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1、10申请公布号CN102070485A43申请公布日20110525CN102070485ACN102070485A21申请号201010606380522申请日20101227C07C237/22200601C07C231/24200601A61P35/0020060171申请人浙江大学地址310027浙江省杭州市西湖区浙大路38号72发明人田景奎陈润泽张琳应弘梅崔磊庞亚京戚中杰翟兴英傅之容74专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司33200代理人张法高54发明名称从中药材圆锥铁线莲中分离纯化活性成分金色酰胺醇酯的方法57摘要本发明公开了一种从药用植物圆锥铁线莲中分离纯化生物活性成分金色酰胺。
2、醇酯的方法，通过不同的中药提取方法得到圆锥铁线莲总提物，然后经过大孔树脂进行初步纯化，再经过两次硅胶柱色谱进行进一步分离得到金色酰胺醇酯粗品，金色酰胺醇酯粗品采用凝胶柱色谱纯化得到金色酰胺醇酯纯品。圆锥铁线莲具有多种生理活性，如抗肿瘤、治疗前列腺炎。本发明可以从圆锥铁线莲中分离得到一种酰胺类化合物金色酰胺醇酯，初步体外药理研究发现此化合物具有一定的抗肿瘤活性，另有研究报道此活性成分具有抗炎镇痛作用，该方法能够有效地分离得到金色酰胺醇酯单体，为进一步药理研究提供了基础。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书7页附图2页CN102070488A1/2页2。
3、1一种从药用植物圆锥铁线莲中分离纯化生物活性成分金色酰胺醇酯的方法，其特征在于它的步骤如下A将新鲜采摘的毛茛科圆锥铁线莲药材全草或茎叶于室温下阴干，切段，加入250倍体积份浓度为1100的乙醇，采用冷浸、渗漉、煎煮、超声、加热回流或微波进行提取，提取时间为015小时，过滤，药渣用上述方法再提取210次，合并提取液，回收乙醇，得到总提物浸膏；B取步骤A中总提物浸膏用120倍体积份的水稀释，上装有非极性、弱极性或中极性中的任意一种大孔树脂分离柱进行纯化，大孔树脂用量为药材量的240倍重量份，分离柱的径高比为1330，吸附流速为110BV/H；先用体积比为0150的乙醇和水洗脱120BV，流速120。
4、BV/H；再用体积比为50100的乙醇和水洗脱130BV，流速130BV/H，收集体积比为50100的乙醇和水洗脱部分，回收乙醇，得到总提物纯化部分；C取步骤B中总提物纯化部分，拌入110倍重量份100200目硅胶，将溶剂挥干得到拌样硅胶；另取10100倍重量份100200目硅胶，干法装柱，径高比为1330，将拌样硅胶加入柱顶，上加硅胶做保护层，以氯仿甲醇混合溶剂系统进行梯度洗脱，收集体积比为9915050的氯仿和甲醇洗脱液部分，薄层检识，薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为9918020的氯仿甲醇，合并并回收洗脱溶剂，得到浓缩物；D取步骤C中浓缩物，拌入110倍重量份100200目硅胶，。
5、将溶剂挥干得到拌样硅胶；另取10100倍重量份100200目硅胶，干法装柱，径高比为1330，将拌样硅胶加入柱顶，上加硅胶做保护层，以石油醚乙酸乙酯混合溶剂系统进行梯度洗脱，收集体积比为9915050的石油醚和乙酸乙酯洗脱液部分，薄层检识，薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为9918020的氯仿甲醇，合并并回收洗脱溶剂，得到浓缩物；E取步骤D中浓缩物，溶解于体积比为991199的氯仿和甲醇混合溶剂中，上SEPHADEXLH20凝胶色谱柱进行纯化，溶解后浓缩物上样体积为凝胶柱保留体积的520，采用体积比为991199的氯仿和甲醇混合溶剂进行等度洗脱，收集不同流份，薄层检识，薄层色谱条件为正向。
6、硅胶G预制板；展开剂为9918020的氯仿甲醇，合并含有金色酰胺醇酯的流份，回收氯仿和甲醇，得到金色酰胺醇酯纯品。2根据权利要求1所述的一种从药用植物圆锥铁线莲中分离纯化生物活性成分金色酰胺醇酯的方法，其特征是所述步骤A为将新鲜采摘的毛茛科圆锥铁线莲药材全草或茎叶于室温下阴干，切段，加入530倍体积份浓度为10100的乙醇，采用冷浸、渗漉、煎煮、超声、加热回流或微波进行提取，提取时间为053小时，过滤，药渣用上述方法再提取26次，合并提取液，回收乙醇，得到总提物浸膏。3根据权利要求1所述的一种从药用植物圆锥铁线莲中分离纯化生物活性成分金色酰胺醇酯的方法，其特征是所述步骤B为取步骤A中总提物浸膏。
7、用310倍体积份的水稀释，上装有非极性、弱极性或中极性中的任意一种大孔树脂分离柱进行纯化，大孔树脂用量为药材量的220倍重量份，分离柱的径高比为1510，吸附流速为15BV/H；先权利要求书CN102070485ACN102070488A2/2页3用体积比为0550的乙醇和水洗脱210BV，流速210BV/H；再用体积比为60100的乙醇和水洗脱215BV，流速215BV/H，收集体积比为60100的乙醇和水洗脱部分，回收乙醇，得到总提物纯化部分。4根据权利要求1所述的一种从药用植物圆锥铁线莲中分离纯化生物活性成分金色酰胺醇酯的方法，其特征是所述步骤C为取步骤B中总提物纯化部分，拌入24倍重量。
8、份100200目硅胶，将溶剂挥干得到拌样硅胶；另取3070倍重量份100200目硅胶，干法装柱，径高比为1520，将拌样硅胶加入柱顶，上加硅胶做保护层，以氯仿甲醇混合溶剂系统进行梯度洗脱，收集体积比为9918020的氯仿和甲醇洗脱液部分，薄层检识，薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为9919010的氯仿甲醇，合并并回收洗脱溶剂，得到浓缩物。5根据权利要求1所述的一种从药用植物圆锥铁线莲中分离纯化生物活性成分金色酰胺醇酯的方法，其特征是所述步骤D为取步骤C中浓缩物，拌入24倍重量份100200目硅胶，将溶剂挥干得到拌样硅胶；另取3070倍重量份100200目硅胶，干法装柱，径高比为1520，。
9、将拌样硅胶加入柱顶，上加硅胶做保护层，以石油醚乙酸乙酯混合溶剂系统进行梯度洗脱，收集体积比为9916040的石油醚和乙酸乙酯洗脱液部分，薄层检识，薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为9919010的氯仿甲醇，合并并回收洗脱溶剂，得到浓缩物。6根据权利要求1所述的一种从药用植物圆锥铁线莲中分离纯化生物活性成分金色酰胺醇酯的方法，其特征是所述步骤E为取步骤D中浓缩物，溶解于体积比为80202080的氯仿和甲醇混合溶剂中，上SEPHADEXLH20凝胶色谱柱进行纯化，溶解后浓缩物上样体积为凝胶柱保留体积的810，采用体积比为80202080的氯仿和甲醇混合溶剂进行等度洗脱，收集不同流份，薄层检识。
10、，薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为9919010的氯仿甲醇，合并含有金色酰胺醇酯的流份，回收氯仿和甲醇，得到金色酰胺醇酯纯品。权利要求书CN102070485ACN102070488A1/7页4从中药材圆锥铁线莲中分离纯化活性成分金色酰胺醇酯的方法技术领域0001本发明是关于中药有效成分的提取分离方法，具体涉及一种从药用植物圆锥铁线莲中分离纯化生物活性成分金色酰胺醇酯的方法。背景技术0002圆锥铁线莲CLEMATISTERNIFLORADC系毛茛科（RANUNCULACEAE）铁线莲属（CLEMATIS）植物，用于治疗扁桃体炎、咽喉炎以及风湿和类风湿性关节炎等，在日本做为中药威灵仙替代。
11、品使用，其地上部分在浙江北部地区广泛用于呼吸系统和泌尿系统炎症、肿瘤的治疗，特别是对慢性咽炎和慢性前列腺炎疗效甚佳；其地上部分的药理研究证明，黄酮及木脂素类成分具有显著的生理活性。圆锥铁线莲在民间用药中对于炎症反应和肿瘤所表现出的确切疗效激发了我们进一步研究其生物活性成分的兴趣。在药理活性相关实验的指导下，我们首次在圆锥铁线莲中分离纯化得到一种药效成分金色酰胺醇酯，此成分有文献报道具有很好的抗炎镇痛活性，其抗炎机制是通过选择性的抑制组织蛋白酶L和B来实现（KONENIVSASHIDHARA,JAMMIKUNTLANROSAIAH,ETHIKATYAGI,RAKESHSHUKLA,RAMRAGH。
12、UBIR,SIRONMRAJENDRANRAREDIPEPTIDEANDUREADERIVATIVESFROMROOTSOFMORINGAOLEIFERAASPOTENTIALANTIINFLAMMATORYANDANTINOCICEPTIVEAGENTSEUROPEANJOURNALOFMEDICINALCHEMISTRY,2009,432436KENGOISSHIKI,YASUYUKIASAI,SUMIKOTANAKA,MAKINISHIO,TOMOFUMIUCHIDA,TORUOKUDA,SABUROKOMATSUBARA,NAOKISAKURAIAURANTIAMIDEACETATE,。
13、ASELECTIVECATHEPSININHIBITOR,PRODUCEDBYASPERGILLUSPENICILLOIDESBIOSCIBIOTECHNOLBIOCHEM,2001,11951997）。此外，我们选择神经胶质瘤细胞U251和U87对金色酰胺醇酯进行了初步体外药理筛选，结果表明金色酰胺醇酯具有一定的抗肿瘤活性，其对U251和U87抑制的IC50均为25M，金色酰胺醇酯对U251和U87的抑制机制是通过诱导肿瘤细胞产生自噬来实现的。本发明提供一种从中药圆锥铁线莲中分离纯化生物活性成分金色酰胺醇酯的方法，此方法得到的金色酰胺醇酯纯度较高，其产率（纯品质量/药材质量）可达到00010。
14、1。发明内容0003本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种从药用植物圆锥铁线莲中分离纯化生物活性成分金色酰胺醇酯的方法。0004从药用植物圆锥铁线莲中分离纯化生物活性成分金色酰胺醇酯的方法的步骤如下A将新鲜采摘的毛茛科圆锥铁线莲药材全草或茎叶于室温下阴干，切段，加入250倍体积份浓度为1100的乙醇，采用冷浸、渗漉、煎煮、超声、加热回流或微波进行提取，提取时间为015小时，过滤，药渣用上述方法再提取210次，合并提取液，回收乙醇，说明书CN102070485ACN102070488A2/7页5得到总提物浸膏；B取步骤A中总提物浸膏用120倍体积份的水稀释，上装有非极性、弱极性或中极性中的任。
15、意一种大孔树脂分离柱进行纯化，大孔树脂用量为药材量的240倍重量份，分离柱的径高比为1330，吸附流速为110BV/H；先用体积比为0150的乙醇和水洗脱120BV，流速120BV/H；再用体积比为50100的乙醇和水洗脱130BV，流速130BV/H，收集体积比为50100的乙醇和水洗脱部分，回收乙醇，得到总提物纯化部分；C取步骤B中总提物纯化部分，拌入110倍重量份100200目硅胶，将溶剂挥干得到拌样硅胶；另取10100倍重量份100200目硅胶，干法装柱，径高比为1330，将拌样硅胶加入柱顶，上加硅胶做保护层，以氯仿甲醇混合溶剂系统进行梯度洗脱，收集体积比为9915050的氯仿和甲醇洗。
16、脱液部分，薄层检识。薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为9918020的氯仿甲醇。合并并回收洗脱溶剂，得到浓缩物；D取步骤C中浓缩物，拌入110倍重量份100200目硅胶，将溶剂挥干得到拌样硅胶；另取10100倍重量份100200目硅胶，干法装柱，径高比为1330，将拌样硅胶加入柱顶，上加硅胶做保护层，以石油醚乙酸乙酯混合溶剂系统进行梯度洗脱，收集体积比为9915050的石油醚和乙酸乙酯洗脱液部分，薄层检识。薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为9918020的氯仿甲醇。合并并回收洗脱溶剂，得到浓缩物；E取步骤D中浓缩物，溶解于体积比为991199的氯仿和甲醇混合溶剂中，上SEPHADE。
17、XLH20凝胶色谱柱进行纯化，溶解后浓缩物上样体积为凝胶柱保留体积的520，采用体积比为991199的氯仿和甲醇混合溶剂进行等度洗脱，收集不同流份，薄层检识。薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为9918020的氯仿甲醇。合并含有金色酰胺醇酯的流份，回收氯仿和甲醇，得到金色酰胺醇酯纯品。0005所述步骤A为将新鲜采摘的毛茛科圆锥铁线莲药材全草或茎叶于室温下阴干，切段，加入530倍体积份浓度为10100的乙醇，采用冷浸、渗漉、煎煮、超声、加热回流或微波进行提取，提取时间为053小时，过滤，药渣用上述方法再提取26次，合并提取液，回收乙醇，得到总提物浸膏；所述步骤B为取步骤A中总提物浸膏用310。
18、倍体积份的水稀释，上装有非极性、弱极性或中极性中的任意一种大孔树脂分离柱进行纯化，大孔树脂用量为药材量的220倍重量份，分离柱的径高比为1510，吸附流速为15BV/H；先用体积比为0550的乙醇和水洗脱210BV，流速210BV/H；再用体积比为60100的乙醇和水洗脱215BV，流速215BV/H，收集体积比为60100的乙醇和水洗脱部分，回收乙醇，得到总提物纯化部分；所述步骤C为取步骤B中总提物纯化部分，拌入24倍重量份100200目硅胶，将溶剂挥干得到拌样硅胶；另取3070倍重量份100200目硅胶，干法装柱，径高比为1520，将拌样硅胶加入柱顶，上加硅胶做保护层，以氯仿甲醇混合溶剂系。
19、统进行梯度洗脱，收集体积比为9918020的氯仿和甲醇洗脱液部分，薄层检识。薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为9919010的氯仿甲醇。合并并回收洗脱溶剂，得到浓缩物；所述步骤D为取步骤C中浓缩物，拌入24倍重量份100200目硅胶，将溶剂挥干说明书CN102070485ACN102070488A3/7页6得到拌样硅胶；另取3070倍重量份100200目硅胶，干法装柱，径高比为1520，将拌样硅胶加入柱顶，上加硅胶做保护层，以石油醚乙酸乙酯混合溶剂系统进行梯度洗脱，收集体积比为9916040的石油醚和乙酸乙酯洗脱液部分，薄层检识。薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为9919010的氯。
20、仿甲醇。合并并回收洗脱溶剂，得到浓缩物；所述步骤E为取步骤D中浓缩物，溶解于体积比为80202080的氯仿和甲醇混合溶剂中，上SEPHADEXLH20凝胶色谱柱进行纯化，溶解后浓缩物上样体积为凝胶柱保留体积的810，采用体积比为80202080的氯仿和甲醇混合溶剂进行等度洗脱，收集不同流份，薄层检识。薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为9919010的氯仿甲醇。合并含有金色酰胺醇酯的流份，回收氯仿和甲醇，得到金色酰胺醇酯纯品。0006本发明可以从圆锥铁线莲中分离得到一种酰胺类化合物金色酰胺醇酯，初步体外药理研究发现此化合物具有一定的抗肿瘤活性，另有研究报道此活性成分具有抗炎镇痛作用。该方法。
21、能够有效地分离得到金色酰胺醇酯单体，为进一步药理研究提供了基础。附图说明0007图1是正常的神经胶质瘤细胞电镜图；图2是药物作用后神经胶质瘤细胞电镜图；图3A是药物作用后观察到的早期自噬泡示意图；图3B是药物作用后观察到的早期双层膜结构的自噬体示意图；图3C是药物作用后观察到的正在与溶酶体发生融合的自噬体示意图；图3D是药物作用后观察到的大量的糖原结构示意图。具体实施方式0008实施例1金色酰胺醇酯的分离纯化A取圆锥铁线莲干燥后切段的全草或茎叶1000G，加入2000ML浓度为1的乙醇，加热回流提取01小时，过滤，药渣用上述方法再提取2次，合并提取液，回收乙醇，得到总提物浸膏50G；B取步骤A。
22、中总提物浸膏50G，用50ML水稀释，上装有AB8大孔树脂的分离柱进行纯化，大孔树脂用量为2000G，分离柱的径高比为13，吸附流速为1BV/H；先用体积比为01的乙醇和水洗脱1BV，流速1BV/H；再用体积比为50的乙醇和水洗脱1BV，流速1BV/H，收集体积比为50的乙醇和水洗脱部分，回收乙醇，得到总提物纯化部分10G；C取步骤B中总提物纯化部分10G，拌入10G100200目硅胶G，将溶剂挥干得到拌样硅胶；另取100G100200目硅胶G，干法装柱，径高比为13，将拌样硅胶加入柱顶，上加硅胶做保护层，以氯仿甲醇混合溶剂系统进行梯度洗脱，收集体积比为991的氯仿和甲醇洗脱液部分，薄层检识。。
23、薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为991的氯仿甲醇。合并并回收洗脱溶剂，得到浓缩物08G；D取步骤C中浓缩物08G，拌入08G100200目硅胶G，将溶剂挥干得到拌样硅胶；另取8G100200目硅胶G，干法装柱，径高比为13，将拌样硅胶加入柱顶，上加硅胶做保护层，以石油醚乙酸乙酯混合溶剂系统进行梯度洗脱，收集体积比为991的石油醚和乙说明书CN102070485ACN102070488A4/7页7酸乙酯洗脱液部分，薄层检识。薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为991的氯仿甲醇。合并并回收洗脱溶剂，得到浓缩物004G；E取步骤D中浓缩物004G，溶解于体积比为991的氯仿和甲醇混合溶剂。
24、中，上SEPHADEXLH20凝胶色谱柱进行纯化，溶解后浓缩物上样体积为凝胶柱保留体积的5，采用体积比为991氯仿和甲醇混合溶剂进行等度洗脱，收集不同流份，薄层检识。薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为991的氯仿甲醇。合并含有金色酰胺醇酯的流份，回收氯仿和甲醇，得到001G的金色酰胺醇酯纯品。0009实施例2金色酰胺醇酯的分离纯化A取圆锥铁线莲干燥后切段的全草或茎叶1000G，加入50000ML浓度为100的乙醇，加热回流提取5小时，过滤，药渣用上述方法再提取10次，合并提取液，回收乙醇，得到总提物浸膏500G；B取步骤A中总提物浸膏500G，用10000ML水稀释，上装有D101大孔树。
25、脂的分离柱进行纯化，大孔树脂用量为40000G，分离柱的径高比为130，吸附流速为10BV/H；先用体积比为50的乙醇和水洗脱20BV，流速20BV/H；再用体积比为100的乙醇和水洗脱30BV，流速30BV/H，收集体积比为100的乙醇和水洗脱部分，回收乙醇，得到总提物纯化部分100G；C取步骤B中总提物纯化部分100G，拌入1000G100200目硅胶G，将溶剂挥干得到拌样硅胶；另取10000G100200目硅胶G，干法装柱，径高比为130，将拌样硅胶加入柱顶，上加硅胶做保护层，以氯仿甲醇混合溶剂系统进行梯度洗脱，收集体积比为5050的氯仿和甲醇洗脱液部分，薄层检识。薄层色谱条件为正向硅胶。
26、G预制板；展开剂为8020的氯仿甲醇。合并并回收洗脱溶剂，得到浓缩物8G；D取步骤C中浓缩物8G，拌入80G100200目硅胶G，将溶剂挥干得到拌样硅胶；另取800G100200目硅胶G，干法装柱，径高比为130，将拌样硅胶加入柱顶，上加硅胶做保护层，以石油醚乙酸乙酯混合溶剂系统进行梯度洗脱，收集体积比为5050的石油醚和乙酸乙酯洗脱液部分，薄层检识。薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为8020的氯仿甲醇。合并并回收洗脱溶剂，得到浓缩物04G；E取步骤D中浓缩物04G，溶解于体积比为199的氯仿和甲醇混合溶剂中，上SEPHADEXLH20凝胶色谱柱进行纯化，溶解后浓缩物上样体积为凝胶柱保留。
27、体积的20，采用体积比为199氯仿和甲醇混合溶剂进行等度洗脱，收集不同流份，薄层检识。薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为8020的氯仿甲醇。合并含有金色酰胺醇酯的流份，回收氯仿和甲醇，得到01G的金色酰胺醇酯纯品。0010实施例3金色酰胺醇酯的分离纯化A取圆锥铁线莲干燥后切段的全草或茎叶1000G，加入10000ML浓度为50的乙醇，加热回流提取2小时，过滤，药渣用上述方法再提取5次，合并提取液，回收乙醇，得到总提物浸膏300G；B取步骤A中总提物浸膏300G，用3000ML水稀释，上装有DM130大孔树脂的分离柱进行纯化，大孔树脂用量为20000G，分离柱的径高比为110，吸附流速为5。
28、BV/H；先用体积比为20的乙醇和水洗脱10BV，流速10BV/H；再用体积比为60的乙醇和水洗脱10BV，流速10BV/H，收集体积比为60的乙醇和水洗脱部分，回收乙醇，得到总提物纯化部分50G；说明书CN102070485ACN102070488A5/7页8C取步骤B中总提物纯化部分50G，拌入250G100200目硅胶G，将溶剂挥干得到拌样硅胶；另取2500G100200目硅胶G，干法装柱，径高比为110，将拌样硅胶加入柱顶，上加硅胶做保护层，以氯仿甲醇混合溶剂系统进行梯度洗脱，收集体积比为8020的氯仿和甲醇洗脱液部分，薄层检识。薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为9010的氯仿甲。
29、醇。合并并回收洗脱溶剂，得到浓缩物4G；D取步骤C中浓缩物4G，拌入20G100200目硅胶G，将溶剂挥干得到拌样硅胶；另取200G100200目硅胶G，干法装柱，径高比为110，将拌样硅胶加入柱顶，上加硅胶做保护层，以石油醚乙酸乙酯混合溶剂系统进行梯度洗脱，收集体积比为8020的石油醚和乙酸乙酯洗脱液部分，薄层检识。薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为9010的氯仿甲醇。合并并回收洗脱溶剂，得到浓缩物01G；E取步骤D中浓缩物01G，溶解于体积比为8020的氯仿和甲醇混合溶剂中，上SEPHADEXLH20凝胶色谱柱进行纯化，溶解后浓缩物上样体积为凝胶柱保留体积的10，采用体积比为8020。
30、氯仿和甲醇混合溶剂进行等度洗脱，收集不同流份，薄层检识。薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为9010的氯仿甲醇。合并含有金色酰胺醇酯的流份，回收氯仿和甲醇，得到005G的金色酰胺醇酯纯品。0011实施例4金色酰胺醇酯的分离纯化A取圆锥铁线莲干燥后切段的全草或茎叶1000G，加入30000ML浓度为70的乙醇，加热回流提取4小时，过滤，药渣用上述方法再提取7次，合并提取液，回收乙醇，得到总提物浸膏400G；B取步骤A中总提物浸膏400G，用6000ML水稀释，上装有ADS7大孔树脂的分离柱进行纯化，大孔树脂用量为30000G，分离柱的径高比为120，吸附流速为7BV/H；先用体积比为40的乙。
31、醇和水洗脱15BV，流速15BV/H；再用体积比为70的乙醇和水洗脱20BV，流速20BV/H，收集体积比为70的乙醇和水洗脱部分，回收乙醇，得到总提物纯化部分60G；C取步骤B中总提物纯化部分60G，拌入420G100200目硅胶G，将溶剂挥干得到拌样硅胶；另取4200G100200目硅胶G，干法装柱，径高比为120，将拌样硅胶加入柱顶，上加硅胶做保护层，以氯仿甲醇混合溶剂系统进行梯度洗脱，收集体积比为9010的氯仿和甲醇洗脱液部分，薄层检识。薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为955的氯仿甲醇。合并并回收洗脱溶剂，得到浓缩物5G；D取步骤C中浓缩物5G，拌入35G100200目硅胶G，。
32、将溶剂挥干得到拌样硅胶；另取350G100200目硅胶G，干法装柱，径高比为120，将拌样硅胶加入柱顶，上加硅胶做保护层，以石油醚乙酸乙酯混合溶剂系统进行梯度洗脱，收集体积比为9010的石油醚和乙酸乙酯洗脱液部分，薄层检识。薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂为955的氯仿甲醇。合并并回收洗脱溶剂，得到浓缩物008G；E取步骤D中浓缩物008G，溶解于体积比为7030的氯仿和甲醇混合溶剂中，上SEPHADEXLH20凝胶色谱柱进行纯化，溶解后浓缩物上样体积为凝胶柱保留体积的15，采用体积比为7030氯仿和甲醇混合溶剂进行等度洗脱，收集不同流份，薄层检识。薄层色谱条件为正向硅胶G预制板；展开剂。
33、为955的氯仿甲醇。合并含有金色酰胺醇酯的流份，回收氯仿和甲醇，得到002G的金色酰胺醇酯纯品。0012下面实验例用于进一步说明但不限于本发明。说明书CN102070485ACN102070488A6/7页90013实验例1金色酰胺醇酯的纯度检查采用高效液相色谱的方法检查纯度。仪器WATERS2695高效液相色谱仪DAD紫外检测器（USA）。色谱柱RP18色谱柱，250MM46MM（USA）。流动相乙腈01磷酸水（梯度洗脱）。流速10ML/MIN。柱温室温。检测波长211NM。进样量10L。保留时间（RT）金色酰胺醇酯为5070MIN。色谱图记录时间82MIN。面积归一化法测纯度，得到金色酰胺。
34、醇酯的纯度为988。0014实验例2金色酰胺醇酯的结构鉴定熔点仪为X4数字显示显微熔点测定仪（北京泰克仪器有限公司）；紫外（UV）光谱采用WINSP50型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）测定；红外（IR）光谱采用SHIMADZUIR408型红外光谱仪测定；核磁共振氢谱和碳谱（1HNMR和13CNMR）采用DRX400核磁共振谱仪测定；质谱（MS）采用FTICR型质谱仪（USA）测定。0015上述分离纯化方法所得到的金色酰胺醇酯纯品为白色絮状结晶或粉末，熔点180185OC。UVMAX（NM）213，240。IRMAX（CM1）3410，1735，1670，1665。MS（M/Z）46。
35、7（MNA），445（M1）。1HNMR（）201（3H，S，CH3），281（2H，M，CH2），298（2H，M，CH2），385（1H，DD，CH2），400（1H，DD，CH2），416（1H，QUA，CH），469（1H，SEX，CH），712（2H，苯环H），723728（6H，苯环H），731（2H，苯环H），744（2H，苯环H），751（1H，苯环H），779（2H，苯环H），812（1H，D，NH），847（1H，D，NH）。13CNMR（）206（CH3），365（CH2），371（CH2），491（CH），548（CH），646（CH2），1262（2CH，苯环C），1。
36、274（2CH，苯环C），1280（2CH，苯环C），1281（2CH，苯环C），1282（2CH，苯环C），1291（4CH，苯环C），1312（CH，苯环C），1340（C，苯环C），1380（C，苯环C），1383（C，苯环C），1660（CO），1702（CO），1711（CO）。0016以上波谱数据与文献报道一致，金色酰胺醇酯分子结构如下实验例3金色酰胺醇酯的体外抗肿瘤实验选用神经胶质瘤细胞U251和U87进行抗肿瘤活性筛选。取对数生长期的细胞，按合适的细胞密度以每孔100微升细胞液的体积接种到96孔板，接种后培养24H，处理组加入不同浓度的含药培养液（至少5个浓度梯度），每孔100。
37、微升，每个浓度至少3次重复，对照组加说明书CN102070485ACN102070488A7/7页10入不含药的空白培养液100微升，对照组至少重复3次，药物作用4872H之后吸掉培养液，每孔加入MTT液体15微升，孵育4H后吸掉MTT，加入150微升DMSO，震荡溶解，570NM下测定吸光值A，计算不同浓度的抑制率及IC50值。此方法测得金色酰胺醇酯对U251和U87抑制的IC50均为25M。0017实验例4探讨金色酰胺醇酯肿瘤抑制作用机制的实验金色酰胺醇酯对肿瘤细胞作用4872H之后采用电镜观察其亚细胞结构的变化，电镜结果如下（图1为正常细胞，图2为药物作用后细胞，图3为图2的局部放大）从图3可以观察到早期自噬泡A；早期双层膜结构的自噬体B；正在与溶酶体发生融合的自噬体C；以及大量的糖原结构D。电镜结果从亚细胞结构层面说明了金色酰胺醇酯对神经胶质瘤细胞的抑制作用是通过自噬来实现的。说明书CN102070485ACN102070488A1/2页11图1图2说明书附图CN102070485ACN102070488A2/2页12图3说明书附图CN102070485A。