高稳定性 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO 及其制备方法与应 用 技术领域 本发明涉及基因工程技术领域， 特别涉及一种高稳定性 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO 及其制备方法， 与其用于制备具有如下功能的药物 ： 促进神经再生及神经损伤后修 复， 如： 在角膜损伤后促进角膜神经突形成， 促进角膜上皮细胞修复， 以及提高角膜敏感性、 改善泪腺分泌功能。
背景技术 垂体腺苷酸环化酶激活肽 (PACAP) 是 1990 年被发现由脑垂体分泌的具有重要生 物学功能的神经多肽， 是促胰液素 / 高血糖素 /VIP 家族中的新成员。PACAP 有两种存在形 式： PACAP38， 由 38 个氨基酸组成 ； PACAP27， 由 PACAP38 氮端的 27 个氨基酸组成。PACAP 通 过激活其特异的 G 蛋白偶联受体， 提高靶细胞 cAMP 等第二信使的浓度， 从而发挥广泛而重 要的生物学功能。PACAP 有三类 G 蛋白偶联受体 ： PAC1、 VPAC1 和 VPAC2 ； 三类受体在生物
体中分布不同， 所起的作用也不相同。其中， PAC1 受体是 PACAP 的特异性受体， 主要存在于 中枢神经系统、 周围神经系统以及睾丸、 卵巢、 呼吸道、 肺、 胰腺等腓神经组织中。PACAP 与 PAC1 受体作用与腺苷酸环化酶 (AC) 和磷脂酶 C(PLC) 藕联 ： 一是通过 cAMP 信号传导通路， 激活 AC， 催化 ATP 转化为 cAMP， cAMP 随之激活其依赖性蛋白激酶 A(PKA)， PKA 可使细胞内 多种蛋白质磷酸化， 产生生理效应， 尤其是在细胞的增殖分化中有重要作用 ； 二是通过磷脂 酰肌醇信号传导通路， 首先与 G- 蛋白藕联并使之激活， 在 PLC 作用下， 磷酚肌醇二磷酸水解 为肌醇三磷酸 (IP3) 和乙酰基甘油 (DAG)， IP3 的增加引起胞内钙离子释放， DAG 则可激活 蛋白激酶 C(PKC)， PKC 和钙离子 - 钙调蛋白依赖性的丝氨酸 - 苏氨酸蛋白激酶及酪氨酸激 酶的激活， 使胞内相应的蛋白质磷酸化， 最终产生一系列生理效应。 PACAP 通过 PAC1 受体介 导的生物学功能主要有 ： 神经递质 / 调质、 保护神经细胞 ； 神经损伤修复 ； 调节血管 ； 促进 激素分泌， 调节内分泌平衡 ； 调节性腺功能和生殖细胞的产生 ； 参与消化活动， 调节能量代 谢平衡 ； 参与调节免疫系统 ； 调节细胞增殖分化等。
现有研究表明， PAC1 受体在新生兔和成年兔的三叉神经节细胞中高表达， 其 mRNA 的量约为 VPAC1 受体和 VPAC2 受体 mRNA 的 25-31 倍 ； PACAP 可有效促进 PC12 细胞、 脑神经 及视网膜神经细胞突起形成和对抗神经细胞外 β 淀粉样蛋白 (Aβ) 导致的大鼠海马神经 元凋亡的作用。因此， 研发作为 PAC1 受体特异激动剂的 PACAP 衍生多肽， 具有重要的药用 价值。
目前作为 PAC1 受体激动剂的野生型 PACAP 是由 27 个或 38 个氨基酸组成的多肽， 野生型 PACAP 27 或 PACAP 38 在水溶液或体液环境中的稳定性较差， 特别是一些酶如二肽 基肽酶 (DPPIV) 还可降解其 N 端， 从而使其失去与受体结合的活性。 发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足， 提供一种具有更高稳定性和更高生物活性的高稳定性 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO。
本发明的另一目的在于提供所述高稳定性 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO 的制备 方法。该制备方法根据 PACAP 衍生多肽 MPAPO 的氨基酸序列及大肠杆菌密码子的偏好性， 设计 MPAPO 在原核表达系统的基因序列， 采用基因工程技术， 结合蛋白内含肽 (intein) 的 可诱导剪切功能实现目的多肽 MPAPO 的高效制备 ； 该制备方法生产效率高， 生产成本低。
本发明的再一目的在于提供所述高稳定性 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO 的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现 ： 一种高稳定性 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO， 其氨基酸序列如下所示 ： MHSDGIFTDSYSRYRKQLAVKKYLAAVKK ；
所述高稳定性 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO 的编码核苷酸序列为 ：
ATG CAT AGC GAT GGC ATT TTT ACC GAT AGC TAT AGC CGC TAT CGC AAA CAGCTG GCG GTG AAA AAA TAT CTG GCG GCG GTG AAA AAA ；
所述高稳定性 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO 的制备方法， 包括以下步骤 ：
(1) 设计并合成 MPAPO 基因 ：
采用 3 条引物两步法合成 MPAPO 基因 ：
引 物 F1 ： 5’ -GGT GGT CATATG CAT AGC GAT GGC ATT TTT ACC GAT AGC TAT AGC-3’ ；
引物 F2 ： 5’ -TTT TTT CAC CGC CAG CTG TTT GCG ATA GCG GCT ATA GCT ATC GGT-3’ ；
引物 F3 ：
5’ -CCACCATGCTCTTCCGCA TTT TTT CAC CGC CGC CAG ATA TTT TTT CAC CGC CAG-3’
其中， GGT GGT 或 CCACCA 为保护碱基， CATATG 为 NdeI 酶切位点， TGCTCTTCCGCA 为 SapI 酶切位点 ；
首先将引物 F1 和引物 F2 进行链延伸反应， 然后以其产物为 DNA 模板， 以 F1 和 F3 为引物， PCR 反应制得 MPAPO 基因 ；
(2) 构建重组载体 pKY-MPAPO ：
用 Ndel 酶和 Sapl 酶分别对质粒 pKYB 和步骤 (1) 制得的 MPAPO 基因进行双酶切， 再将双酶切后的 MPAPO 基因和双酶切后的质粒 pKYB 连接， 得到重组载体 pKY-MPAPO ；
(3) 制备表达工程菌 pKY-MPAPO/ER2566 ：
用重组载体 pKY-MPAPO 转化表达宿主菌 E coli Strain ER2566， 得到表达工程菌 pKY-MPAPO/ER2566 ；
(4) 表达和纯化 ：
①诱导表达工程菌 pKY-MPAPO/ER2566 表达由目的多肽、 蛋白内含肽和几丁质结 合域 (Chitin binding domain， CBD) 组成的 “三元” 融合蛋白 ；
②得到的 “三元” 融合蛋白用几丁质柱进行纯化， “三元” 融合蛋白吸附于几丁质柱 中， 然后含有硫醇的溶液过柱并充满几丁质柱环境中， 反应。 硫醇的作用是诱导蛋白内含肽 的 N 端切割， 释放目的多肽 C 端硫酯 ； 接着洗脱几丁质柱， 得到目的多肽 C 端硫酯， 透析目的 多肽 C 端硫酯， 从而产生稳定的水解产物 ；
③利用高效液相色谱技术纯化目的多肽， 得到高稳定性 PAC1 型受体特异激动剂MPAPO。 步 骤 (1) 中 所 述 链 延 伸 反 应 的 条 件 优 选 为 94 ℃， 10min ； 降 至 58 ℃ 5min ； 72℃ 10min ；
步 骤 (1) 中 所 述 PCR 反 应 的 条 件 优 选 为 反 应 条 件 为 ： 94 ℃ 5min ； 94 ℃ 30s， 55℃ 30s， 72℃ 30s， 30 个循环 ； 72℃延伸 10min ；
步骤 (4) ②中所述含有硫醇的溶液的组成如下 ： 20mM Tris-HCI， 0.5M NaCl， 1mM EDTA， 50mMβ- 巯基乙醇， pH 8.0 ；
步骤 (4) ②中所述反应的条件优选为 16℃反应 24 小时 ；
步骤 (4) ②中所述洗脱几丁质柱的溶液的组成优选如下 ： 20mM Tris-HCl， 500mM NaCI， 1mM EDTA， pH 8.0 ；
步骤 (4) ③中所述利用高效液相色谱技术纯化目的多肽 MPAPO 的步骤如下 ：
A、 流动相 A 为在体积百分比 10％乙腈 (CNCH3， 溶质为纯水 ) 中添加三氟乙酸 (TFA) 得到， TFA 的终浓度为体积百分比 0.1％ ； 流动相 B 为 100％乙腈 (CNCH3) 中添加三氟乙酸 (TFA)， TFA 的终浓度为体积百分比 0.1％ ； 流速 1mL/min， 20min 线性梯度洗脱 ；
B、 线性梯度洗脱中流动相 B 由 0 ～ 60％ (v/v)， 收集目的多肽洗脱峰， 光吸收检测 波长为 218nm ； 并进行质谱鉴定。
一种高稳定性 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO， 由上述制备方法得到 ；
所述高稳定性 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO 应用于制备具有如下功能的药物 ： 促 进神经再生及神经损伤后修复， 如： 在角膜损伤后促进角膜神经突形成、 促进角膜上皮细胞 修复， 以及提高角膜敏感性、 改善泪腺分泌功能。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果 ：
(1) 本发明所制备的高稳定性 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO， 是 PACAP 衍生多肽， 与野生型 PACAP 相比， 在其 N 端多了一个甲硫氨酸， 并具有特殊的氨基酸序列， 即在 C 端通 过巯酯键结合硫醇， 成为多肽硫酯， 多肽硫酯可以水解产生天然的羧基端， 也可特异水解成 为硫代羧酸。
(2) 该 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO 的氨基酸序列不同于天然的野生型 PACAP 及 其他与 PACAP 非同源的 PAC1 型受体特异激动剂， 与野生型 PACAP 的区别点在于 ：
第 17 位 野生型 PACAP 本发明
第 27 位 亮氨酸 (L) 赖氨酸 (K)第 28 位 甘氨酸 (G) 赖氨酸 (K)甲硫氨酸 (M) 亮氨酸 (L)这些区别使得 MPAPO 具有更高的稳定性和对 PAC1 型受体的特异激活活性。
(3) 本发明所制备的高稳定性 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO 在促进神经再生及 神经损伤后修复， 抗脑损伤、 防止神经细胞死亡、 不孕不育、 神经混乱、 焦虑症、 记忆损伤、 痴 呆、 认知混乱、 中枢神经系统疾病、 神经畏缩、 肌畏缩症、 视网膜病变、 心血管疾病中有显著 的疗效。
(4) 利用本发明所述的制备方法得到的 MPAPO 比化学合成的 MPAPO 多肽的稳定性高约 8 倍， 比野生型 PACAP 的稳定性高约 30 倍。本发明的表达方法效率高、 成本低， 应用前 景广阔。 附图说明
图 1 为重组多肽 MPAPO 的制备示意图。 图 2 为 MPAPO 基因合成及重组表达质粒 pKY-MPAPO 构建示意图 ； 图中 ： MCS- 多克隆位点 ； CBD- 几丁质结合结构域 ； intein- 内含肽。 图 3 为 SDS-PAGE 检测融合蛋白 Intein-CBD-MPAPO 表达的鉴定图 ； 其中， 泳道 1 是 IPTG 诱导前菌体破碎上清液 ； 泳道 2 是 IPTG 诱导后菌体破碎上清液。 图 4 为制备的重组多肽 MPAPO 的飞行质谱鉴定图。 图 5 为重组多肽 MPAPO 与野生型 PACAP38 的稳定性比较与检测结果图。 图 6 为 MPAPO/PACAP38 和 [125I]PACAP38 对 PAC1 受体的竞争性结合检测结果图。 图 7 为 MPAPO 和 PACAP38 促进 CHO-PAC1 细胞 cAMP 生成的活性测定结果图。 图 8 为 MPAPO 和 PACAP38 促进鼠三叉神经细胞神经突形成的检测结果图。 图 9 为 MPAPO 和 PACAP38 促进人角膜上皮细胞增殖的检测结果图。 图 10 为 MPAPO 和 PACAP38 促进损伤后鼠角膜上皮愈合的功能结果图。具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限 于此。
实施例 1
高稳定性 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO 的制备过程如图 1 所示， 具体步骤如下 ：
(1)MPAPO 编码序列的获得 ：
按照大肠杆菌的密码偏好性设计编码 MPAPO 的 cDNA， 设计 3 条引物， 采用两步法获 得该序列 ( 如图 2 所示 ) ：
引 物 F1 ： 5’ -GGT GGT CATATG CAT AGC GAT GGC ATT TTT ACC GAT AGC TAT AGC-3’ ；
引物 F2 ： 5’ -TTT TTT CAC CGC CAG CTG TTT GCG ATA GCG GCT ATA GCT ATC GGT-3’ ；
引物 F3 ：
5’ -CCACCATGCTCTTCCGCA TTT TTT CAC CGC CGC CAG ATA TTT TTT CAC CGC CAG-3’
其中， GGT GGT 或 CCACCA 为保护碱基， CATATG 为 NdeI 酶切位点， TGCTCTTCCGCA 为 SapI 酶切位点 ；
①链延伸反应 ：
反 应 体 系 为 ： 引 物 F1(250μM/L)2μL， 引 物 F2(250μM/L)2μL， 10×TaKaRaBuffer( 含有 4mmol/L MgCl2)2μL， dNTP 2μL， H2O 11.5μL， TaKaRa Taq 酶 0.5μL ；反应条件为 ： 94℃， 10min ； 降至 58℃ 5min ； 72℃ 10min ；
得到延伸反应液。
② PCR 反应 ：
反应体系为 ： 以 延 伸 反 应 液 为 DNA 模 板， 引 物 F1(25μM/L)2μL， F3(25μM/ L)2μL， 延 伸 反 应 液 1.5μL， dNTP 2μL， 10×TaKaRa Ex Buffer 2μL， TaKaRa Taq 酶 0.5μL， H2O 10μL ；
反应条件为 ： 94 ℃ 5min ； 94 ℃ 30s， 55 ℃ 30s， 72 ℃ 30s， 30 个 循 环 ； 72 ℃ 延 伸 10min ；
得到长度为 114bp 的 PCR 产物
(2) 构建重组载体 pKY-MPAPO， 如图 2 所示 ：
用 NdeI 和 SapI 进行酶切步骤 (1) 得到的 PCR 产物， 利用 PCR 产物纯化试剂盒进 行纯化 ( 根据说明书进行操作 )。纯化后的 PCR 产物先进行 LguI(SapI 的同功酶， Fermatas TM 产品 ) 单酶切， 酶切条件为 ： 在 1×Tango buffer 反应体系中， 1μg PCR 产物加入 15unit LguI(3μL)， 37℃酶切 4h ； LguI 单酶切完成后， 加入适量体积的 10×TangoTM buffer， 使得 TM 反应体系成为 2×Tango buffer 体系， 加入 20unit NdeI(2μL， Fermatas 产品 )， 37℃酶 切 4h ； 质粒 pKYB(New England Biolabs(NEB) 公司 ) 的双酶切 ： LguI(SapI 的同功酶 ) 和 NdeI 的双酶切条件同上。
将双酶切后的 MPAPO 基因和双酶切后的质粒 pKYB 连接， 连接体系和连接时间、 大 肠杆菌 DH5α( 购自大连宝生物公司 ) 感受态细胞的制作、 转化以及筛选 ( 卡那霉素 )， 根据 《分子克隆》 进行操作。将 MPAPO 基因克隆到质粒 pKYB 的 NdeI 和 SapI 位点间， 得到重组载 体 pKY-MPAPO。
(3) 表达和纯化 ：
①将重组质粒 pKY-BAY 转化表达宿主菌 E.coli Strain ER2566(New England Biolabs(NEB) 公司 )， 得到表达工程菌 pKY-MPAPO/ER2566 ； 挑取单克隆于 5mL 含 50μg/mL 卡那霉素的 Luria-Bertani(broth) 培养基 ( 简称 LB 培养基 )， 摇菌培养过夜， 再扩大， 以体 积比为 1 ∶ 100 的比例接于 1L 含 50mg/L 卡那霉素的 LB 培养基， 37℃摇菌至 OD600 为 0.6， 加入异丙基 -β-D- 硫代半乳糖苷 (IPTG)) 至终浓度 0.6mmol/L， 37℃诱导表达 6h。 8000rpm 离心 20min 收集菌体， 将菌体重悬于 60mL Buffer A 溶液 (20mM Tris-HCl， 500mM NaCI， 1mM EDTA， pH 8.0) 中， 然后用低温超高压连续流细胞破碎仪进行破碎， 破碎条件为 ： BufferA 溶 液稀释菌体的浓度为 18％ (m/v)， 破碎压力为 1700bar， 制冷温度为 3℃。
破碎产物在 4℃， 10000rpm 离心 30min， 收集上清， 该上清称为破碎上清。 SDS-PAGE 检测融合蛋白 Intein-CBD-MPAPO 的表达， 鉴定结果如图 3 所示。
取 25mL 几丁质珠 (NEB 公司产品 #S6651L) 装填 4.5×20cm 层析柱， 以 10 倍柱体 积的 BufferA 溶液洗柱 ； 破碎上清以 0.5mL/min 的流速上注 ； 用 10 倍柱体积的 Buffer A 溶 液以 2mL/min 过柱， 以洗去杂蛋白或未亲和结合的融合蛋白， 用 80mL Buffer B 溶液 (20mM Tris-HCI， 0.5M NaCl， 1mM EDTA， 50mMβ- 巯基乙醇， pH 8.0) 自然过柱， 使 β- 巯基乙醇均 匀分布并浸泡柱内填料， 然后封闭进、 出口端， 上述反应体系在 16℃反应 24h， 以诱导蛋白 内含肽的 N 端切割， 释放目的多肽 C 端硫酯。用 Buffer A 溶液洗脱并用洁净的烧杯收集目
的多肽溶液 C 端硫酯， 4℃透析过夜除去 β- 巯基乙醇并使目的多肽 C 端硫酯水解， 再经高 效液相色谱 (HPLC) 纯化、 制备得到纯度为质量百分比 95％以上的 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO， 目的多肽的制备条件为 ： 流动相 A[ 在体积百分比 10％乙腈 (CNCH3， 溶质为纯水 ) 中 添加三氟乙酸 (TFA) 得到， TFA 的终浓度为体积百分比 0.1％ ]， 流动相 B[100％乙腈 (CNCH3) 中添加三氟乙酸 (TFA)， TFA 的终浓度为体积百分比 0.1％ ]， 流速 1mL/min， 20min 线性梯度 洗脱， 线性梯度洗脱中流动相 B 由 0 ～ 60％ (v/v)， 收集目的多肽洗脱峰， 光吸收检测波长 为 218nm。目的多肽 MPAPO 的纯度通过分析性 HPLC 测定 ( 条件同目的多肽的制备条件 )。 制备的高稳定性 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO 利用质谱技术鉴定 ( 如图 4 所示 )， 质谱检 测分子量为 3404.9kDa.， 与其理论值相符合。
实施例 2
重组肽 MPAPO( 即实施例 1 制备的 MPAPO) 的体外稳定性测定
重组肽 MPAPO、 化学合成 MPAPO( 与重组肽 MPAPO 相比， 其 N 端无甲硫氨酸 ) 和野 生型 PACAP38(US Biological 公司产品 ) 以终浓度 1mg/ml 分别溶解在 20mM 磷酸钠缓冲液 (pH 8.0， 含 150mM 氯化钠 )， 37℃水浴锅中孵育， 在不同的时间点取样， 利用液相色谱 - 质谱 联用技术 (LC-MS) 检测多肽在水溶液环境中随时间的存留量， 以确定重组肽 MPAPO 在体外 水溶液环境中的稳定性， 结果如图 5 所示 ： 孵育 1 周时， 野生型 PACAP38 消减 53.2％， 孵育 2 周时， 野生型 PACAP38 消减 79.1％， 孵育 3 周和 4 周时， 野生型 PACAP38 分别消减 85.5％ 和 96.0％ ； 化学合成 MPAPO 多肽在孵育 2 周时， 消减 21.1％， 孵育 4 周时， 消减 46.9％ ； 而 重组肽 MPAPO 在孵育 2 周时， 仅消减 2.3％， 孵育 4 周时， 仅消减 7.1％。实验结果统计学处 理表明， 重组肽 MPAPO 的体外稳定性比野生型 PACAP38 提高约 30 倍， 比化学合成 MPAPO 多 肽提高约 8 倍。
实施例 3
重组肽 MPAPO 对 PAC1 受体的竞争性结合活性测定
PAC1-CHO 细胞 (Invitrogen 公司 ) 接种至 12 孔板上培养， 实验前 2h， 用 0.5mL 无 血清 Ham’ s F-12 培养基洗涤细胞两次。然后， 细胞用含 2％ (mg/ml) 牛血清白蛋白 (BSA) 和 10mM 葡萄糖的 Ham’ s F-12 培养液 4℃培养过夜， 培养液中加入 0.1nM[125I]PACAP38 和待 测多肽 ( 即为野生型 PACAP38 和重组肽 MPAPO)， 并逐步提高待测多肽浓度 (10-12M ～ 10-5M)。 培养完毕后， 弃掉上清液， 用冰冷 PBS(0.01M， pH 值为 7.4) 洗细胞 3 次， 细胞在室温下用 0.5mL 0.5M NaOH 和 0.1 ％ (mg/ml)SDS 混合 10min， 然后用 γ 计数法测定细胞裂解物放 射量， 计算重组肽 MPAPO 或野生型 PACAP38 的半抑制量 (IC50， half-maximal inhibitory concentration)， 每组实验重复 3 次， 以 1μM 不标记 PACAP38 存在时的放射量为非特异结 合量。
实验结果如图 6， 野生型 PACAP38 对 PAC1 受体的半抑制量 IC50 为 17.3±8.1nM ； 重 组肽 MPAPO 对 PAC1 受体的半抑制量 IC50 为 9.0±7.2nM ； 结果表明， 重组肽 MPAPO 对 PAC1 受体的竞争性结合活性明显高于野生型 PACAP38。
实施例 4
重组肽 MPAPO 促进 CHO-PAC1 细胞 cAMP 生成的活性测定
取对数生长期的 PAC1-CHO 细胞， PBS(0.01M， pH 值为 7.4) 洗 2 次， 调整细胞悬液 6 浓度为 1×10 个 /mL， 分别加入相同浓度的重组肽 MPAPO 或野生型 PACAP38， 调节多肽的浓度至 10-12M ～ 10-6M， 37 ℃温育 20min。再将分别被 MPAPO 和野生型 PACAP38 作用过的、 各 100μL 细胞悬浮液与 200μL 0.2M HCl 溶液， 室温放置 20min， tip 头吹打溶解细胞并混匀， 1500g 离心 10min， 吸取上清按 Cyclic AMP Enzyme Immunoassay Kit 说明测定 cAMP 的量。
实验结果如图 7， 野生型 PACAP38 对 PAC1 受体的半激活浓度 EC50(half-maximal stimulatory concentration) 为 0.52±0.12nM ； 重组肽 MPAPO 对 PAC1 受体的半激活浓度 EC50 为 0.21±0.09nM ； 结果表明， 重组肽 MPAPO 对 PAC1 受体的选择性激活活性明显高于野 生型 PACAP38。
实施例 5
重组肽 MPAPO 具有促进鼠三叉神经细胞神经突形成的功能
腹腔注射戊巴比妥钠 (40mg/kg) 麻醉昆明小鼠 ( 南方医科大学动物中心， 20 ～ 22g) 后， 经心灌注生理盐水 50mL。灌流 10min 后， 立即取三叉神经节， 然后分散在神经分 散液 (Sumitomo Bakelite Co.， Ltd.) 中以制备三叉神经细胞。在 5％ CO2 和 95％空气中， 100％相对湿度和 37℃的温度下， 在补加了 B27 补充物 (invitrogen)( 终浓度为 0.2％ w/v) 和 L- 谷氨酰胺 ( 终浓度为 1mM) 的 Neurobasal 培养基 (Invitrogen Corp) 中培养三又神 经细胞。以大约 3×103 个细胞 / 孔， 将细胞接种在 24 孔板中的聚赖氨酸包被的盖玻片上。 将重组肽 MPAPO( 终浓度为 0.1μM 和 1μM) 或野生型 PACAP38( 终浓度 ： 0.1μM 和 1μM) 加入 Neurobasal 培养基， 并且将没有加入这两种物质的 Neurobasal 培养基作为对照 ( 未添加组 )。培养 48 小时后， 用 4％ (w/v) 的低聚甲醛在室温下将小鼠三叉神经细胞固定 2 小时。用特异性识别构成神经细胞体和神经突的神经丝的抗神经丝蛋白 200 抗体和与抗 神经丝蛋白 200 抗体反应的荧光第二抗体 (TRITC 标记抗兔 IgG) 用于对固定的样品进行荧 光染色， 用荧光显微镜观察染色的细胞， 保存细胞图像。用图像分析软件 (lmage-Pro Plus ver.4.0， Planetron， Inc.) 测量染色的细胞图像中最长的神经突和细胞体主轴的长度， 测 量了每个组中 3 个孔的细胞， 神经突长度比细胞体主轴长度长 2-3 倍的细胞定义为神经突 形成细胞， 计算总细胞数目中神经突形成细胞的比例。
如图 8 所示， 对照组， 神经突形成细胞占总细胞的比例为 21.2％ ； 0.1μM 和 1μM 重组肽 MPAPO 处理组， 神经突形成细胞占总细胞的比例分别为 56.3％和 70.1％ ； 0.1μM 和 1μM 野生型 PACAP38 处理组， 神经突形成细胞占总细胞的比例分别为 43.5％和 58.2％。 统 计学分析显示， 与对照组相比， 重组肽 MPAPO 和野生型 PACAP38 处理组可显著促进三叉神经 细胞神经突的形成 (Dunnett-t 检验， N ＝ 3， P ＜ 0.01)。同时， 统计学结果表明， 与野生型 PACAP38 相比， 重组肽 MPAPO 具有更显著促进三叉神经细胞神经突的形成的作用。
实施例 6
重组肽 MPAPO 具有促进人角膜上皮细胞增殖的功能
将 重 组 肽 MPAPO 或 野 生 型 PACAP38 以 终 浓 度 1mM 溶 解 于 去 离 子 水， 然后用 EpiLife(-)(Invitrongen Biotechnology Co.， Ltd) 培养基稀释至 20μM， 作为备用测试 液。
根 据 常 规 方 法 接 种 人 正 常 角 膜 上 皮 细 胞 (ScienCell Research Laboratories.#6510)， 并且在 5％ C02、 37℃条件下培养 7 天 . 培养后， 通过常规方法收获细 胞， 以 1.0×104 个细胞 /mL 的浓度悬浮于无血清增殖培养基 EpiLife(-) 中作为细胞悬浮 液。以 0.5mL/ 孔的量将上述备用测试液分散到 24 孔板中， 同时， 将 0.5mL 细胞悬浮液接种
在 24 孔板的每个孔 ( 约 5.0×103 个细胞 / 孔 ) 中， 培养 8 天。每 48 小时更换培养基。使 用没有加入备用测试液的 EpiLife(-) 培养基作为对照。
完成培养后， 除去 24 孔板中的上清液， 用 1.0mL EpiLife(-) 培养基洗板 3 次。根 据细胞计数试剂盒 CCK-8(Dojindo Laboratories) 所述实验方法， 用微量滴定板读数器在 450nm 测量吸光度 . 对细胞的数目进行计数。计算对照组和每个测试物质添加组中吸光度 的平均值， 通过 Dunnett-t 检验比较对照组和 MPAPO 或野生型 PACAP38 处理组的差异显著 性。
如图 9 所示， 培养 8 天后， 重组肽 MPAPO 处理组的细胞数目是对照组的 1.57 倍 ； 野 生型 PACAP38 处理组的细胞数目是对照组的 1.25 倍 ； 统计学分析显示， 与对照组相比， 重组 肽 MPAPO 和野生型 PACAP38 处理组可显著促进人正常角膜上皮细胞增值 (Dunnett-t 检验， N ＝ 3， P ＜ 0.01)。同时， 统计学结果表明， 与野生型 PACAP38 相比， 重组肽 MPAPO 具有更显 著促进人正常角膜上皮细胞增值的作用。
实施例 7
重组肽 MPAPO 具有促进损伤后角膜上皮愈合的功能
腹腔注射戊巴比妥钠 (40mg/kg) 麻醉昆明小鼠 (20 ～ 25g) 后， 用环钻 (Miltex) 在小鼠完整的角膜上皮造以直径 2mm 的中央环状角膜上皮损伤面， 然后在解剖镜下用专用 于屈光手术的金刚石刀片 (Accutome) 轻轻刮掉中央环状损伤面内的角膜上皮， 不损伤角 膜基质层。损伤后角膜用 2％ (w/v) 荧光素钠染色， 并用裂隙灯拍照， 记为 0h 样本。 将角膜损伤小鼠分为对照组 ( 生理盐水处理组 )、 重组肽 MPAPO 处理组和野生型 PACAP38 处理组， 从建立角膜损伤当日到完全治愈角膜上皮损伤当日的时间段内， 连续施 用生理盐水 ( 对照组 )、 溶于生理盐水的 MPAPO( 终浓度 ： 10μM) 或溶于生理盐水的野生 型 PACAP38( 终浓度 ： 10μM)， 以每次 50μL 的量， 以 6 小时的间隔每日 4 次施用生理盐水、 MPAPO 溶液或野生型 PACAP38 溶液。为了预防感染， 在角膜损伤手术后 1 周的时间内， 在施 用生理盐水、 MPAPO 溶液或野生型 PACAP38 溶液的同时， 通过滴眼施用一滴 0.3％ (w/v) 洛 美沙星滴眼液 ( 南京天朗制药有限公司 )。
在刚刚磨损角膜上皮 (0h 样本 ) 和角膜上皮损伤后 12h、 24h、 36h、 48h 和 60h 时， 施用 0.1％荧光素钠对角膜上皮的缺损部位进行染色。用安装了钴滤光器裂隙灯对染色的 缺损部位进行拍照， 用 Image-Pro Plus version(s)4.0 软件处理数字图像， 分析各实验组 在不同时间点角膜上皮缺损面积占刚刚磨损角膜上皮缺损面积 (0h 样本 ) 的比例， 并进行 统计学分析。
如图 10 所示， 设定最初角膜上皮缺损的面积 (0h 样本 ) 是 100％， 以每个测量时间 点的剩余角膜上皮缺损面积比例 (％ ) 用作角膜上皮创伤愈合的指标。统计学分析显示， MPAPO 和野生型 PACAP38 处理组在 24h、 36h、 48h 时剩余角膜上皮缺损面积比例与对照组相 比差异性显著 (Dunnett-t 检验， N ＝ 3， P ＜ 0.01)， 可显著促进角膜上皮缺损面积比例的减 少。同时， 统计学结果表明， 与野生型 PACAP38 相比， 重组肽 MPAPO 具有更显著促进缺损角 膜上皮修复的功能。
上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING <110> 暨南大学 <120> 高稳定性 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO 及其制备方法与应用 <130>1 <160>5 <170>PatentIn version 3.5 <210>1 <211>29 <212>PRT <213>artificial sequence <220> <223> 高稳定性 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO 的氨基酸序列 <400>1 Met His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys 1 5 10 15 Gln Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Lys Lys 20 25 <210>2 <211>87 <212>DNA <213>artificial sequence <220> <223> 高稳定性 PAC1 型受体特异激动剂 MPAPO 的核苷酸序列 <400>2 atgcatagcg atggcatttt taccgatagc tatagccgct atcgcaaaca gctggcggtg 60 aaaaaatatc tggcggcggt gaaaaaa 87 <210>3 <211>45 <212>DNA <213>artificial sequence <220> <223> 引物 F1 <400>3 ggtggtcata tgcatagcga tggcattttt accgatagct atagc 45 <210>4 <211>45 <212>DNA <213>artificial sequence <220><223> 引物 F2 <400>4 ttttttcacc gccagctgtt tgcgatagcg gctatagcta tcggt <210>5 <211>54 <212>DNA <213>artificial sequence <220> <223> 引物 F3 <400>5 ccaccatgct cttccgcatt ttttcaccgc cgccagatat tttttcaccg ccag4554