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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510344993.9 (22)申请日 2015.06.23 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105055447 A (43)申请公布日 2015.11.18 (73)专利权人 中南大学湘雅二医院 地址 410008 湖南省长沙市芙蓉区人民中 路139号 (72)发明人 唐敬群 张美丽 喻风雷 向娟娟 李桂源 李征 (74)专利代理机构 中南大学专利中心 43200 代理人 胡奕 (51)Int.Cl. A61K 33/26(2006.01) A61K 9/。
2、16(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 31/517(2006.01) (56)对比文件 WO 2014/191569 A1,2014.12.04, WO 2014/191569 A1,2014.12.04, CN 101640088 A,2010.02.03, CN 101818128 A,2010.09.01, 审查员 万光 (54)发明名称 氧化铁纳米颗粒用于制备改善厄洛替尼耐 药性药物的应用 (57)摘要 本发明公开了氧化铁纳米颗粒用于制备改 善厄洛替尼耐药性药物的应用， 氧化铁纳米颗粒 用于制备改善厄洛替尼耐药性的药物时， 氧化铁 纳米颗粒与厄洛替尼。
3、的质量配比一般为： 140： 1， 氧化铁纳米颗粒每日用量不大于10mg/kg。 本 发明发现在体外培养的肺癌细胞H358和耐药细 胞株A549中同时用氧化铁纳米颗粒和厄洛替尼 处理， 结果显示可以显著增强抗肿瘤细胞增殖的 作用。 进一步的实验发现氧化铁纳米颗粒和厄洛 替尼联合应用可以显著抑制肿瘤的生长， 提示氧 化铁纳米颗粒可能通过ERBB2， ERBB3， ERBB4下游 的信号通路， 从而增强肺癌细胞对于厄洛替尼的 敏感性。 本发明为厄洛替尼抵抗的肺癌患者的临 床治疗提供了解决方案。 权利要求书1页 说明书3页 附图4页 CN 105055447 B 2018.03.13 CN 1050。
4、55447 B 1.氧化铁纳米颗粒用于制备改善厄洛替尼耐药性药物的应用， 所述氧化铁纳米颗粒与 厄洛替尼的质量配比为140： 1， 氧化铁纳米颗粒每日剂量不大于10mg/kg； 所述氧化铁纳米 颗粒直径不大于10nm； 所述氧化铁纳米颗粒的制备方法为： 将葡聚糖、 氯化亚铁、 氯化铁按 质量比39.6： 1： 2.7的比例混合， 60混合反应1h， 反应过程中缓慢滴加等体积的氨水； 反应 产物12000r/min离心15min， 取上清， 用0.22um滤膜过滤； 继续12000r/min离心， 去除上清， 用150mmol/LNaCl溶液洗涤后重悬， 得到所述氧化铁纳米颗粒。 权 利 要 求。
5、 书 1/1 页 2 CN 105055447 B 2 氧化铁纳米颗粒用于制备改善厄洛替尼耐药性药物的应用 技术领域 0001 本发明涉及物质的新的制药用途， 具体涉及氧化铁纳米颗粒在制备改善药物耐药 性中的应用。 背景技术 0002 肺癌是我国最常见的恶性肿瘤， 分子靶向治疗是治疗肺癌的新途径。 厄洛替尼 （英 文： Erlotinib ） 是目前晚期非小细胞肺癌的一线靶向治疗药物， 显著地延长了患者的生存 期。 厄洛替尼在不同的患者有不同的治疗效果， 其关键的分子标志物是表皮生长因子受体 （EGFR） 。 在一项被称为IPASS （EGFR抑制剂泛亚洲研究） 的研究中， EGFR小分子抑制。
6、剂在晚期 EGFR突变阳性肺腺癌患者的一线治疗中明显优于标准的化疗， 而EGFR突变阴性患者使用抑 制剂的疗效就差得多， 这提示EGFR突变是一个治疗的分子标志物。 然而尽管有EGFR激活突 变的肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂的反应更好， 但几乎所有的患者都会发生耐药， 引起肿 瘤复发。 研究表明： EGFR基因中的新突变以及EGFR下游的信号分子以及其他信号通路仍处 于激活状态是耐药产生的原因。 对于厄洛替尼耐药的肺癌患者并无很好的治疗方法， 目前 主要是采用联合用药对抗这种耐药性。 因此， 研究逆转厄洛替尼耐药的解决方法和机制， 对 于小细胞肺癌的治疗具有重要意义。 发明内容 0003 本发明。
7、的目的在于寻找到一种改善厄洛替尼耐药性的物质， 发现该物质与厄洛替 尼联合应用显著抑制肿瘤的生长， 从而了解到该物质新的医药用途， 从而解决厄洛替尼小 细胞肺癌治疗时产生耐药的问题。 0004 本发明的发明人团队经过大量研究证实： 氧化铁纳米颗粒可能通过ERBB2， ERBB3， ERBB4下游的信号通路， 从而增强肺癌细胞对于厄洛替尼的敏感性。 因此， 本发明提出： 氧化 铁纳米颗粒可以用于制备改善厄洛替尼耐药性的药物。 0005 氧化铁纳米颗粒用于制备改善厄洛替尼耐药性的药物时， 氧化铁纳米颗粒与厄洛 替尼的质量配比一般为： 140： 1， 氧化铁纳米颗粒每日用量不大于10mg/kg。 0。
8、006 氧化铁纳米颗粒具备超顺磁性， 生物安全度高， 广泛应用于人体磁共振成像的研 究。 而本发明人团队发现在体外培养的肺癌细胞H358和耐药细胞株A549中同时用氧化铁纳 米颗粒和厄洛替尼处理， 可以显著增强抗肿瘤细胞增殖的作用。 在裸鼠实验中， 用耐药细胞 株A549皮下成瘤构建移植瘤模型， 氧化铁纳米颗粒和厄洛替尼联合应用也可以显著抑制肿 瘤的生长， 提示氧化铁纳米颗粒和厄洛替尼有协同作用， 可以促进肺癌细胞对厄洛替尼的 敏感性。 本发明为厄洛替尼抵抗的肺癌患者的临床治疗提供了强有力的技术支持和分子生 物学基础， 具有深远的临床意义和推广性。 附图说明 0007 图1： 不同浓度的氧化铁。
9、纳米颗粒对肺癌A549细胞的增殖抑制作用； 说 明 书 1/3 页 3 CN 105055447 B 3 0008 图2: 氧化铁纳米颗粒与厄洛替尼联用对人非小细胞肺癌A549细胞的增殖抑制作 用； 0009 图3： 氧化铁纳米颗粒与厄洛替尼联用对人非小细胞肺癌H358细胞的增殖抑制作 用； 0010 图4： 裸鼠的皮下移植瘤抑制率实验中剥除后的瘤体对照图； 其中A为NC组， B为厄 洛替尼组， C为氧化铁纳米颗粒组， D为氧化铁纳米颗粒+厄洛替尼组； 0011 图5： 裸鼠的皮下移植瘤抑制率实验中体内成瘤生长曲线图； 0012 图6： A549和H358 EGFR磷酸化抗体芯片表达结果图； 。
10、0013 图7： A549EGFR磷酸化抗体芯片表达水平柱状图； 0014 图8： H358EGFR磷酸化抗体芯片表达水平柱状图。 具体实施方式 0015 实施例1： 氧化铁纳米颗粒的制作 0016 将葡聚糖、 氯化亚铁、 氯化铁按质量比39.6： 1： 2. 7 的比例混合, 60混合反应1 h, 反应过程中缓慢滴加等体积的氨水。 反应产物12 000 r/ min 离心15 min, 取上清, 用0.22um滤膜过滤。 继续12 000 r/ min， 去除上清， 用150 mmol/L NaCl 溶液洗涤后重悬。 0017 生成物的检测： 生成物氧化铁纳米颗粒的直径在10nm以下。 在酸。
11、性条件时， 纳米颗 粒的zeta电位为正电性； 在中性和碱性条件下， 纳米颗粒的zeta电位为负电性。 0018 实施例2： 氧化铁纳米颗粒对人非小细胞肺癌A549增殖抑制实验 0019 第一天每孔加入100ul 5000个小细胞肺癌A549细胞， 加培基至体积200ul， 第二天 待细胞贴壁后， 分别给予不同浓度 （2mM、 200uM、 20uM、 2uM、 200nM、 20nM、 2nM、 0.2nM、 0.02nM、 0.002nM） 氧化铁纳米颗粒处理。 在处理后2天， 每孔加入20微升CCK-8溶液。 在细胞培养箱内 继续孵育0.5-4小时， 在450nm测定吸光度。 0020 。
12、如图1所示， 不同浓度的氧化铁纳米颗粒处理肺癌A549细胞， 结果显示2mM和200uM 的氧化铁纳米颗粒对肺癌A549细胞有明显的抑制作用。 0021 实施例3： 氧化铁纳米颗粒和厄洛替尼联合用药对人非小细胞肺癌A549、 H358细胞 增殖实验 0022 第一天每孔加入100ul 5000个细胞非小细胞肺癌A549、 H358细胞， 加培基至体积 200ul， 第二天待细胞贴壁后， 给予不同浓度的厄洛替尼 （5uM、 10uM、 20uM、 40uM） 和200uM氧 化铁纳米颗粒处理。 在处理后的相应的天数， 每孔加入20微升CCK-8溶液。 在细胞培养箱内 继续孵育0.5-4小时， 在。
13、450nm测定吸光度。 0023 如图2和图3所示， 氧化铁纳米颗粒和厄洛替尼联合用药对人非小细胞肺癌A549、 H358细胞增殖抑制实验。 结果显示氧化铁纳米颗粒可以明显增强厄洛替尼的抑制肺癌细胞 A549 （见图2） 和H358 （见图3） 增殖的作用。 0024 实施例4： 裸鼠的皮下移植瘤抑制率实验 0025 BALB/C裸鼠， 雌性， 20-25克， SPF级； A549细胞浓度至107/毫升； 将106总数的A549细 胞注射至BALB/C裸鼠皮下， 等大约一个月后裸鼠皮下成瘤。 0026 将成瘤后小鼠分成4组， 分别为生理盐水注射组 （NC组） 、 厄洛替尼2.5mg/kg)注射。
14、 组， 氧化铁纳米颗粒(10mg/kg)注射组， 厄洛替尼2.5mg/kg)+氧化铁(10mg/kg)纳米颗粒注 说 明 书 2/3 页 4 CN 105055447 B 4 射组。 注射方式为腹腔注射荷瘤小鼠， 每两天给药一次。 分别于不同的时间点测量皮下瘤的 大小。 最后一次测量大小后， 引颈法处死小鼠， 称体重， 剥取瘤块。 0027 图4为剥除后的瘤体； 图5体内成瘤生长曲线。 如图4和图5所示， 氧化铁纳米颗粒和 厄洛替尼联合用药对人非小细胞肺癌A549裸鼠模型的肿瘤抑制作用。 结果显示氧化铁纳米 颗粒可以明显增强厄洛替尼的抑制裸鼠成瘤。 0028 实施例5： 氧化铁纳米颗粒引起EG。
15、FR下游的信号分子变化的细胞实验 0029 在50ml培养瓶中培养A549和H358细胞， 待细胞长满培养瓶的80%时， 将细胞用空白 对照、 厄洛替尼 （20uM ） 、 200uM氧化铁纳米颗粒、 厄洛替尼 （20uM ） +200uM氧化铁纳米颗粒 分四组进行分别处理。 处理48小时后， 用RayBiotech公司人类表皮生长因子受体磷酸化抗 体芯片试剂盒做EGFR下游的信号分子表达水平变化。 结果如图6-8所示： 图6为A549细胞和 H358细胞的EGFR磷酸化抗体芯片表达结果图， 图7为A549细胞EGFR磷酸化抗体芯片表达水 平柱状图， 图8为H358细胞EGFR磷酸化抗体芯片表达水平柱状图。 说 明 书 3/3 页 5 CN 105055447 B 5 图1 图2 说 明 书 附 图 1/4 页 6 CN 105055447 B 6 图3 图4 说 明 书 附 图 2/4 页 7 CN 105055447 B 7 图5 图6 说 明 书 附 图 3/4 页 8 CN 105055447 B 8 图7 图8 说 明 书 附 图 4/4 页 9 CN 105055447 B 9 。