磁性载基因脂质超声微泡造影剂的制备方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201010531462.8

申请日:

2010.11.04

公开号:

CN101987203A

公开日:

2011.03.23

当前法律状态:

撤回

有效性:

无权

法律详情:

发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):A61K 49/22公开日:20110323|||实质审查的生效IPC(主分类):A61K 49/22申请日:20101104|||公开

IPC分类号:

A61K49/22; A61K48/00; A61N2/04; A61P35/00

主分类号:

A61K49/22

申请人:

东南大学

发明人:

张东生; 李华梅

地址:

210000 江苏省南京市四牌楼2号

优先权:

专利代理机构:

南京天翼专利代理有限责任公司 32112

代理人:

汤志武

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内容摘要

一种磁性脂质超声微泡造影剂的制备方法:配FeCl3和FeCl2溶液并加入烧瓶中,搅拌下滴加NH4OH,出现沉淀,熟化,取出生成物并冲洗,至其溶液pH=7,干燥后得Fe3O4磁性纳米粒;将Fe3O4干粉配成磁流体,弃上清,沉淀重悬于磷酸盐缓冲液,加PEI形成PEI/Fe3O4纳米粒子,将其与pEGFP-C1质粒DNA混合静置,得载基因Fe3O4磁性纳米粒子;将DSPC、DPPE、DPPA溶于氯仿和异丙醇为2:1的有机溶剂中,蒸发溶剂,剩脂质薄膜,以葡萄糖和丙二醇按4:1配置水合液加入瓶中,分散后形成脂质悬液,加入40mg的PEG4000,加热溶解,将DNA/PEI/Fe3O4和明胶加到脂质悬液中,加吐温800.01ml,置换西林瓶上方的空气,振荡后得载基因磁性脂质超声微泡。

权利要求书

1: 一种作为既可影像增强又可对肿瘤进行治疗的磁性脂质超声微泡造影剂的制备方 法, 其特征在于 : (1) 用分析纯的 FeCl3· 6H2O 和 FeCl2· 4H2O 分别配制成 0.1mol/L 的 FeCl3 溶液和 FeCl2 3+ 2+ 溶液, 按 Fe :Fe =5:3 分别加入 100ml 0.1mol/L 的 FeCl3 和 60ml 0.1mol/L 的 FeCl2 溶液于 烧瓶中, 在 N2 保护和磁力搅拌下滴加 1.5mol/L 的 NH4OH, 溶液中迅速出现沉淀物, 继续滴加 NH4OH 至反应液的 PH=9, 沉淀物由红褐色逐渐转变为黑色, 继续搅拌 30min 后停止, 于 80℃ 水浴恒温 30min 进行熟化, 然后用强磁铁吸住烧瓶底部, 倾去上层废液, 用去离子水反复冲 洗生成物, 至其溶液 PH=7, 将生成物真空干燥得 Fe3O4 磁性纳米粒, (2) 将 Fe3O4 干粉溶于 5g/L 草酸溶液中配成质量分数为 4% 的磁流体, 超声分散后高速 离心弃上清, 沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中, 边超声边缓慢加入适量 PEI 充分混匀, 超声 1 h, 磁力搅拌 2 h, 使反应充分形成稳定的 PEI/ Fe3O4 纳米粒子, 用蒸馏水、 乙醇反复洗涤, 干燥 后将 PEI/ Fe3O4 纳米粒子与 pEGFP-C1 质粒 DNA 按 15 : 1 的质量比充分混合, 室温静置 30 min, 得载基因 Fe3O4 磁性纳米粒子, (3) 将 DSPC( 二硬脂酰磷脂酰胆碱 )、 DPPE( 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺 ) 、 DPPA(二苯基 磷酰基叠氮化物) 按1: 1: 1 的比例溶于氯仿和异丙醇为 2 : 1 的有机溶剂中, 超声 20min 使 其充分溶解, 于 85° C 水浴中加热 30min 使有机溶剂蒸发完全, 在西林瓶底部形成一脂质薄 膜, 以葡萄糖和丙二醇按 4 : 1 比例配置的水合液加入此西林瓶中, 超声分散 30min 后使其形 成充分的脂质悬液, 在此悬液里加入 40mg 的 PEG4000, 60° C 加热使其完全溶解, 将一定量 DNA/ PEI/ Fe3O4、 和明胶按 2 : 1 比例加入到脂质悬液中, 后加吐温 80 0.01ml, 使总体积为 西林瓶的 1/3, 用 5ml 注射器充入 1ml 的 SF6 气体后置换西林瓶上方的空气, 将此西林瓶放 入频率 4500HZ 的机械振荡器中振荡 60s, 即得载基因磁性脂质超声微泡。

说明书


磁性载基因脂质超声微泡造影剂的制备方法

    技术领域 本发明涉及一种作为既可影像增强又可对肿瘤进行治疗的磁性载基因脂质超声 微泡造影剂的制备方法。
     背景技术 本发明所涉及的是新型脂质超声微泡及其制备方法, 将纳米技术引入超声微泡的 制备中, 通过纳米技术制备出 Fe3O4 磁性纳米粒并进行 PEI 的表面修饰, 经修饰后的 Fe3O4 磁 性纳米粒可有效的与真核表达质粒相结合, 进而将 DNA/PEI/ Fe3O4 复合物包裹入脂质微泡 中, 形成载基因磁性脂质微泡。从而使其不仅具有影像增强功能而且具有基因治疗和热疗 的双重抗肿瘤细胞效能。
     肿瘤热疗是利用物理方法使组织加热 , 达到杀灭癌细胞的特定温度以治疗恶性 肿瘤的一种治疗手段。目前肿瘤热疗技术在临床上已得到了广泛的应用, 如射频、 微波、 激 光等。但因对肿瘤的靶向能力差, 易导致周围正常组织产生可逆性损伤而使其应用受到 限制。同时对深层部位肿瘤热疗, 由于人体组织的不均匀性, 使得热分布不均匀, 疗效较 差。近年来 , 随着纳米技术的突飞猛进 , 将磁性纳米材料应用于肿瘤热疗能够克服目前 加热技术的不足。在纳米颗粒用于治疗肿瘤时, 理想的是纳米颗粒只存在于肿瘤组织中, 而不出现在其他组织中, 从而将治疗局限于病灶, 不致损伤正常组织。1997 年德国学者 Jordan 等利用磁性纳米粒在交变磁场 (alternating magneticfield, AMF) 作用下能够将 吸收的磁能转化为热能的特点来治疗肿瘤, 这种新方法称为磁流体热疗 (magnetic fluid hyperthermia,MFH)。处于交变磁场中的磁性纳米颗粒主要是通过磁滞损耗来大量吸收磁 场能量产生热量的。 磁流体更易被肿瘤细胞摄取, 在肿瘤中分散均匀, 达到细胞内加热的目 的, 并且能够随着肿瘤分裂进入子细胞中, 具有更强的杀伤力。 有学者将脂质膜包裹纳米磁 性微粒, 制成磁性脂质体 (magnetic liposomes,MLs), 由于脂质膜和细胞膜的成份相似, 这 种磁性脂质体通过细胞的融合或吞噬作用就可以更快更多的进入细胞内部, 从而进一步增 强细胞内热疗的疗效。
     肝癌是目前常见且病死率较高的恶性肿瘤之一, 且常伴有肝硬化腹水和肝内转 移, 故手术切除的可能性小。近年来, 随着分子生物学和基因工程技术的不断进步, 为肿瘤 的治疗开辟了新的途径, 肝癌的基因治疗已显示出广阔的应用前景。国内多项临床研究证 实 P53 基因对肝癌治疗的有效性。目前基因治疗的研究和临床应用中常用的病毒载体和非 病毒载体都存在无法克服的免疫反应、 细胞毒性与安全性的问题, 限制基因治疗的发展。 研 究证实 , 纳米粒与 DNA 的连接多通过静电吸引作用来完成。DNA 的磷酸骨架所带的负电荷 只能与表面带正电性的载体结合。因此 , 需要利用生物活性分子对纳米颗粒的表面进行改 性, 使其表面携带阳离子物质, 以起到防止纳米颗粒团聚 , 并有利于结合 DNA 分子的作用。 PEI 是目前应用较有效的阳离子聚合物基因载体。它的结构特点是分子中每隔 2 个碳原子 就有一个活性氮原子 (—NH2), 这些氮原子在生理条件下可以发生质子化而带上正电荷 (— H 3+) , 从而与 DNA 上带负电荷的磷酸基团通过静电吸附作用而形成复合物。 本研究中的结
     果显示, 以聚乙烯亚氨 (PEI) 修饰的 Fe3O4 纳米颗粒作为基因转运载体可有效的与 DNA 结合 形成 Fe3O4 纳米粒 /DNA 复合物。
     目前关于超声造影剂的研究已有 30 余年的历史。经国内外大量学者的研究, 已经 产生了多种包膜微泡造影剂, 它可显著增强实质器官的灰阶显像, 是很好的声学对比剂。 超 声造影技术可以提高超声多普勒对血流信号的敏感性, 可以使组织和血流的声像图质量大 加改善, 提高肿瘤的分辨率, 对肿瘤良恶性的鉴别诊断有很大的帮助。 肝脏肿瘤的超声造影 增强特征取决于该肿瘤的供血特征和血流灌注特征, 也是其对病变性质诊断的重要依据。 肝细胞癌以肝动脉供血为主, 血流速度较快, 在动脉期病灶迅速增强, 表现为快进快出。肝 转移癌受原发癌病理类型及血供的影响, 其增强表现也各不相同, 可环状强化, 也可快速团 状灌注强化, 但多在门脉期增强影像立即消退, 其影像低于肝实质。 肝血管瘤是由血窦构成 的良性肿瘤, 因血流速度缓慢, 致造影剂进出缓慢, 表现为从边缘向中心的逐渐增强, 典型 的血管瘤在肝实质相时其增强影像高于周边肝实质。最近, Jürgen 等制作了定位于血管内 皮生长因子受体 22 和 α Ⅴ β3 整合素的双靶点靶向微泡, 并在荷人卵巢癌的小鼠上进行 B 超显影, 证明双靶点的靶向微泡能更多地聚集于靶肿瘤, 达到更理想的肿瘤显影效果。 大量研究已经表明, 超声造影剂不仅仅可以提高图象的分辨率和对比度, 其在体内亦 可作为安全性和高效性的携带药物和基因的载体, 在超声作用下能显著提高靶部位药物的 传输效率而减少全身的毒副作用和明显提高局部细胞和组织的基因转染和表达。 随着超声 造影剂与超声造影设备的迅速发展 , 使得超声造影成为当前超声医学的热门研究课题。 超 声微泡联合超声技术介导基因和药物靶向治疗是利用超声空化效应, 将带有药物或基因的 微泡载体经外周静脉或局部注入体内, 待其到达靶区后, 用超声照射而使靶区产生空化效 应, 微泡内爆后将药物和基因释放入靶区。所释放的药物和基因可通过扩大的毛细血管内 皮细胞进入组织间隙, 最后由细胞膜上的小孔会集在细胞内, 增强了外源基因的摄取、 转染 与表达, 提高了药物的局部浓度, 实现了靶向治疗的作用。 Hayashida 等将无水酒精混合在 常用于肝脏显像的 CO2 微泡中, 经皮穿刺治疗后发现只需一次就可达到直径小于 3cm 的 肿瘤坏死 , 并且注射的无水酒精量也大大减少, 无严重并发症发生 , 治疗后无肝内及腹膜 转移。 Aoi 等以超声微泡为载体 , 将单纯疱疹胸腺激酶基因成功导入肿瘤细胞中, 证明超声 微泡作为一种新的基因递送方法用于肿瘤的基因治疗具有相当广泛的应用前景。
     综上所述, 如果将磁性材料与超声脂质微泡相融合, 形成载基因磁性超声脂质微 泡, 集两者优势于一体, 在增强肿瘤影像的同时既能发挥靶向热化疗, 基因治疗的功效, 又 可对肿瘤进行体外示踪, 这将不失为超声造影领域的又一创举。 发明内容
     本发明提供一种磁性载基因脂质超声微泡造影剂的制备方法, 利用本发明可获得影像 增强效果好、 磁响应性强、 分散性较好、 粒径小的磁性载基因脂质超声微泡造影剂。 本发明采用如下技术方案来解决其技术问题 : (1) 用分析纯的 FeCl3· 6H2O 和 FeCl2· 4H2O 分别配制成 0.1mol/L 的 FeCl3 溶液和 FeCl2 3+ 2+ 溶液, 按 Fe Fe =5:3 分别加入 100ml 0.1mol/L 的 FeCl3 和 60ml 0.1mol/L 的 FeCl2 溶液于 烧瓶中, 在 N2 保护和磁力搅拌下滴加 1.5mol/L 的 NH4OH, 溶液中迅速出现沉淀物, 继续滴加NH4OH 至反应液的 PH=9, 沉淀物由红褐色逐渐转变为黑色, 继续搅拌 30min 后停止。于 80℃ 水浴恒温 30min 进行熟化, 然后用强磁铁吸住烧瓶底部, 倾去上层废液, 用去离子水反复冲 洗生成物, 至其溶液 PH=7, 将生成物真空干燥得 Fe3O4 磁性纳米粒。
     (2) 将 Fe3O4 干粉溶于 5g/L 草酸溶液中配成质量分数为 4% 的磁流体, 超声分散后 高速离心弃上清。沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中, 边超声边缓慢加入适量 PEI 充分混匀, 超声 1 h, 磁力搅拌 2 h, 使反应充分形成稳定的 PEI/ Fe3O4 纳米粒子。 用蒸馏水、 乙醇反复洗涤, 干燥后将 PEI/ Fe3O4 纳米粒子与 pEGFP-C1 质粒 DNA 按 15 : 1 的质量比充分混合, 室温静置 30 min, 得载基因 Fe3O4 磁性纳米粒子。
     (3) 将 DSPC( 二硬脂酰磷脂酰胆碱 )、 DPPE( 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺 ) 、 DPPA(二 苯基磷酰基叠氮化物) 按1 : 1: 1 的比例溶于氯仿和异丙醇为 2 : 1 的有机溶剂中, 超声 20min 使其充分溶解, 于 85° C 水浴中加热 30min 使有机溶剂蒸发完全, 在西林瓶底部形成一脂质 薄膜, 以葡萄糖和丙二醇按 4 : 1 比例配置的水合液加入此西林瓶中, 超声分散 30min 后使其 形成充分的脂质悬液。在此悬液里加入 40mg 的 PEG4000, 60° C 加热使其完全溶解。将一 定量 DNA/ PEI/ Fe3O4 和明胶按 2 : 1 比例加入到脂质悬液中, 后加吐温 80 0.01ml, 使总体 积为西林瓶的 1/3。用 5ml 注射器充入 1ml 的 SF6 气体后置换西林瓶上方的空气。将此西 林瓶放入频率 4500HZ 的机械振荡器中振荡 60s, 即得载基因磁性脂质超声微泡。
     与现有技术相比, 本发明取得了如下有益效果 : 1. 化学共沉淀法成功制备的 Fe3O4 磁性纳米粒为黑色粉末状 , 用扫描电镜观察, Fe3O4 磁性纳米粒呈细颗粒状外观, 大小较一致, 平均粒径为 15nm, 呈散在分布或聚集成片。用能 谱仪对 Fe3O4 磁性纳米粒成份进行分析, 可见其中仅含有铁和氧两种成分, 质量百分含量与 Fe3O4 中铁氧质量百分含量吻合。 Fe3O4 磁性纳米粒经用 PEI 修饰后扫描电镜示分散性良好。 实验表明 PEI/Fe3O4 磁性纳米粒具有良好的 DNA 结合能力, 且具有良好的超顺磁性和磁感应 升温特性。 在频率为 230kHz、 功率为 4kW, 输出加热电流为 20A 的交变磁场照射下, 一定浓度 的 PEI/Fe3O4 磁性纳米粒在 50min 后温度几乎不再上升而恒定保持在 42° C-62° C 之间, 此温度为肿瘤热疗的有效温度。因此, 我们可以利用特定浓度的 PEI/ Fe3O4 在一定磁场下 的升温而后保持恒温的性质来实现对肿瘤的热疗。
     2.采用机械振荡法制备的磁性脂质微泡光镜下呈圆球形外观, 外包被一层脂质 膜, 内充有透亮的 SF6 气体, 分散度好, 马尔文粒径测量仪示平均粒径为 1127nm。 扫描电镜图 示磁性脂质微泡近似圆球形, 表面能谱分析结果示磁性脂质微泡中含有 P??O??Fe 等元素, 其中 P 为脂质成分, Fe??O 为磁性材料的成分, 证实磁性脂质微泡已制备成功。研究表明, PEGFP-C1/PEI/ Fe3O4 磁性脂质微泡转染 HepG2 细胞后, 在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白 的表达。
     3.采用 20% 的乌拉坦 5ml/kg 经耳缘静脉将兔子麻醉后, 经耳缘静脉团注 0.1ml/ 9 kg 的浓度为 3×10 /ml 的磁性脂质微泡溶液, 即刻追注 1ml 的生理盐水。采用 Philips 彩 超诊断仪, 用高频探头对兔肝进行造影, 与造影前相比兔肝实质有明显的影像增强。
     4.在频率为 230kHz、 功率为 4kW, 输出加热电流为 20A 的交变磁场照射下, 磁性脂 质微泡的升温能力与包被 Fe3O4 磁性纳米粒子的浓度成正相关, 浓度越大升温能力越强、 温 度上升越高, 温度升高到某一定点后保持恒定, 最终温度可保持在 42℃ ~45℃之间的肿瘤 有效热疗温度范围。5.一定量的载 WtP53 磁性脂质超声微泡体外作用于人肝癌细胞, 不但可以通过 磁感应靶向加热、 还可以通过 WtP53 的转染和表达来共同抑制肝癌细胞的生长和促进其凋 亡。它与单一的磁性脂质微泡磁感应热疗或单一的载 WtP53 基因磁性脂质超声微泡基因治 疗相比, 效果更加显著 (P<0.05) 。
     6. 作为一种新型的超声造影剂, 载 WtP53 磁性脂质超声微泡既可保证影像增强, 在超声引导下的同时又可对肿瘤进行基因治疗和热疗的联合治疗。具有靶向性好, 安全性 高的特点, 有望为临床肝癌的治疗开辟新的路径。 附图说明
     图 1 是本发明制得的磁性脂质微泡光镜图 (400×) 。
     图 2 是荧光显微镜下磁性脂质微泡对 HepG2 细胞转染效率图。
     图 3 是不同浓度磁性脂质微泡体外升温曲线图。
     图 4 是兔肝实质超声造影增强图 (左图 : 造影前 右图 : 造影后) 。
     图 5 是磁性脂质微泡的扫描电镜图。
     图 6 是磁性脂质微泡的表面能谱分析。 具体实施方式 (1) 用分析纯的 FeCl3·6H2O 和 FeCl2·4H2O 分别配制成 0.1mol/L 的 FeCl3 溶液和 FeCl2 溶液, 按 Fe3+:Fe2+=5:3 分别加入 100ml 0.1mol/L 的 FeCl3 和 60ml 0.1mol/L 的 FeCl2 溶液于烧瓶中, 在 N2 保护和磁力搅拌下滴加 1.5mol/L 的 NH4OH, 溶液中迅速出现沉淀物, 继 续滴加 NH4OH 至反应液的 PH=9, 沉淀物由红褐色逐渐转变为黑色, 继续搅拌 30min 后停止。 于 80℃水浴恒温 30min 进行熟化, 然后用强磁铁吸住烧瓶底部, 倾去上层废液, 用去离子水 反复冲洗生成物, 至其溶液 PH=7, 将生成物真空干燥得 Fe3O4 磁性纳米粒。
     (2) 将 Fe3O4 干粉溶于 5g/L 草酸溶液中配成质量分数为 4% 的磁流体, 超声分散后 高速离心弃上清。沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中, 边超声边缓慢加入适量 PEI 充分混匀, 超声 1 h, 磁力搅拌 2 h, 使反应充分形成稳定的 PEI/ Fe3O4 纳米粒子。 用蒸馏水、 乙醇反复洗涤, 干燥后将 PEI/ Fe3O4 纳米粒子与 pEGFP-C1 质粒 DNA 按 15 : 1 的质量比充分混合, 室温静置 30 min, 得载基因 Fe3O4 磁性纳米粒子。
     (3) 将 DSPC( 二硬脂酰磷脂酰胆碱 )、 DPPE( 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺 ) 、 DPPA(二 苯基磷酰基叠氮化物) 按1 : 1: 1 的比例溶于氯仿和异丙醇为 2 : 1 的有机溶剂中, 超声 20min 使其充分溶解, 于 85° C 水浴中加热 30min 使有机溶剂蒸发完全, 在西林瓶底部形成一脂质 薄膜, 以葡萄糖和丙二醇按 4 : 1 比例配置的水合液加入此西林瓶中, 超声分散 30min 后使其 形成充分的脂质悬液。在此悬液里加入 40mg 的 PEG4000, 60° C 加热使其完全溶解。将一 定量 DNA/ PEI/ Fe3O4 和明胶按 2 : 1 比例加入到脂质悬液中, 后加吐温 80 0.01ml 使总体积 为西林瓶的 1/3。用 5ml 注射器充入 1ml 的 SF6 气体后置换西林瓶上方的空气。将此西林 瓶放入频率 4500HZ 的机械振荡器中振荡 60s, 即得载基因磁性脂质超声微泡。
    

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1、10申请公布号CN101987203A43申请公布日20110323CN101987203ACN101987203A21申请号201010531462822申请日20101104A61K49/22200601A61K48/00200601A61N2/04200601A61P35/0020060171申请人东南大学地址210000江苏省南京市四牌楼2号72发明人张东生李华梅74专利代理机构南京天翼专利代理有限责任公司32112代理人汤志武54发明名称磁性载基因脂质超声微泡造影剂的制备方法57摘要一种磁性脂质超声微泡造影剂的制备方法配FECL3和FECL2溶液并加入烧瓶中,搅拌下滴加NH4OH,出。

2、现沉淀,熟化,取出生成物并冲洗,至其溶液PH7,干燥后得FE3O4磁性纳米粒;将FE3O4干粉配成磁流体,弃上清,沉淀重悬于磷酸盐缓冲液,加PEI形成PEI/FE3O4纳米粒子,将其与PEGFPC1质粒DNA混合静置,得载基因FE3O4磁性纳米粒子;将DSPC、DPPE、DPPA溶于氯仿和异丙醇为21的有机溶剂中,蒸发溶剂,剩脂质薄膜,以葡萄糖和丙二醇按41配置水合液加入瓶中,分散后形成脂质悬液,加入40MG的PEG4000,加热溶解,将DNA/PEI/FE3O4和明胶加到脂质悬液中,加吐温80001ML,置换西林瓶上方的空气,振荡后得载基因磁性脂质超声微泡。51INTCL19中华人民共和国国。

3、家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图3页CN101987203A1/1页21一种作为既可影像增强又可对肿瘤进行治疗的磁性脂质超声微泡造影剂的制备方法,其特征在于(1)用分析纯的FECL36H2O和FECL24H2O分别配制成01MOL/L的FECL3溶液和FECL2溶液,按FE3FE253分别加入100ML01MOL/L的FECL3和60ML01MOL/L的FECL2溶液于烧瓶中,在N2保护和磁力搅拌下滴加15MOL/L的NH4OH,溶液中迅速出现沉淀物,继续滴加NH4OH至反应液的PH9,沉淀物由红褐色逐渐转变为黑色,继续搅拌30MIN后停止,于80水浴恒温30MIN进行。

4、熟化,然后用强磁铁吸住烧瓶底部,倾去上层废液,用去离子水反复冲洗生成物,至其溶液PH7,将生成物真空干燥得FE3O4磁性纳米粒,(2)将FE3O4干粉溶于5G/L草酸溶液中配成质量分数为4的磁流体,超声分散后高速离心弃上清,沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中,边超声边缓慢加入适量PEI充分混匀,超声1H,磁力搅拌2H,使反应充分形成稳定的PEI/FE3O4纳米粒子,用蒸馏水、乙醇反复洗涤,干燥后将PEI/FE3O4纳米粒子与PEGFPC1质粒DNA按151的质量比充分混合,室温静置30MIN,得载基因FE3O4磁性纳米粒子,(3)将DSPC二硬脂酰磷脂酰胆碱、DPPE二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、DPPA(二苯。

5、基磷酰基叠氮化物)按111的比例溶于氯仿和异丙醇为21的有机溶剂中,超声20MIN使其充分溶解,于85C水浴中加热30MIN使有机溶剂蒸发完全,在西林瓶底部形成一脂质薄膜,以葡萄糖和丙二醇按41比例配置的水合液加入此西林瓶中,超声分散30MIN后使其形成充分的脂质悬液,在此悬液里加入40MG的PEG4000,60C加热使其完全溶解,将一定量DNA/PEI/FE3O4、和明胶按21比例加入到脂质悬液中,后加吐温80001ML,使总体积为西林瓶的1/3,用5ML注射器充入1ML的SF6气体后置换西林瓶上方的空气,将此西林瓶放入频率4500HZ的机械振荡器中振荡60S,即得载基因磁性脂质超声微泡。权。

6、利要求书CN101987203A1/4页3磁性载基因脂质超声微泡造影剂的制备方法技术领域0001本发明涉及一种作为既可影像增强又可对肿瘤进行治疗的磁性载基因脂质超声微泡造影剂的制备方法。背景技术0002本发明所涉及的是新型脂质超声微泡及其制备方法,将纳米技术引入超声微泡的制备中,通过纳米技术制备出FE3O4磁性纳米粒并进行PEI的表面修饰,经修饰后的FE3O4磁性纳米粒可有效的与真核表达质粒相结合,进而将DNA/PEI/FE3O4复合物包裹入脂质微泡中,形成载基因磁性脂质微泡。从而使其不仅具有影像增强功能而且具有基因治疗和热疗的双重抗肿瘤细胞效能。0003肿瘤热疗是利用物理方法使组织加热,达到。

7、杀灭癌细胞的特定温度以治疗恶性肿瘤的一种治疗手段。目前肿瘤热疗技术在临床上已得到了广泛的应用,如射频、微波、激光等。但因对肿瘤的靶向能力差,易导致周围正常组织产生可逆性损伤而使其应用受到限制。同时对深层部位肿瘤热疗,由于人体组织的不均匀性,使得热分布不均匀,疗效较差。近年来,随着纳米技术的突飞猛进,将磁性纳米材料应用于肿瘤热疗能够克服目前加热技术的不足。在纳米颗粒用于治疗肿瘤时,理想的是纳米颗粒只存在于肿瘤组织中,而不出现在其他组织中,从而将治疗局限于病灶,不致损伤正常组织。1997年德国学者JORDAN等利用磁性纳米粒在交变磁场(ALTERNATINGMAGNETICFIELD,AMF)作用。

8、下能够将吸收的磁能转化为热能的特点来治疗肿瘤,这种新方法称为磁流体热疗MAGNETICFLUIDHYPERTHERMIA,MFH。处于交变磁场中的磁性纳米颗粒主要是通过磁滞损耗来大量吸收磁场能量产生热量的。磁流体更易被肿瘤细胞摄取,在肿瘤中分散均匀,达到细胞内加热的目的,并且能够随着肿瘤分裂进入子细胞中,具有更强的杀伤力。有学者将脂质膜包裹纳米磁性微粒,制成磁性脂质体MAGNETICLIPOSOMES,MLS,由于脂质膜和细胞膜的成份相似,这种磁性脂质体通过细胞的融合或吞噬作用就可以更快更多的进入细胞内部,从而进一步增强细胞内热疗的疗效。0004肝癌是目前常见且病死率较高的恶性肿瘤之一,且常伴。

9、有肝硬化腹水和肝内转移,故手术切除的可能性小。近年来,随着分子生物学和基因工程技术的不断进步,为肿瘤的治疗开辟了新的途径,肝癌的基因治疗已显示出广阔的应用前景。国内多项临床研究证实P53基因对肝癌治疗的有效性。目前基因治疗的研究和临床应用中常用的病毒载体和非病毒载体都存在无法克服的免疫反应、细胞毒性与安全性的问题,限制基因治疗的发展。研究证实,纳米粒与DNA的连接多通过静电吸引作用来完成。DNA的磷酸骨架所带的负电荷只能与表面带正电性的载体结合。因此,需要利用生物活性分子对纳米颗粒的表面进行改性,使其表面携带阳离子物质,以起到防止纳米颗粒团聚,并有利于结合DNA分子的作用。PEI是目前应用较有。

10、效的阳离子聚合物基因载体。它的结构特点是分子中每隔2个碳原子就有一个活性氮原子NH2,这些氮原子在生理条件下可以发生质子化而带上正电荷(H),从而与DNA上带负电荷的磷酸基团通过静电吸附作用而形成复合物。本研究中的结说明书CN101987203A2/4页4果显示,以聚乙烯亚氨(PEI)修饰的FE3O4纳米颗粒作为基因转运载体可有效的与DNA结合形成FE3O4纳米粒/DNA复合物。0005目前关于超声造影剂的研究已有30余年的历史。经国内外大量学者的研究,已经产生了多种包膜微泡造影剂,它可显著增强实质器官的灰阶显像,是很好的声学对比剂。超声造影技术可以提高超声多普勒对血流信号的敏感性,可以使组织。

11、和血流的声像图质量大加改善,提高肿瘤的分辨率,对肿瘤良恶性的鉴别诊断有很大的帮助。肝脏肿瘤的超声造影增强特征取决于该肿瘤的供血特征和血流灌注特征,也是其对病变性质诊断的重要依据。肝细胞癌以肝动脉供血为主,血流速度较快,在动脉期病灶迅速增强,表现为快进快出。肝转移癌受原发癌病理类型及血供的影响,其增强表现也各不相同,可环状强化,也可快速团状灌注强化,但多在门脉期增强影像立即消退,其影像低于肝实质。肝血管瘤是由血窦构成的良性肿瘤,因血流速度缓慢,致造影剂进出缓慢,表现为从边缘向中心的逐渐增强,典型的血管瘤在肝实质相时其增强影像高于周边肝实质。最近,JRGEN等制作了定位于血管内皮生长因子受体22和。

12、3整合素的双靶点靶向微泡,并在荷人卵巢癌的小鼠上进行B超显影,证明双靶点的靶向微泡能更多地聚集于靶肿瘤,达到更理想的肿瘤显影效果。大量研究已经表明,超声造影剂不仅仅可以提高图象的分辨率和对比度,其在体内亦可作为安全性和高效性的携带药物和基因的载体,在超声作用下能显著提高靶部位药物的传输效率而减少全身的毒副作用和明显提高局部细胞和组织的基因转染和表达。随着超声造影剂与超声造影设备的迅速发展,使得超声造影成为当前超声医学的热门研究课题。超声微泡联合超声技术介导基因和药物靶向治疗是利用超声空化效应,将带有药物或基因的微泡载体经外周静脉或局部注入体内,待其到达靶区后,用超声照射而使靶区产生空化效应,微。

13、泡内爆后将药物和基因释放入靶区。所释放的药物和基因可通过扩大的毛细血管内皮细胞进入组织间隙,最后由细胞膜上的小孔会集在细胞内,增强了外源基因的摄取、转染与表达,提高了药物的局部浓度,实现了靶向治疗的作用。HAYASHIDA等将无水酒精混合在常用于肝脏显像的CO2微泡中,经皮穿刺治疗后发现只需一次就可达到直径小于3CM的肿瘤坏死,并且注射的无水酒精量也大大减少,无严重并发症发生,治疗后无肝内及腹膜转移。AOI等以超声微泡为载体,将单纯疱疹胸腺激酶基因成功导入肿瘤细胞中,证明超声微泡作为一种新的基因递送方法用于肿瘤的基因治疗具有相当广泛的应用前景。0006综上所述,如果将磁性材料与超声脂质微泡相融。

14、合,形成载基因磁性超声脂质微泡,集两者优势于一体,在增强肿瘤影像的同时既能发挥靶向热化疗,基因治疗的功效,又可对肿瘤进行体外示踪,这将不失为超声造影领域的又一创举。发明内容0007本发明提供一种磁性载基因脂质超声微泡造影剂的制备方法,利用本发明可获得影像增强效果好、磁响应性强、分散性较好、粒径小的磁性载基因脂质超声微泡造影剂。本发明采用如下技术方案来解决其技术问题(1)用分析纯的FECL36H2O和FECL24H2O分别配制成01MOL/L的FECL3溶液和FECL2溶液,按FE3FE253分别加入100ML01MOL/L的FECL3和60ML01MOL/L的FECL2溶液于烧瓶中,在N2保护。

15、和磁力搅拌下滴加15MOL/L的NH4OH,溶液中迅速出现沉淀物,继续滴加说明书CN101987203A3/4页5NH4OH至反应液的PH9,沉淀物由红褐色逐渐转变为黑色,继续搅拌30MIN后停止。于80水浴恒温30MIN进行熟化,然后用强磁铁吸住烧瓶底部,倾去上层废液,用去离子水反复冲洗生成物,至其溶液PH7,将生成物真空干燥得FE3O4磁性纳米粒。0008(2)将FE3O4干粉溶于5G/L草酸溶液中配成质量分数为4的磁流体,超声分散后高速离心弃上清。沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中,边超声边缓慢加入适量PEI充分混匀,超声1H,磁力搅拌2H,使反应充分形成稳定的PEI/FE3O4纳米粒子。用蒸馏水。

16、、乙醇反复洗涤,干燥后将PEI/FE3O4纳米粒子与PEGFPC1质粒DNA按151的质量比充分混合,室温静置30MIN,得载基因FE3O4磁性纳米粒子。0009(3)将DSPC二硬脂酰磷脂酰胆碱、DPPE二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、DPPA(二苯基磷酰基叠氮化物)按111的比例溶于氯仿和异丙醇为21的有机溶剂中,超声20MIN使其充分溶解,于85C水浴中加热30MIN使有机溶剂蒸发完全,在西林瓶底部形成一脂质薄膜,以葡萄糖和丙二醇按41比例配置的水合液加入此西林瓶中,超声分散30MIN后使其形成充分的脂质悬液。在此悬液里加入40MG的PEG4000,60C加热使其完全溶解。将一定量DNA/PEI/。

17、FE3O4和明胶按21比例加入到脂质悬液中,后加吐温80001ML,使总体积为西林瓶的1/3。用5ML注射器充入1ML的SF6气体后置换西林瓶上方的空气。将此西林瓶放入频率4500HZ的机械振荡器中振荡60S,即得载基因磁性脂质超声微泡。0010与现有技术相比,本发明取得了如下有益效果1化学共沉淀法成功制备的FE3O4磁性纳米粒为黑色粉末状,用扫描电镜观察,FE3O4磁性纳米粒呈细颗粒状外观,大小较一致,平均粒径为15NM,呈散在分布或聚集成片。用能谱仪对FE3O4磁性纳米粒成份进行分析,可见其中仅含有铁和氧两种成分,质量百分含量与FE3O4中铁氧质量百分含量吻合。FE3O4磁性纳米粒经用PE。

18、I修饰后扫描电镜示分散性良好。实验表明PEI/FE3O4磁性纳米粒具有良好的DNA结合能力,且具有良好的超顺磁性和磁感应升温特性。在频率为230KHZ、功率为4KW,输出加热电流为20A的交变磁场照射下,一定浓度的PEI/FE3O4磁性纳米粒在50MIN后温度几乎不再上升而恒定保持在42C62C之间,此温度为肿瘤热疗的有效温度。因此,我们可以利用特定浓度的PEI/FE3O4在一定磁场下的升温而后保持恒温的性质来实现对肿瘤的热疗。00112采用机械振荡法制备的磁性脂质微泡光镜下呈圆球形外观,外包被一层脂质膜,内充有透亮的SF6气体,分散度好,马尔文粒径测量仪示平均粒径为1127NM。扫描电镜图示。

19、磁性脂质微泡近似圆球形,表面能谱分析结果示磁性脂质微泡中含有POFE等元素,其中P为脂质成分,FEO为磁性材料的成分,证实磁性脂质微泡已制备成功。研究表明,PEGFPC1/PEI/FE3O4磁性脂质微泡转染HEPG2细胞后,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达。00123采用20的乌拉坦5ML/KG经耳缘静脉将兔子麻醉后,经耳缘静脉团注01ML/KG的浓度为3109/ML的磁性脂质微泡溶液,即刻追注1ML的生理盐水。采用PHILIPS彩超诊断仪,用高频探头对兔肝进行造影,与造影前相比兔肝实质有明显的影像增强。00134在频率为230KHZ、功率为4KW,输出加热电流为20A的交变磁场照射下,磁。

20、性脂质微泡的升温能力与包被FE3O4磁性纳米粒子的浓度成正相关,浓度越大升温能力越强、温度上升越高,温度升高到某一定点后保持恒定,最终温度可保持在4245之间的肿瘤有效热疗温度范围。说明书CN101987203A4/4页600145一定量的载WTP53磁性脂质超声微泡体外作用于人肝癌细胞,不但可以通过磁感应靶向加热、还可以通过WTP53的转染和表达来共同抑制肝癌细胞的生长和促进其凋亡。它与单一的磁性脂质微泡磁感应热疗或单一的载WTP53基因磁性脂质超声微泡基因治疗相比,效果更加显著(P005)。00156作为一种新型的超声造影剂,载WTP53磁性脂质超声微泡既可保证影像增强,在超声引导下的同时。

21、又可对肿瘤进行基因治疗和热疗的联合治疗。具有靶向性好,安全性高的特点,有望为临床肝癌的治疗开辟新的路径。附图说明0016图1是本发明制得的磁性脂质微泡光镜图(400)。0017图2是荧光显微镜下磁性脂质微泡对HEPG2细胞转染效率图。0018图3是不同浓度磁性脂质微泡体外升温曲线图。0019图4是兔肝实质超声造影增强图(左图造影前右图造影后)。0020图5是磁性脂质微泡的扫描电镜图。0021图6是磁性脂质微泡的表面能谱分析。具体实施方式0022(1)用分析纯的FECL36H2O和FECL24H2O分别配制成01MOL/L的FECL3溶液和FECL2溶液,按FE3FE253分别加入100ML01。

22、MOL/L的FECL3和60ML01MOL/L的FECL2溶液于烧瓶中,在N2保护和磁力搅拌下滴加15MOL/L的NH4OH,溶液中迅速出现沉淀物,继续滴加NH4OH至反应液的PH9,沉淀物由红褐色逐渐转变为黑色,继续搅拌30MIN后停止。于80水浴恒温30MIN进行熟化,然后用强磁铁吸住烧瓶底部,倾去上层废液,用去离子水反复冲洗生成物,至其溶液PH7,将生成物真空干燥得FE3O4磁性纳米粒。0023(2)将FE3O4干粉溶于5G/L草酸溶液中配成质量分数为4的磁流体,超声分散后高速离心弃上清。沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中,边超声边缓慢加入适量PEI充分混匀,超声1H,磁力搅拌2H,使反应充分形成。

23、稳定的PEI/FE3O4纳米粒子。用蒸馏水、乙醇反复洗涤,干燥后将PEI/FE3O4纳米粒子与PEGFPC1质粒DNA按151的质量比充分混合,室温静置30MIN,得载基因FE3O4磁性纳米粒子。0024(3)将DSPC二硬脂酰磷脂酰胆碱、DPPE二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、DPPA(二苯基磷酰基叠氮化物)按111的比例溶于氯仿和异丙醇为21的有机溶剂中,超声20MIN使其充分溶解,于85C水浴中加热30MIN使有机溶剂蒸发完全,在西林瓶底部形成一脂质薄膜,以葡萄糖和丙二醇按41比例配置的水合液加入此西林瓶中,超声分散30MIN后使其形成充分的脂质悬液。在此悬液里加入40MG的PEG4000,60C加热使其完全溶解。将一定量DNA/PEI/FE3O4和明胶按21比例加入到脂质悬液中,后加吐温80001ML使总体积为西林瓶的1/3。用5ML注射器充入1ML的SF6气体后置换西林瓶上方的空气。将此西林瓶放入频率4500HZ的机械振荡器中振荡60S,即得载基因磁性脂质超声微泡。说明书CN101987203A1/3页7图1图2说明书附图CN101987203A2/3页8图3图4说明书附图CN101987203A3/3页9图5图6说明书附图。

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