富脂质营养物治疗术后肠梗阻的应用 【技术领域】
本发明涉及用于预防和 / 或治疗术后肠梗阻 (POI) 的营养组合物领域。背景技术 术后肠梗阻是通常在有肠操作的腹部手术后观察到的病理状态。 该状态的特征在 于不存在机械性肠梗阻的情况下的普遍的胃肠道运动不足和胃排空延迟， 导致发病率增加 和住院时间延长 [1， 2]。 肠道处理导致收缩性受损和胃肠道运输延迟， 从而导致肠内气体和 流体积累。术后肠梗阻经常发生于腹膜内手术后， 但其也可能发生于腹膜后手术和腹腔外 手术后。在结肠手术后观察到发生持续时间最长的术后肠梗阻。术后肠梗阻的临床后果可 能是深远的。患有术后肠梗阻的患者被固定， 具有不适和疼痛， 并且肺部并发症风险增加。 此外， 由于营养贫乏， 术后肠梗阻增强分解代谢。 总体上， 术后肠梗阻使住院时间延长 ； 根据 1990 年的 Livingston 的报告， 其在美国每年耗费 7.5 亿美元 ( 每位患者 1500 美元 )[1]。
术后肠梗阻的发病机理由两阶段过程组成， 其中涉及神经元机制和炎症机制。神 经通路和神经肽的释放在持续若干分钟至若干小时的肠梗阻早期起重要作用 [3-5]， 而炎 症导致持续若干小时至若干天的持续期 [5-7]。在大鼠以及在人类中， 手术干预中的肠 操作导致显著的肠肌层内炎症反应。炎症程度与术后胃肠道运动不足的水平直接成正比 [7-10]。目前， 没有对术后肠梗阻的有效治疗， 且干预依赖于支持性措施 [6， 11]。目前， 在 肠操作的鼠类模型中已经证明， 对胆碱能抗炎通路的电刺激或药理学刺激通过激活炎症细 胞上的烟碱型乙酰胆碱受体 α7 亚单位 (α7-nAChR) 有效地减少肠肌层内的炎症反应并减 弱胃肠道运动不足 [12-14]。激活胆碱能抗炎迷走神经通路的更为生理性的方法是给药富 脂质肠外营养物 [15]。在非致命出血性休克模型中， 用富脂质营养物的干预通过经由胆囊 收缩素 (CCK) 激活自主神经系统 [15] 非常有效地抑制系统性炎症 [16， 17]。 发明人现已发 现通过使用富脂质营养物的干预可以减弱术后肠梗阻。
WO 03/009704(Nutricia) 公开了包含比例为 3-90 ∶ 3-80 ∶ 1 的磷脂、 甘油三酯 和胆固醇的脂质组合物用于治疗败血症的应用， 所述败血症可能与大手术、 重大疾病、 炎性 肠病等有关， 由细菌引起。未公开术后肠梗阻的治疗。
WO 04/068969(Nutricia) 类似地公开了用于治疗败血症和相关疾病的脂质组合 物的应用和制备方法， 所述脂质组合物包含比例大于 1 的磷脂和甘油三酯而不含胆固醇。 未公开术后肠梗阻的治疗。
WO 2006/052134(Nutricia) 公开了用于迅速减弱炎症反应的包含磷脂和甘油三 酯的脂质组合物的应用和制备方法。既未具体地公开术后肠梗阻的治疗， 也未实验性地记 录术后肠梗阻的治疗。
发明内容
本发明的目的是提供对患者的营养性支持， 所述患者已经暴露于或将暴露于术后 肠梗阻的风险或者具有经受术后肠梗阻相关的并发症的风险或已经经受术后肠梗阻相关的并发症。提供营养性支持是可行的， 并特别地防止术后肠梗阻的发展。
因此， 本发明将解决的问题是提供药学组合物， 优选营养性组合物， 所述组合物能 够避免术后肠梗阻， 或改善或减少术后肠梗阻的影响， 特别是与医学干预如大手术、 移植手 术、 重建手术、 探知手术、 内窥镜手术如使用导管的肠道检查、 施用于腹腔器官的微创手术、 腹膜内手术、 腹膜后手术、 腹腔外手术等有关的术后肠梗阻。 具体实施方式
根据本发明， 向有需要的人给药包含占组合物总能量的 42 至 90％的至少一种脂 质组分的营养组合物， 该组分能够刺激传出迷走神经活性， 导致抑制腹腔灌洗中的 IL-6 和 TNF-α 水平， 和减少 MPO- 阳性细胞 (c.q. 肠肌层中的嗜中性粒细胞 ) 的流入， 导致完全不 存在或部分地不存在与术后肠梗阻相关的副作用如前述的胃肠道运动不足和胃排空延迟。
本发明从而涉及用于预防和 / 或治疗术后肠梗阻的包含占组合物总能量的 42 至 90％的至少一种脂质组分的营养组合物， 或 ( 以作为选择的形式 ) 涉及包含占组合物总能 量的 42 至 90％的至少一种脂质组分的营养组合物在制备用于预防和 / 或治疗术后肠梗阻 的药物或药用营养物中的应用， 或 ( 以作为选择的形式 ) 涉及治疗和 / 或预防方法， 其中向 有需要的人给药用于预防和 / 或治疗术后肠梗阻的包含占组合物总能量的 42 至 90％的至 少一种脂质组分的营养组合物。应注意， 设计各种作为选择的形式以遵守不同司法体系的 不同专利法， 如欧洲和美国专利法系， 但是意味着具有相同的范围， 从而是可以互换的。 在本发明的上下文中， 将组合物总能量的百分数缩略为能量％并用于代表化合物 的能量值， 其基于由该化合物的可消化部分提供的能量 ( 特别是在人类或其他哺乳类中 )。 特别地， 能量值是基于蛋白质类物质 ( 包括蛋白质、 肽和氨基酸 )、 脂质和可消化的碳水化 合物的贡献， 使用以下计算因子 ： 可消化的碳水化合物和蛋白质类物质为 4 千卡 /g 且脂质 为 9 千卡 /g。
脂质组分
基于总脂质组分的重量， 可以根据本发明使用的脂质组分优选地包含至少 6 重 量％且至多 50 重量％的磷脂。特别优选的总脂质组分的磷脂含量为脂质组分的 8 至 50 重 量％， 特别是 10 至 35 重量％， 最优选 12 至 30 重量％。磷脂可以包括任何具有至少一条长 链 ( ≥ C16) 脂肪族酰基残基的磷酸甘油衍生物， 包括二酰基 ( 磷脂 ) 和单酰基 ( 溶血磷脂 ) 衍生物， 如磷脂酰乙醇胺 (PE)、 磷脂酰胆碱 (PC)、 磷脂酰丝氨酸 (PS)、 磷脂酰肌醇 (PI)、 磷 脂酰甘油 (PG)、 磷脂酸 (PA) 等， 及其溶源性类似物。优选地， PE 和 PC 占脂质组分的至少 3 重量％， 最优选地， 至少 6 重量％， 和 / 或磷脂的至少 30 重量％， 特别地， PC/PE 的比例为 10 ∶ 1 至 1 ∶ 1， 更特别地， 为 5 ∶ 1 至 1.2 ∶ 1。优选地， PS 的水平低于总磷脂的 10 重 量％， 特别地， 低于 2 重量％。认为磷脂中脂肪酸的性质对观察到的作用不重要。通常， 磷 脂中的脂肪酸包含少于 90 重量％， 优选地， 少于 80 重量％的亚油酸， ω-3 多不饱和脂肪酸 特别是二十碳五烯酸 ( 花生五烯酸 )、 二十二碳六烯酸 ( 鱼油酸 ) 的量少于 30 重量百分比， 优选 2 至 26 重量％。
除了磷脂以外， 脂质组分还包括甘油酯组分。该组分可以包括单酸甘油酯、 甘油 二酯和甘油三酯。优选地， 为了利于迅速消化， 部分甘油酯组分包括脂肪酸的单酸甘油酯 和 / 或甘油二酯。还发现单酸甘油酯和甘油二酯有助于给药较大量的脂质， 而不过度地增
加组合物的热量。通常地， 脂质组分中单酸甘油酯和甘油二酯的总量为脂质组分的 2 至 80 重量％。优选地， 单酸甘油酯和甘油二酯的总量为脂质组分的 2 至 50 重量％， 更优选地， 4 至 20 重量％。单独地， 甘油二酯优选地占脂质组分的 1 至 40 重量％， 更优选地， 2 至 20 重 量％ ； 优选地， 单酸甘油酯占脂质组分的 0 至 30 重量％， 更优选地， 1 至 15 重量％。脂质组 分的剩余部分可以由甘油三酯组成。通常地， 脂质组分中甘油三酯含量为脂质组分的 20 至 98 重量％。特别地， 脂质组分中甘油三酯含量为 20 至 90 重量％， 特别是 30 至 60 重量％。
脂质组分的脂肪酸组合物优选地主要 ( 即大于 75 重量％ ) 由链长为 16 或 18 个 碳原子的脂肪酸组成。
优选地， C18 脂肪酸含量为 45 至 95 重量％， 更优选地， 为 55 至 95 重量％， 最优选 地， 为 70 至 94 重量％。在 C18 脂肪酸中， 优选地， 10 至 50 重量％， 特别地， 15 至 50 重量％ 由多不饱和脂肪酸特别是亚油酸和 o- 亚麻酸组成。由于其降低的稳定性 ( 异味 )， γ- 亚 麻酸 (ω-6 十八碳三烯酸， GLA) 和硬脂艾杜糖酸 (ω-3 十八碳四烯酸， SA) 的水平较低， 即 GLA 和 SA 一起优选地少于脂肪酸组合物的 6 重量％， 特别地， 少于 2 重量％。
脂肪酸的剩余部分可以由优选地量为 0 至 20 重量％， 更优选地， 0 至 6 重量％， 特 别地， 少于 3 重量％的链长为 8、 10 或 12 个碳原子的中链脂肪酸， 以及豆蔻酸 (C 14:0) 形 成。 饱和脂肪酸豆蔻酸、 棕榈酸和硬脂酸的量通常为 1 至 30 重量％， 优选地， 5 至 25 重量％， 更优选地， 16 至 22 重量％。链长为 20 或更多的长链脂肪酸的量为 0 至 12 重量％， 特别是 1 至 6 重量％。 如果存在的话， 长链脂肪酸可以包括花生五烯酸 (ω-3 二十碳五烯酸， EPA)、 鰶油酸 (ω- 二十二碳五烯酸 ) 和鱼油酸 (ω-3 二十二碳六烯酸， DT-TA)， 尽管由于其有限 的稳定性， 其含量不能太高。对于 EPA、 GLA 和 SA 的总量而言， EPA 含量优选多于 50 重量％， 对于相同的 EPA、 GLA 和 SA 的总量， SA 含量优选少于 15 重量％， 优选少于 10 重量％， 更优 选少于 6 重量％。优选地， 不应包含水平超过脂质组分 0.5 重量％的胆固醇， 优选地， 不存 在胆固醇。
尽管脂质组分可以为将根据本发明使用的组合物的唯一的能量载体， 但优选地， 组合物还包含碳水化合物和 / 或蛋白质， 优选地， 至少蛋白质。脂质组分对总组合物的能量 贡献优选地为 42 至 90 能量％， 更优选为 44 至 75 能量％， 最优选为 45 至 60 能量％。因 而， 本发明还涉及除了脂质外进一步包含蛋白质和碳水化合物的营养组合物在制备用于预 防和 / 或治疗术后肠梗阻的药物或药用营养物中的应用， 其中， 脂肪占组合物的总能量含 量的 42 至 90％， 特别是 45 至 60％。
蛋白质组分
营养组合物可以进一步包含蛋白质组分。 根据本发明将使用的蛋白质组分优选地 选自乳蛋白和大豆蛋白。乳蛋白优选地为完整蛋白质。如蛋白可以仅为酪蛋白或仅为乳清 蛋白， 或其混合物。在混合物中， 酪蛋白与乳清蛋白的重量比可以为例如 6 ∶ 1 至 1 ∶ 6。 优选地， 蛋白质组分的至少 18 重量％， 特别地， 40 至 100 重量％， 特别地， 55 至 90 重量％由 乳清蛋白组成。在优选的实施方案中， 乳清蛋白包含较高比例的 α- 乳清蛋白， 优选地， 至 少 10 重量％， 特别地， 20 至 90 重量％， 更优选地， 36 至 70 重量％的 α- 乳清蛋白。乳清蛋 白中 α- 乳清蛋白与 β- 球蛋白的重量比范围为 1-100 ∶ 1， 优选地， 5-20 ∶ 1， 更优选地， 6-16 ∶ 1。可以使用本领域熟知的方法， 如通过分离脂质和酪蛋白组分和使用色谱方法分 离不同的乳清蛋白， 而增加 α- 乳清蛋白的含量。可商购获得纯 α- 乳清蛋白和富 α- 乳清蛋白的乳清提取物。优选地， 蛋白质组分的 α- 乳清蛋白的含量为至少 5 重量％， 更优选 地， 10 至 60 重量％。
作为选择地， 至少 40 重量％或甚至大部分 ( ＞ 50 重量％ ) 或整个蛋白质组分可 以由水解大豆蛋白形成。 可以用胃蛋白酶、 胰蛋白酶、 胰凝乳蛋白酶或其他可商购的蛋白酶 或其混合物水解大豆蛋白。
更优选地， 通过使大豆蛋白至少经受胃蛋白酶的处理而使其水解。水解度优选地 使得至少 50 重量％的水解物具有少于 10kDa 的分子量或至少 50 重量％由少于 90 个氨基酸 的肽组成。产品中存在这些特别的蛋白质可以增加脂质组分对迷走神经作用的持续时间， 由此减少脂质的量或富脂质产品的给药频率。
除了牛奶蛋白和 / 或水解大豆蛋白以外， 特定的氨基酸也可以有利地存在于蛋白 质组分中。优选的氨基酸包括谷氨酸根、 谷氨酰胺、 苯丙氨酸和色氨酸。这些氨基酸可以以 例如单独的氨基酸的形式存在， 但优选地以较小的肽的形式存在， 所述较小的肽选自已知 是这些氨基酸的丰富来源的特定蛋白质。通常的肽链长度为 2 至 90， 优选地， 2 至 40， 更优 选地， 2 至 20 个氨基酸单位。 适宜的谷氨酸根的来源的实例为谷氨酸单钠、 谷氨酸单钾或谷 氨酸镁或谷氨酸钙或其混合物。可以通过以盐或肽物质的形式向每 100g 蛋白质加入大于 0.2g 谷氨酸盐来源， 优选地， 每 g 蛋白质加入 0.5 至 3g， 而增加产品中谷氨酸根的量， 这将 通常使得谷氨酸根的含量大于蛋白质的 16 重量％， 优选地， 17 至 20 重量％。 色氨酸水平通 常大于蛋白质的 1.6 重量％， 优选地， 1.7 至 3.5 重量％， 最优选地， 1.9 至 2.8 重量％。可 以通过加入大于蛋白质的 0.2 重量％， 优选地， 0.5 至 3 重量％的苯丙氨酸来源， 而增加苯丙 氨酸水平， 使得苯丙氨酸水平通常为蛋白质的 5.7 至 8 重量％。 在一个实施方案中， 蛋白质组分优选地不包含有效量的完整的未变性的 IgY 免疫 球蛋白。通常， IgY 的浓度小于每日剂量 200μg 或小于每升产品 200μg， 或小于每 100g 蛋 白质 200μg， 优选地， 小于每日剂量或每升产品或每 100g 蛋白质 100μg。另一方面， 有益 地是包括 10 至 50 重量％， 优选地， 20 至 46 重量％的完整的乳清蛋白作为糖巨肽。因而， 乳 清蛋白优选地来自甜乳清。
蛋白质组分对总组合物的能量贡献优选地为 6 至 50 能量％， 更优选地， 10 至 40 或 15 至 40 或甚至 17 至 35 能量％， 最优选地， 20 至 30 能量％， 或作为选择地， 10 至 25 能 量％。
碳水化合物
本发明的营养组合物可以进一步包含可消化的碳水化合物组分。 碳水化合物组分 贡献组合物的 0 至 50 能量％， 优选 4 至 40 能量％或 10 至 40 能量％， 最优选 20 至 36 能 量％。碳水化合物可以包括麦芽糊精、 葡萄糖糖浆、 水解淀粉、 可溶性淀粉、 单糖如葡萄糖、 果糖、 半乳糖、 甘露糖等， 以及二糖如蔗糖和乳糖。没有优选的特定的混合物， 最终产品的 渗透值优选地低于 400mOsm/ 升， 特别是在 250-380mOsm/ 升范围内。如果其意图由患有乳 糖不难受的人服用， 则该产品不包含乳糖。碳水化合物与脂质的比优选地为 1 ∶ 0.81 至 1 ∶ 5， 更优选为 1 ∶ 1.0 至 1 ∶ 4， 以能量计。对产品中蛋白质、 脂质和碳水化合物的这些 要求使得热量的相对贡献为蛋白质∶脂质∶碳水化合物＝ 0.45-2 ∶ 0.8-5 ∶ 1， 优选为 0.6-1.8 ∶ 0.9-4.5 ∶ 1， 更优选为 1-1.6 ∶ 1-4 ∶ 1。
矿物质和维生素
本发明的组合物可以进一步包含其他营养成分例如维生素和矿物质， 如维生素、 矿物质等的推荐量的 0.2 至 1.0 倍的量。 由于其感官性质， 其优选包括甜菜碱而非胆碱。 作 为甜菜碱的来源， 可以使用释放本发明需要量的甜菜碱的任何食品级成分。实例包括无水 或水合形式的合成甜菜碱内盐， 其盐如 HCl 盐和其他酸的混合物， 所述其他酸例如为碳酸、 己二酸、 辛二酸、 癸二酸、 硫酸、 醋酸、 柠檬酸、 苹果酸和酸性氨基酸如任何水合形式的天门 冬氨酸和谷氨酸。 同时， 可以使用植物或动物材料的提取物， 如来自甜菜的提取物和甜菜碱 和胍乙酸盐的混合物。然而， 优选使用甜菜碱的内盐或与有机酸如柠檬酸和苹果酸或氨基 酸的盐。特别地， 优选天门冬氨酸盐和和甜菜碱的盐。单独地， 甜菜碱的量优选地为 0.2 至 20 重量％， 优选为 0.4 至 10 重量％， 最优选为 0.5 至 5 重量％ ( 以干物质计 )。如果组合， 则甜菜碱 / 胆碱的重量比优选地至少大于 1， 更优选为 1.5 至 9。
肉碱和肌醇是有利地存在于组合物中的其他成分。肉碱的适宜来源为 D- 或 L- 型 的食品级成分或其混合物。肉碱来源优选地为烷酰基肉碱， 如丙酰基、 乙酰基、 异丁酰基或 异戊酰基、 或异丙基或异戊酰基肉碱。适宜的量为每升产品 0.1 至 2g。肌醇可以为食品级 质量的肌醇。适宜的量为每升产品 10 至 1000mg。
膳食纤维 所述组合物还优选地包含膳食纤维 ( ＝难消化的或不能消化的碳水化合物 )。优 选的量为总干重量的 0.5 至 5 重量％。膳食纤维可以包含寡糖如寡果糖包括菊粉、 半乳寡 糖、 阿拉伯寡糖和木寡糖等及其组合， 可溶性非淀粉多糖如半乳聚糖胶、 ( 半乳 / 葡 ) 甘露聚 糖胶、 木葡聚糖胶、 β- 葡聚糖、 果胶等， 以及不溶性多糖如纤维素、 半纤维素、 和抗性淀粉。 特别地， 需要可溶性纤维成分， 如 0.5 至 4 重量％。有益的是将益生元与益生菌如乳杆菌特 别是鼠李糖乳杆菌、 双歧杆菌类和丙酸菌组合， 从而增加对免疫系统的作用。 在产品具有液 体形式的情况下， 优选地在食用不久前将益生菌加入液体产品， 或在同一餐中单独给药益 生菌。在产品为含水量低于 4 重量％， 优选地， 低于 2 重量％的干产品的情况下， 益生菌成 分可以由冻干物质组成， 该物质每克成分包含 108 至 1010 个活或死细菌或每克成分包含至 少 0.5g 细菌碎片。
其他成分
所述组合物还可以进一步包含碳酸盐组分。适宜的成分包括碳酸盐和 / 或碳酸氢 盐， 如钠、 钾、 镁、 铵和 / 或锌盐。液体产品以及最终产品的矿物质组合物的最终 pH 将决定 溶液中的相对量。在产品的制备中加入的碳酸盐组分的量优选地为制剂的干质量的 0.1 至 2 重量％， 从而刺激产品的消化。溶液中产品的最终 pH 等于 4 至 8， 优选地， 5 至 7。还优选 的是组合物包含基于干物质的 1 至 10 重量％， 更优选地， 1.5 至 6 重量％的可可块。这有 助于大量成分 (macro ingredient) 的水平， 因为可可的适宜成分提供 18 至 22 重量％的蛋 白质， 20 至 30 重量％的脂质， 8 至 12 重量％的可消化的碳水化合物和 20 至 34 重量％的纤 维。包含物改善适口性并增加制剂的作用。
给药单位
当在人类中使用时， 组合物优选地为适宜肠内给药的液体组合物。对于患者的完 全营养物， 组合物的能量密度可以为 0.75 至 1.75 千卡 /ml(3.14-7.32kJ/ml)， 优选地， 0.96 至 1.44 千卡 /ml(4.0-6.0kJ/ml)。例如， 100ml 液体组合物可以包含 5 至 10g 蛋白质， 4至 10g 脂质， 4 至 14g 可消化的碳水化合物和 60 至 5000mg( 优选 70 至 3500mg， 更优选 100 至
2500 或甚至 200 至 2000mg) 的甜菜碱 ( 或胆碱 )。组合物可以包含液体营养物中常见的微 量元素、 维生素和矿物质。不需要采取特殊的手段如胶囊化或微粉化盐以实现本发明的作 用。
本发明的组合物可以为补充物或完全营养物， 并意图用于肠内应用。 因此， 其可以 通过饮用或管饲应用。 当产品为用于药学目的的补充物时， 其将以更少的量使用， 且因而更 加浓缩。通常， 其每毫升将提供 1 至 4 千卡， 优选地， 1.4 至 3 千卡 /ml。除了本发明的蛋白 质和脂质组分外， 营养补充物还可以任选地包括有益于特定患者的营养性组分。这些可以 为药物， 也可以为有利于治疗特定矿物质、 微量元素和维生素和碳酸盐组分缺乏症的营养 物。
当用于动物营养中时， 产品将为液体、 浆或干产品的形式， 后者优选地为颗粒剂或 小球剂。用于动物营养物制剂中的成分不同于用于人类营养物制剂中的成分， 但为本领域 熟知的， 并且包括大豆、 乳制品、 鱼粉、 羽粉、 血粉、 蛋、 纯氨基酸、 骨粉、 磷酸钙、 石灰石、 矿物 质、 维生素、 微量元素、 玉米、 豆类、 谷类如小麦、 大麦、 黑麦、 燕麦 ( 片 )、 菜籽粕、 羽扇豆、 玉 米胚芽、 向日葵、 甜菜浆、 糖蜜、 可可块、 糊化淀粉、 马铃薯等或其部分。 用于仔猪的通常的营 养物每 100g 干物质包含 1.3-1.9MJ、 16 至 22g 粗蛋白 ( 其中至少 6.5 重量％为赖氨酸 )、 0.5 至 5g 粗纤维， 但根据本发明， 通过混合所述成分， 符合如权利要求中定义的蛋白质、 脂 质、 可消化碳水化合物和其他部分的相对组成。用于仔猪的液体制剂每 100m 通常将包含 4.8 至 5.8g 粗蛋白， 4.8 至 5.5g 乳糖 ( 除脂质以外 )， 0.6 至 1.0g 灰分和维生素以及任选存 在的其他组分。基于脂肪酸的含量， 仔猪营养物中的脂质组分通常将包含 45 至 85 重量％， 优选 55 至 75 重量％的链长为 18 的脂肪酸， 并且在具体的乳猪营养物的情况下， 将包含 50 至 80， 优选地， 55 至 75 重量％的油酸。在后者的情况下， 长链多不饱和脂肪酸的量少于 25 重量％， 优选为 5 至 18 重量％。
给药
在一个具体的实施方式中， 可以在手术前给药所述产品， 优选在手术前 24 小时至 5 分钟， 特别是在手术前 8 小时至 30 分钟， 或甚至在手术前 4 小时至 15 分钟， 特别是在手术 前 90 分钟至 15 分钟， 给药所述产品。在其中患者的病情以某种方式恶化或改变以至于营 养干预是有益的的那些情况下， 可以在手术前大于 24 小时给药所述产品。
在另一个具体的实施方式中， 可以在手术后， 优选在手术后 5 分钟至 3 天， 或在手 术后 5 分钟至 2 天， 或在手术后 5 分钟至 1 天， 优选在术后肠梗阻的作用发生前， 优选直到 监督到任何和所有副作用时， 特别是直到活动性已恢复时， 给药所述产品。在其中患者的 病情没有以某种方式基本上改善、 恶化或改变以至于长时间的营养干预是有益的那些情况 下， 可以在手术后大于 3 天给药所述产品。
特别地， 本发明的方法可用于预防肠梗阻， 即消化道运动减少， 如由手术导致的引 起绞痛、 呕吐和便秘的肠梗阻。 附图说明
图 1. 试验草案。大鼠在操作 18 小时前绝食 (FD)。在 t ＝ 0 时， 麻醉大鼠， 并进 行肠操作 (M)。在 20 分钟、 3 小时或 24 小时 ( ) 处死动物。操作前 30 分钟施用 CCK 受体 拮抗剂 (CCK ra)。通过处死前一小时口服给药罗丹明测量胃肠道运输 (Rho)。在操作后 6小时使大鼠 ( 其在 24 小时处死 ) 自由地获取标准啮齿动物食物 (Chow)。在喂食组， 在 -18 小时 (3ml ； 其他时间点 0.75ml)、 -2 小时、 -45 分钟、 +45 分钟、 +90 分钟时经口管饲给药液 体富脂质营养物或对照的低脂质营养物。
图 2. 肠操作导致操作 20 分钟后 MCP-II 明显增加。与禁食动物相比， 给药富脂 质营养物 (LE) 和低脂质营养物 (LL) 减少 MCP-II 的血浆水平 ( 分别地， p ＝ 0.07 和 p ＝ 0.15)。数据以平均值 ±SEM 表示。与剖腹术相比， #p ＜ 0.01(n ＝ 6)。
图 3. 富脂质营养物抑制定居巨噬细胞的炎症反应。肠操作导致手术三小时后 TNF-α(A) 和 IL-6(B) 的腹膜水平增加。与喂食低脂质 (LL) 和禁食的大鼠相比， 富脂质营 养物 (LE) 抑制操作引起的 TNF-α 和 IL-6 的释放。数据以平均值 ±SEM 表示。ND ； 不可检 * ** 测的， 与禁食相比 p ＜ 0.01， 与低脂质饮食相比 p ＜ 0.01(n ＝ 6)。
图 4. 富脂质营养物 (LE) 防止嗜中性粒细胞流入肠肌层。(A) 操作组与剖腹术组 对比的显著的嗜中性粒细胞的流入， 以空肠组织髓过氧化物酶 (MPO) 水平表示。与喂食低 脂质 (LL) 和禁食大鼠相比， 给药 LE 显著地防止嗜中性粒细胞流入。 这通过与禁食大鼠 (B) 相比， 用富脂质营养物处理的大鼠 (C) 肠肌层中的 MPO 阳性细胞 ( → ) 的减少而组织学地 确认。数据以平均值 ±SEM 表示。与剖腹术相比 #p ＜ 0.01， 与禁食相比 *p ＜ 0.05， 与低 ** 脂质营养物相比 p ＜ 0.05(n ＝ 6)。
图 5. 用富脂质营养物干预改善经操作的动物的胃肠道运输。(A) 肠操作导致 GC 减少， 说明胃肠道运输的损失。 与禁食动物相比， 给药富脂质营养物 (LE) 改善 GC， 然而低脂 质营养物 (LL) 表明没有改善。(B) 胃中 (S) 的罗丹明分布以及沿 10 段相等的小肠 (1 ： 近 十二指肠至 10 ： 回肠末端 ) 的罗丹明分布。与禁食大鼠相比， LE 加速胃排空并增强肠道运 输。GC 以中值、 第 25 和第 75 百分位数和极值表示， 罗丹明分布以平均值表示。与剖腹术相 * 比 #p ＜ 0.01， 与禁食相比 p ＜ 0.05(n ＝ 6)。
图 6.CCK 受体拮抗剂消除 (abrogate) 富脂质营养物对操作导致的炎症反应和胃 肠道运动不足的抑制作用。(A) 操作动物中的空肠组织 MPO 水平。给药 CCK 受体拮抗剂完 全阻滞富脂质营养物 (LE) 的抗炎作用， 而载体没有。(B)CCK 受体拮抗剂消除富脂质营养 物对胃肠道运输的作用。运载体处理不影响胃肠道运输。MPO 数据以平均值 ±SEM 表示， GC 以中值、 第 25 和第 75 百分位数和极值表示。与禁食相比 #p ＜ 0.05， 与富脂质相比 *p ＜ 0.01， 与运载体相比 **(n ＝ 6)。 实施例
实施例 1 ： 用于术前和术后管饲的液体实施例 2 ： 用于手术前使用的液体
用于手术前使用的液体， 每 ml 提供 1.2 千卡并且包含每 100ml ： 6.3g 蛋白质 (80 重量％完整的酪蛋白和 20 重量％完整的乳清蛋白、 0.2g 谷氨酸单钠 )、 8.0g 脂质 ( 芥花油、 25 重量％磷脂、 鱼油、 乳脂 )、 4.8g 可消化的碳水化合物 ( 葡萄糖浆、 麦芽糊精、 蔗糖 )、 0.9g 甜菜碱、 2g 灰分 ( 碳酸氢钠、 氯化钾、 镁和钙盐 )。
实施例 3 ： 动物模型试验
材料与方法
动物和试验组
重 300-350 克 的 健 康 雄 性 Sprague Dawley 大 鼠 购 自 Charles River Laboratories(Maastricht， the Netherlands)。在标准化的温度和湿度条件下收纳动物， 并使其随意地获取标准食物和水。在马斯特里赫特大学动物伦理委员会 (Animal Ethics Committee of the University of Maastricht) 的同意下进行试验。
如前所述 [9]， 通过对小肠的温和的手术操作引起术后肠梗阻。简而言之， 大鼠在 无菌条件下接受通过正中腹部切口的剖腹术。将小肠置于腹部外的湿纱布垫上， 不操作盲 肠和结肠。用湿棉签操作小肠五分钟。用该过程模拟腹部手术过程中对肠的手术检查。操 作后， 润湿小肠并将其置于腹部中。用连续的缝合线将腹部封闭成两层。在操作后的 20 分 钟、 3 小时和 24 小时处死动物 ( 图 1)。在所有的试验设计中， 在操作前和操作后使大鼠禁 食， 或通过经口管饲的方式喂食富脂质或低脂质肠外营养物。在操作后 6 小时使动物 ( 其 在 24 小时处死 ) 自由地获取标准啮齿动物食物。
富脂质液体肠外营养物包含 8.7 能量百分数 ( 能量％ ) 蛋白质， 50.4 能量％脂肪， 其中 30 ％为磷脂， 以及 40.9 能量％碳水化合物。低脂质营养物包含 8.7 能量％蛋白质， 16.0 能量％脂肪和 75.3 能量％碳水化合物。低脂质营养物中脂肪的量与存在于标准啮齿 动物食物中的脂肪等热量， 富脂质营养物与低脂质营养物等热量且等氮含量。大鼠在休克 前 18 小时接受 3ml 肠外营养， 在操作前 2 小时和 45 分钟， 以及操作后 45 分钟和 90 分钟接 受 0.75ml( 图 1)。所有试验组都由六只动物组成。
蛋白酶和细胞因子分析
术 后 20 分 钟 测 量 血 浆 中 肥 大 细 胞 脱 颗 粒 标 记 物 —— 肥 大 细 胞 蛋 白
酶 -II(MCP-II)， 且在三小时测量腹腔灌洗液中的炎性细胞因子 TNF-α 和 IL-6( 图 1)。通 过腹腔内注射 10ml 无菌 PBS 而得到腹腔灌洗液。按摩一分钟后， 打开腹部并吸出流体。 将灌洗液离心并将上清液在 -20 ℃下保存直至分析。使用用于大鼠 TNF-α( 由 Hycult Biotechnology， Uden， The Netherlands 友好地提供 )、 IL-6(BD Biosciences， Franklin Lakes， NJ) 和 MCP-II(Moredun Scientific， Edinburgh， UK) 的标准 ELISA 测量 MCP-II、 TNF-α 和 IL-6 浓度。
髓过氧化物酶定量
将在 24 小时处死的每只大鼠的三段空肠速冻于液氮中。在裂解缓冲液 (300mM NaCl、 30mM Tris、 2mM MgCl2、 2mM CaCl2、 1％ Triton X-100、 抑肽素 A、 亮肽素、 抑肽酶 ( 均 为 20ng/ml ； pH 7.4) 中将肠段均质、 离心、 在 -20℃下贮存上清液直至分析。使用 ELISA 定 量髓过氧化物酶 (MPO)。简而言之， 在 4℃下用与大鼠 MPO 交叉反应的 mAb 8F4( 由 Hycult Biotechnology， Uden， the Netherlands 友好地提供 ) 涂抹微量滴定板过夜， 用 1％ BSA 的 PBS 溶液阻滞。使用生物素化的兔 -α- 人 MPO(DAKO， Glostrup， Denmark) 检测结合并用 TMB 可视化。使用 ELISA 酶标仪在 450nm 下记录结果。在每一样品对于总提取蛋白矫正后 计算每一样品的 MPO 含量。 MPO 免疫组织化学
将福尔马林固定的空肠切片并 MPO 染色。将切片再水合， 用 H2O2 阻滞内源性过氧 化物酶。在 TBS 中洗涤切片， 用 20％正常猪血清阻滞， 并用兔 -α- 人 MPO(DAKO， Glostrup， Denmark) 温育。用 TBS 漂洗后， 用二抗生物素化猪 -α- 兔 IgG 温育切片。用 Vectastain ABC/Elite(Vector Laboratories， Burlingame， CA) 和 AEC 作为发色团将染色可视化。用 DAKOCytomation(DAKO， Glostrup， Denmark) 在切片上盖载玻片， 用 Nikon E800 显微镜记录 显微照片。
胃肠道运输
如前所述 [8]， 通过评价罗丹明 B 标记的右旋糖酐 (70,000 分子量 ； Molecular Probes， Carlsbad， CA) 的胃肠道分布来测量术后 24 小时对照动物和经操作的动物的胃肠 道运输。简而言之， 通过经口管饲向动物给药罗丹明 (200μl 的 6.25mg/ml PBS 溶液 )。给 药一小时后， 评价胃和小肠中的胃肠道运输， 将其分为 10 个相等部分。打开小段并用 2ml PBS 溶液强烈地混合以得到含罗丹明的内含物。将内含物离心， 在多孔荧光酶标仪 ( 激发 530/20nm 和发射 590/50nm) 中定量上清液。计算总回收罗丹明， 并将每段表示为总罗丹明 的百分数。绘制沿胃肠道分布的荧光柱状图用于运输分析 ( 每段的罗丹明％ )。为了统计 分析， 各试验的几何中心 (GC) 计算为 ( ∑ [％ FITC 每段 X 段数 ])/100[18]。
CCK 受体拮抗剂
为了研究由给药富脂质营养物引起的抗炎通路是否由 CCK 活化， 使用 CCK 受体拮 抗剂、 地伐西匹和 L365， 260( 两者均为 500μg/kg ； 由 MLLaboratories PLC， Nottingham， United Kingdom 馈赠 ) 的组合或运载体 (90％ NaCl、 5％ Tween 20、 5％二甲亚砜 ) 处理 ( 在 肠操作前 30 分钟腹膜内给药 ) 大鼠 ( 图 1)。
统计分析
数据以平均值 +/-SEM 表示。将 Mann-Whitney U 检验用于组间比较。在 P ＜ 0.05 下认为差异是统计学显著的。
结果
肠操作后的肥大细胞脱颗粒
先前的研究已表明肠操作引发肠肌层中的炎症反应， 其由肥大细胞的活化和 脱颗粒导致 [19]。当肥大细胞活化和脱颗粒时， 该细胞释放预先形成的肥大细胞蛋白 酶 -II(MCP-II)[20]。此处， 我们证明与单独的剖腹术相比 (1.4±0.2ng/ml ； p ＜ 0.01)， 肠 操作 20 后分钟， 血浆中 MCP-II 水平的显著增加 (11.5±2.7ng/ml)( 图 2)。给药富脂质肠 外营养物证明， 与低脂质喂食动物 (7.0±1.4ng/ml) 和禁食动物 (p ＝ 0.07) 相比， 肥大细 胞脱颗粒减少 (5.7±0.9ng/ml)。
对操作导致的腹膜 TNF-α 和 IL-6 水平的抑制
已广泛地证明在肠梗阻的发病机理中活化的定居巨噬细胞的作用 [21-23， 38]。 肠 操作后 3 小时测量腹腔灌洗液中巨噬细胞来源的细胞因子 TNF-α 和 IL-6 的水平 ( 图 3)。 肠操作导致腹膜 TNF-α 水平为 84±11pg/ml(A) 且 IL-6 水平为 155±25pg/ml(B)， 然而两 种细胞因子都不能在剖腹术组中检测到。与禁食动物 (p ＜ 0.01) 和低脂质喂食动物 ( 分 别为 55±8pg/ml ； p ＜ 0.01 和 91±11pg/ml ； p ＜ 0.05) 相比， 给药富脂质营养物显著减弱 TNF-α(31±4pg/ml) 和 IL-6(53±12pg/ml) 释放入腹膜腔， 表明富脂质营养物对定居巨噬 细胞的抑制作用。 防止嗜中性粒细胞流入经操作的肠道的肌层
操作后 24 小时定量空肠组织的 MPO 水平， 以评价 MPO 阳性细胞的浸润 ( 图 4A)。 与剖腹术动物相比 (34±4pg/μg 蛋白质 ； p ＜ 0.01)， 经操作的动物证明组织水平 MPO 显著 增加 (123±11pg/μg 蛋白质 )。其次， 通过免疫组织化学证实 MPO 阳性细胞的流入。形态 学地被确认为大鼠嗜中性粒细胞的含 MPO 细胞主要位于小肠的纵肌和环肌层之间 ( 图 4B)。
使用富脂质喂食的干预显著地防止由操作诱导的 MPO 阳性细胞流入肠肌层 ( 图 4)。与禁食动物 (123±11pg/μg 蛋白质 ； p ＜ 0.05) 和低脂质喂食动物 (109±9pg/μg 蛋 白质 ； p ＜ 0.05) 相比较， 富脂质喂食动物中的组织 MPO 水平显著减少 (81±8pg/μg 蛋白 质 )。图 4C 显示用富脂质营养物处理的动物的代表性显微照片。
肠操作后改善的胃肠道运输
在操作后 24 小时， 使用荧光运输标记物罗丹明测量一小时的胃肠道运输。以几何 中心的形式表示， 与剖腹术动物 (GC ： 6.8±0.2) 相比， 肠操作导致罗丹明肠道运输的显著 减少 (GC ： 5.8±0.2 ； p ＜ 0.05)( 图 5A)。尽管与禁食动物相比， 给药低脂质营养物未能改 善罗丹明的肠道运输 (GC ： 6.1±0.4)(p ＝ 0.18)， 然而富脂质营养物显著地增强肠道通过 (GC ： 6.9±0.3 ； p ＜ 0.05)。 图 5B 将与禁食大鼠相比， 富脂质处理的大鼠的胃肠道运输的改 善可视化。 与禁食动物相比， 富脂质营养物喂食的动物胃中的罗丹明的含量更低， 且罗丹明 在小肠中被运输得更远。
阻滞 CCK 受体减弱富脂质喂食对炎性浸润物的防护作用且使胃肠道运动不足恶 化
给药 CCK 受体拮抗剂以研究 CCK 介导的抗炎通路在富脂质营养物对操作引起的 MPO 阳性细胞流入和胃肠道运动不足的抑制作用中的参与 [39]。CCK 受体的阻滞显著地防 止富脂质营养物对 MPO 的组织水平的抑制作用 (142±16pg/μg 蛋白质 ； p ＜ 0.01)， 然而运 载体处理证明没有作用 (90±10pg/μg 蛋白质 ； 图 6A)。这些发现支持以下事实 ： 富脂质营
养物对 MPO 阳性细胞流入的抑制作用通过 CCK 依赖性的机制介导。
此外， 应用 CCK 受体拮抗剂防止富脂质营养物对罗丹明的胃肠道运输的促进作用 (GC ： 5.2±0.4 ； p ＜ 0.01)， 然而运载体处理大鼠中的运输保持未变 (GC ： 7.0±0.2. 图 6B)。 一并考虑， 由富脂质肠外营养物导致的嗜中性粒细胞流入的防止和胃肠道运输的改善都显 示为 CCK 依赖性的。
讨论
发明人已证明使用高脂质含量制剂的营养干预能够减少肠操作后的术后肠梗阻。 给药富脂质营养物导致 TNF-α 和 IL-6 的腹膜内水平降低并防止嗜中性粒细胞流入肠肌 层。此外， 富脂质喂食以 CCK 依赖性方式改善胃肠道运输。
肠操作已被认为是术后肠梗阻的有效模型 [9， 24， 25]。温和的小肠操作导致肠肌 层的炎症反应和胃肠道运动不足。术后肠梗阻发病机理的关键因素是定居巨噬细胞的活 化， 其导致嗜中性粒细胞流入肠肌层 [5， 7]。
已显示肠操作通过肥大细胞来源的介质 [19， 26] 或通过暴露于肠道渗透性增加 时期的侵入性鲁米诺抗原而活化肠肌层中的定居巨噬细胞 [27]。已通过巨噬细胞来源的 TNF-α 和 IL-6 的局部产生和这些促炎细胞因子在腹膜液中的释放证明定居巨噬细胞的活 化 [7， 10， 12， 28]。最近， 发明人描述了在出血休克的啮齿动物模型中， 用富脂质营养物对 自主神经系统的营养性刺激通过传出迷走神经显著地抑制 TNF-α 和 IL-6 的系统性水平 [15， 16]。在本申请中， 证明用富脂质营养物的干预抑制肠操作后腹腔灌洗液中的 IL-6 和 TNF-α 水平。这些发现由以下的事实支持 ： 如先前 De Jonge 等所述， 在术后肠梗阻的小鼠 模型中， 迷走神经的刺激显著地减弱 TNF-α 和 IL-6 的腹膜水平 [12]。
在定居炎性细胞活化后， 肠操作导致炎性细胞流入 [29]。确认嗜中性粒细胞流入 肠肌层， 表示为操作后肠肌层中的增强的 MPO 组织水平和增加的 MPO 阳性细胞数。这些炎 性浸润物抑制胃肠道活动性并引发抑制性脊柱通路， 导致胃肠道的普遍丧失能力 [5， 7]。 已 显示通过阻滞 ICAM-1 而防止在肌层中形成炎性浸润物能够减弱术后肠梗阻 [7， 29]。本申 请证明给药富脂质营养物预防 MPO 阳性细胞流入肌层。这些发现表明富脂质营养不仅减弱 系统性炎症反应， 而且抑制组织水平的炎症。
已报道肥大细胞的活化和脱颗粒在引发术后肠梗阻中起重要作用 [19]。 肠道肥大 细胞与迷走神经末端密切接触， 且已证明对迷走神经的电刺激能够影响肥大细胞 [30， 31]。 因此， 我们研究富脂质营养物能否通过前述的对胆碱能抗炎通路的营养性刺激而影响肥大 细胞 [15]。 给药富脂质营养物倾向于降低大鼠 MCP-II 的释放， 意味着具有高脂质含量的营 养物防止肥大细胞的脱颗粒。然而， 需要更多的研究来证实肥大细胞与喂食高脂质含量的 组合物之间的联系。显示肠道炎症的程度与胃肠道运动不足的水平成正比 [7-10]， 而防止 或减少由操作导致的炎症反应减弱运动不足 [7， 12， 29]。
在此， 我们已证明给药富脂质营养物通过减弱局部炎症反应而有效地减少操作导 致的胃肠道运输降低， 表明高脂质含量的营养性干预改善术后肠梗阻。
之前， 发明人报道了神经肽 CCK 在胆碱能抗炎通路的营养性活化中起重要作用 [39]。在此， 我们报道给药 CCK 受体拮抗剂消除富脂质营养物的抗炎作用并防止胃肠道 运输的改善。我们的数据表明营养介导的胆碱能抗炎通路是术后肠梗阻减弱的原因。这 些发现由最近的报道支持， 其描述了胆碱能抗炎通路的电或药理性刺激通过抑制局部炎症反应而改善术后肠梗阻 [12， 13]。尽管非常有效， 然而迷走神经的电刺激仍是侵入性过 程， 且 α7nAChR 的普遍刺激可能通过活化非相关细胞和细胞系统而具有大范围的副作用 [32-34]。 我们的抗炎通路的营养性活化是生理性方法， 用于减少局部炎症并改善肠操作后 的术后肠梗阻。
术后肠梗阻与发病率增加、 住院时间增加和卫生保健成本增加有关 [6， 11， 35]。 目 前的对于术后肠梗阻的治疗本质上是支持性的， 并包括禁食 (nothing per mouth)、 鼻胃管 吸出和肠道休息 [6， 11]。与术后肠梗阻相关的细胞和分子变化眼下难以处理， 这是由于炎 性级联已在不断发展中。因此， 处于发展术后肠梗阻风险中的患者可能受益于使用富脂质 肠外营养物的简单且安全的干预， 从而防止操作引起的炎症反应以及随之发生的胃肠道运 动不足。已证明早期给药肠外营养物有益于外科手术患者， 并且在 “快车道” 计划 (“fast track” program) 中成功实施 [36， 37]。
总之， 已显示使用富脂质营养物的干预通过经由大鼠中 CCK 受体的活化抑制局部 炎症反应， 从而减弱术后肠梗阻。这些数据表明使用富脂质营养物的干预可以为预防和治 疗术后肠梗阻的有价值的工具。
应了解的是， 对本文描述的目前优选的实施方案的各种改变和修饰对于本领域的 技术人员而言将是显而易见的。 可以在不背离本发明的精神和范围且不减少其优势的情况 下进行这样的改变和修饰。因此， 意图是这样的变化和修饰由所附的权利要求涵盖。
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