体与相应的模拟表位 -BSA 聚合物反应来进 行。检测用抗小鼠 IgG 进行。此外， 重组蛋白质固化于 ELISA 平板上， 并用血清相应的进行 反应。
对于所有在 C57/B16 小鼠中测试的模拟表位， 针对单独注射入的肽反应的抗体可 在反复接种后检测出来。此外， 在 4 个描绘的模拟表位中的 2 个 ( 分别参见图 5 和表 1) 发 展出与人类 α- 突触核蛋白但非人类 β- 突触核蛋白反应的抗体。2/4 不显示与重组蛋白 质的交叉反应性。重要的是， 原始表位 DMPVDPDN 导致不区分两种重组突触核蛋白蛋白质的 免疫应答。
图 4 和 5 显示用于体内表征模拟表位的分析法的代表性实例。图 4 通过分析针对 注射入的肽和含有不相关序列的不相关的肽的免疫应答来显示体内表征由模拟表位接种
引发的免疫应答的实例。 原始表位 p4448， 即阳性对照肽， 和模拟表位 p4456、 p4466 和 p4467 引发针对注射入的肽 ( 其自身 ) 的免疫应答， 但无法诱导针对不相关序列 (p1253) 的非特 异性免疫应答。
图 5 显示体内表征由模拟表位接种引发针对全长 α- 突触核蛋白和 β- 突触核蛋 白的免疫应答的实例。所有在该实例中测试的疫苗针对原始 α- 突触核蛋白表位 115-122 导致可检测出的免疫应答。几乎所有在该实例中测试的模拟表位和所述原始表位 ( 例外 ： p4466 和 p4467) 还进一步显示与全长 α- 突触核蛋白的反应性。然而， 原始表位诱导的免 疫应答还检测全长 β- 突触核蛋白， 从而减弱了针对 α- 突触核蛋白的特异性以及区分两 种蛋白质的能力。 与该发现相反， 大部分 ( 但并非所有的 ) 模拟表位诱导的血清无法检测出 β- 突触核蛋白， 从而保留了区分两种突触核蛋白蛋白质的能力， 并保证活性免疫化程序针 对 α- 突触核蛋白的高特异性， 以获取效率和优异的安全性模式 (profile)。
3.5. 模拟表位的原位测试
引发 α-syn 特异性免疫应答的模拟表位亦可在转基因小鼠脑组织中检测出 α-syn 免疫反应性包涵物。如图 6 所描绘， 来自经模拟表位接种的动物的血清能够对来 自过表达人类 α-syn 的小鼠的脑切片中存在的 α-syn 阳性结构进行染色。简言之， 对 人类 α-syn 在 ELISA 中具有阳性反应性的血清已用于免疫组织化学 (IHC)。对加载于 Superfrost Plus 玻璃载玻片上经石蜡包埋的小鼠脑的 7μM 切片进行 IHC。切片与血清 ( 在 PBS 中 1 ∶ 100 和 1 ∶ 400 稀释 ) 一起温育， 并随后根据免疫组织化学的标准试验规程 使用 VECTASTAIN ABC 系统进行染色， 使用 DAB 和 MOM 封闭 ( 所有的反应使用分别自 Vector 实验室获取的可市购的的试剂并根据生产商的实验设计来进行 )。 复染色使用苏木精进行。 载玻片加载于 Entellan 并随后使用常规亮视野显微镜进行归档。对人类 α-syn 具有特异 性的单克隆抗体 (LB509， Covance) 以 1/250 的最终稀释用作突触核蛋白检测的阳性对照。
在图 6A 中， 描绘了阳性对照染色。在 6B 中， 同样的抗体用于非转基因小鼠脑的同 一区域， 结果无法检测出任何 α-syn， 这是因为该动物并不表达人类 α-syn。在 6C 中， 与 6A 中表现的染色相似特异性 α-syn 染色由模拟表位诱导的血清 (p4498 诱导的血清 ) 引 发。 在鼠类丘脑中 α-syn 阳性染色以如图 6A 和 6C 中所示的斑点状的染色样式为特征。 潜 在诱导 α-syn 特异性抗体的实例包括但不仅限于分别基于 p4456、 p4498 和 p4562 的疫苗。20CN 101969989 A
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