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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711229476.2 (22)申请日 2017.11.29 (71)申请人 江苏农牧科技职业学院 地址 225300 江苏省泰州市凤凰东路8号 (72)发明人 王安平 朱善元 顾玲玲 吴双 郭长明 秦枫 张继玲 吴萌 (74)专利代理机构 北京汇知杰知识产权代理事 务所(普通合伙) 11587 代理人 杨巍 (51)Int.Cl. A61K 39/125(2006.01) A61P 31/14(2006.01) C12N 15/866(2006.01) C12N 15/6。
2、6(2006.01) (54)发明名称 一种表达鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联 病毒活载体疫苗及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种表达鸭肝炎病毒VP3基因 的重组禽腺联病毒活载体疫苗及其制备方法和 应用。 该疫苗由DHAV-1 VP3基因和重组禽腺联病 毒载体rAAAV组成， 所述VP3是DHAV抗原性的主要 决定基因。 本发明的疫苗操作简便， 易于进行扩 大生产； 禽腺联病毒无致病性， 安全性较高， 能介 导外源基因在各组织细胞中长期稳定的表达。 权利要求书2页 说明书5页 附图4页 CN 108187037 A 2018.06.22 CN 108187037 A 1.一种表。
3、达鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗， 其特征在于： 该疫苗由 DHAV-1VP3基因和重组禽腺联病毒载体rAAAV组成， 所述VP3是DHAV抗原性的主要决定因子。 2.一种表达鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗的制备方法， 其特征在 于： 包括以下步骤： (1)DHAV病毒总RNA的获取； (2)根据DHAV SH株VP3基因序列设计一对特异性引物， 在起始密码子上游引入Kozak序 列， 引物序列为： VP3-ITR-F:5 -GTACTCGAGACCATGGGAAAGAGAAAACCACGCAGG-3 VP3-ITR-R:5 -GTAGCGGCCGCTTACTG。
4、ATTATTGGTTGCCATCTGC-3 ； (3)通过RT-PCR扩增得到DHAV-VP3全长cDNA基因序列； (4)将VP3全长cDNA序列克隆至含有禽腺联病毒ITRs序列的杆状病毒转移载体pFB- AITR中， 获得重组质粒pFB-AITR-VP3； (5)将重组质粒pFB-AITR-VP3转化至DH10Bac感受态细胞进行同源重组， 通过抗性、 蓝 白斑筛选以及PCR鉴定后， 获得同源重组正确的杆粒BacmidDNA， 并利用碱裂解法提取杆粒； (6)将制备的重组BacmidDNA在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9， 72h后， 待细胞出现明 显病变， 收集细胞液， 即为P1代重组杆。
5、状病毒rBac-VP3； (7)将重组杆状病毒rBac-VP3扩增至P3代； (8)将P3代重组杆状病毒rBac-VP3与表达禽腺联病毒功能蛋白Rep的重组杆状病毒 rBac-Rep及表达禽腺联病毒结构蛋白的重组杆状病毒rBac-VP分别以感染复数为5共感染 悬浮培养的昆虫细胞Sf9， 72h后， 收集细胞沉淀， 反复冻融3次后， 离心收获上清， 即为含鸭 肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗。 3.根据权利要求2所述的表达鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗的制 备方法， 其特征在于： 步骤(3)中， 在PCR反应中， 反应热循环参数为： 95预变性3min， 95 变性3。
6、0s， 50退火30s， 72延伸1.5min， 35个循环后， 72延伸10min。 4.根据权利要求2所述的表达鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗的制 备方法， 其特征在于： 步骤(4)中， 在重组质粒pFB-AITR-VP3的构建中， 杆状病毒转移载体 pFB-AITR包括禽腺联病毒ITRs序列、 qCMV启动子、 EGFP开放阅读框和PolyA加尾信号， 即 ITR-qCMV-EGFP-PolyA-ITR。 5.根据权利要求2或4所述的表达鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗的 制备方法， 其特征在于： 步骤(4)中， 构建重组质粒的载体pFB-AITR， 是以I。
7、nvitrogen公司 Bac-to-Bac系统中的杆状病毒转移载体pFastBacDual为基础， 通过删除该载体本身所带的 两个启动子PpH和Pp10， 中间替换以两侧含有禽腺联病毒ITRs序列、 中间携带EGFP表达框的 DNA片段ITR-qCMV-EGFP-PolyA-ITR。 6.根据权利要求2所述的表达鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗的制 备方法， 其特征在于： 步骤(8)中， Sf9细胞的培养直接在摇瓶中进行， 初始接种密度不低于5 105cells/ml， 27105rpm培养至密度约2106cells/ml， 接种重组杆状病毒。 7.根据权利要求2所述的表达鸭肝。
8、炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗的制 备方法， 其特征在于： 步骤(8)中， 三种重组杆状病毒rBac-VP3、 rBac-Rep、 rBac-VP分别以感 染复数为5共同接种密度约2106cells/ml的Sf9细胞。 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 108187037 A 2 8.一种如权利要求1所述的表达鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗在 制备预防鸭病毒性肝炎药物中的应用。 9.一种如权利要求1所述的表达鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗在 制备治疗鸭病毒性肝炎药物中的应用。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 108187037 A 。
9、3 一种表达鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗 及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及动物病毒学与动物传染病学的技术领域。 本发明涉及 型鸭甲型肝炎 病毒和重组AAAV(禽腺联病毒)载体， 以及该重组病毒载体的构建方法和应用。 背景技术 0002 鸭病毒性肝炎(DuckViralHepatitis ， DVH)是一种由鸭甲型肝炎病毒 (DuckHepatitis AVirus， DHAV)感染导致的急性和高度致死性传染病， 可引起3周龄以下的 雏鸭发生急性肝炎， 1周龄以内的雏鸭病死率高达100， 是严重危害我国养鸭业的疾病之 一。 DHAV包括经典型(即我国原 型鸭肝。
10、炎病毒)、 台湾新型、 韩国新型三种亚型， 即 、 、 型， 3个亚型之间存在明显的差异， 且无交叉免疫性。 DHAV-I是目前流行最广、 危害最大的血 清型， 呈世界性分布， 对养鸭业危害最大。 0003 DHAV-I属于小RNA病毒科禽肝炎病毒属鸭甲型肝炎病毒种， VP0、 VP1和VP3是病毒 的结构蛋白， 其中， VP3蛋白位于衣壳表面， 相对保守， 是病毒粒子抗原性的主要决定因子， 存在着众多抗原表位， 可诱导机体产生免疫应答。 0004 目前鸭甲型肝炎鸡胚化弱毒疫苗和活疫苗是防治鸭肝炎的主要措施， 但从安全 性、 高效性等方面考虑仍存在许多问题， 如有效免疫、 免疫后的安全性、 病。
11、毒变异株的出现、 弱毒株的返强等问题， 传统免疫预防该病的形势严峻。 因此， 开展更安全、 有效的新型疫苗 的研制， 加快对雏鸭病毒性肝炎的研究进程和尽早控制该病的传播和流行非常重要。 0005 其中， 重组活载体疫苗兼具灭活疫苗的安全性好及活疫苗的免疫效果好、 成本低 等优点， 是今后疫苗研发的主要方向之一， 也是基因工程疫苗中最具发展意义的疫苗之一。 禽腺联病毒被证明能在禽源细胞中稳定表达外源基因， 具有无致病性、 免疫原性低、 细胞感 染谱广和外源基因表达稳定持续等优点， 被认为是一种很有应用前景的基因转移载体。 2008年， Perozo等以重组AAAV为载体分别构建了表达NDV和IB。
12、DV保护性抗原的重组活载体 疫苗， 均获得了良好的保护效果。 发明内容 0006 本发明的第一目的是提供一种表达鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒的构建 方法。 0007 本发明的第二目的是提供一种表达鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒活载体 疫苗， 以解决现有弱毒疫苗存在的毒力返强的问题。 0008 本发明的第三目的载体提供一种表达鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒活载 体疫苗在制备预防和治疗鸭病毒性肝炎药物中的应用。 0009 为实现上述目的， 本发明采用以下技术方案： 0010 一种表达鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗， 该疫苗由DHAV-1VP3 基因和重组禽腺联病。
13、毒载体rAAAV组成， 所述VP3是DHAV抗原性的主要决定因子。 说 明 书 1/5 页 4 CN 108187037 A 4 0011 一种表达鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗的制备方法， 包括以 下步骤： 0012 (1)获取DHAV病毒总RNA； 0013 (2)根据DHAVVP3基因序列设计一对引物， 在起始密码子上游引入Kozak序列， 特异 性扩增VP3基因， 引物序列为： 0014 VP3-ITR-F:5 -GTACTCGAGACCATGGGAAAGAGAAAACCACGCAGG-3 0015 VP3-ITR-R:5 -GTAGCGGCCGCTTACTGATTAT。
14、TGGTTGCCATCTGC-3 ； 0016 (3)通过RT-PCR扩增得到DHAV-VP3全长cDNA基因序列； 0017 (4)将VP3全长cDNA序列克隆入含有禽腺联病毒ITRs序列的杆状病毒转移载体 pFB-AITR中， 获得重组质粒pFB-AITR-VP3； 0018 (5)将重组质粒pFB-AITR-VP3转化至感受态细胞DH10Bac进行同源重组， 经过抗 性、 蓝白斑筛选及PCR鉴定后， 获得同源重组正确的杆粒BacmidDNA； 0019 (6)将提取的重组BacmidDNA在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9， 约72h后， 待细胞 出现明显病变， 收集细胞液， 即为P1代重。
15、组杆状病毒rBac-VP3； 0020 (7)将重组杆状病毒rBac-VP3按常规方法扩增至P3代； 0021 (8)将P3代重组杆状病毒rBac-VP3与表达禽腺联病毒功能蛋白Rep的重组杆状病 毒rBac-Rep及表达禽腺联病毒结构蛋白的重组杆状病毒rBac-VP分别以感染复数为5， 共感 染悬浮培养的昆虫细胞Sf9， 72h后， 收集细胞沉淀， 反复冻融3次后， 离心收集上清， 此即为 含鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗。 0022 步骤(3)中， 在PCR反应中， 反应热循环参数为： 95预变性3min， 95变性30s， 50 退火30s， 72延伸1.5min， 35。
16、个循环后， 72延伸10min。 0023 步骤(4)中， 在重组质粒pFB-AITR-VP3的构建中， 杆状病毒转移载体pFB-AITR包括 禽腺联病毒ITRs序列、 qCMV启动子、 EGFP开放阅读框和PolyA加尾信号， 即ITR-qCMV-EGFP- PolyA-ITR。 0024 步骤(4)中， 构建重组质粒载体所用到的载体pFB-AITR， 是以Invitrogen公司Bac- to-Bac系统中的杆状病毒转移载体pFastBacDual为基础， 通过删除该载体本身所带的两个 启动子PpH和Pp10， 中间替换以两侧含有禽腺联病毒ITRs序列、 中间携带EGFP表达框的DNA 片。
17、段ITR-qCMV-EGFP-PolyA-ITR。 0025 步骤(8)中， Sf9细胞的培养直接在摇瓶中进行， 初始接种密度不低于5 105cells/ml， 27105rpm培养至密度约2106cells/ml， 接种重组杆状病毒。 0026 步骤(8)中， 三种重组杆状病毒rBac-VP3、 rBac-Rep、 rBac-VP分别以感染复数为5 共同接种密度约2106cells/ml的Sf9细胞。 0027 本发明的表达鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗在制备预防鸭病 毒性肝炎药物中的应用。 0028 本发明的表达鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒活载体疫苗在制备治疗鸭病 。
18、毒性肝炎药物中的应用。 0029 有益效果： 本发明具有以下优点： 0030 (1)操作简便， 易于进行扩大生产， 昆虫细胞Sf9是一种悬浮培养细胞， 培养要求较 低， 非常适合在生产实践中大规模生产； (2)禽腺联病毒无致病性， 安全性较高， 能在禽源细 说 明 书 2/5 页 5 CN 108187037 A 5 胞中稳定表达外源基因； (3)与市场现有的弱毒疫苗相比， 本发明的重组活载体疫苗更加安 全有效。 附图说明 0031 图1为RT-PCR扩增VP3基因的电泳鉴定图； 其中， M： 1kbDNALadder； 1： VP3基因片段； 0032 图2为重组质粒pFB-AITR-VP3。
19、的酶切鉴定图； 其中， M： 1kbDNALadder； 1： pFB-AITR- VP3的NotI和XhoI双酶切； 0033 图3为重组质粒pFB-AITR-VP3的结构示意图； 0034 图4为重组杆粒BacmidDNA的PCR鉴定图； 其中， M： 1kbDNALadder； 1： 重组杆粒 BacmidDNA以M13-F/VP3-F为引物的PCR产物； 2： 重组杆粒BacmidDNA以M13-R/VP3-R为引物 的PCR产物； 0035 图5为本发明的表达鸭肝炎病毒VP3基因重组禽腺联病毒的透射电镜图； 其中， A: rAAAV-VP3的透射电镜图(97000)B:rAAAV-V。
20、P3的透射电镜图(195000)； 0036 图6为本发明的表达鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒的Westernblot分析 图； 其中， M： 蛋白Marker； 1： 空白对照； 2： 重组禽腺联病毒纯化产物 0037 图7为本发明的表达鸭肝炎病毒VP3基因重组禽腺联病毒的PCR鉴定图； 其中， M： 1kbDNALadder； 1： 重组禽腺联病毒核酸； 0038 图8为本发明的重组禽腺联病毒介导的VP3的体外细胞表达实验， 其中， A： 重组禽 腺联病毒感染的DF-1细胞； B： 未感染的正常细胞。 具体实施方式 0039 根据下述实施例， 可以更好的理解本发明。 然而， 本领域的。
21、技术人员容易理解， 实 施例所描述的具体的物料配比、 工艺条件及其结果仅用于说明本发明， 而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。 0040 实施例1： 通过常规方法提取DHAV病毒总RNA。 例如： 取10倍稀释的DHAVSH病毒株 0.2mL经尿囊腔接种9日龄鸭胚， 于37孵化箱孵化。 弃去48h内死亡的鸭胚， 将4872h之内 死亡的鸭胚置于4冰箱过夜， 收集鸭胚肝脏， 用剪刀剪碎研磨， 将研磨液反复冻融3次后， 按Trizol法提取病毒总RNA。 除上述方法外， 还可以采用其他常规方法提取DHAV总RNA， 本发 明对于具体方法不做限定。 0041 实施例2： 根据GenB。
22、ank中发表的DHAV-ISH株VP3基因序列设计一对引物， 上下游中 分别插入NotI和XhoI酶切位点， 为提高表达效率在起始密码子上游引入Kozak序列， 特异性 扩增VP3基因， 片段长度为711bp。 VP3基因的引物序列： 0042 VP3-ITR-F:5 -GTACTCGAGACCATGGGAAAGAGAAAACCACGCAGG-3 0043 VP3-ITR-R:5 -GTAGCGGCCGCTTACTGATTATTGGTTGCCATCTGC-3 ； 0044 实施例3： 扩增DHAV-VP3全长cDNA基因序列。 以提取的总RNA为模板， 根据 Invitrogen公司的RT-P。
23、CR试剂盒说明书进行操作， 反应体系为： RNA4 L、 DEPC7 L、 OligodT1 L、 5RTaseBuffer4 L、 RNA抑制剂1 L、 dNTP2 L、 RTase1 L， 总体积20 L。 反应程序设定为： 2510min； 4290min； 7010min。 以扩增的cDNA为模板， DNA高保真聚合酶扩增目的基因 VP3。 50 L反应体系： PfuDNA Polymerase1 L， 10Buffer5 L， dNTP(2mmol/L)5 L， PrimerF、 说 明 书 3/5 页 6 CN 108187037 A 6 PrimerR各2 L， cDNA2 L，。
24、 去离子水33 L。 反应热循环参数为： ： 95预变性3min， 95变性 30s， 50退火30s， 72延伸1.5min， 35个循环后， 72延伸10min。 反应结束后， 将PCR产物 进行1琼脂糖凝胶电泳检测。 0045 实施例4： 将实施例3扩增的VP3片段， 按AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒说明书回收。 VP3片段及含有禽腺联病毒ITRs序列的杆状病毒转移载体pFB-AITR经NotI和XhoI双酶切 后， 利用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收VP3DNA片段和空载体片段， 具体步骤参考试剂盒 说明书。 将回收的VP3DNA片段和空载体片段进行连接， 连接体系如下： 。
25、T4DNALigase0.2 L、 10buffer2 L、 VP32 L、 pFB-AITR2 L、 去离子水13.8 L， 总体积20 L， 鉴定正确的克隆命名 为pFB-AITR-VP3。 0046 实施例5： 将pFB-AITR-VP3转化至DH10Bac感受态细胞进行同源重组， 通过抗性和 蓝白斑筛选， 随机挑取数个白色菌落， 碱裂解法提取杆粒， 利用引物对M13-F： 5 - GTTTTCCCAGTCACGAC-3 ； M13-R： 5 -CAGGAAACAGCTATGAC-3 ， 通过PCR对其进行鉴定， 反应体 系： TaqDNA酶(5U/ L)0.5 L， M13-F、 M1。
26、3-R(25mmol/L)各2 L， 10PCRBuffer2.5 L， MgCl2 (25mM)2 L， dNTP(2.5mmol/L)2.5 L， 重组BacmidDNA1 L， DDW12.5 L， 总体积25 L。 反应热循 环参数为： 94预变性3min， 94变性45s， 55退火45s， 72延伸3min， 30个循环后， 72 终延伸10min。 反应结束后， PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳检测。 0047 实施例6： 将鉴定正确的重组BacmidDNA， 在脂质体介导下转染处于对数生长期的 昆虫细胞Sf9， 具体方法参照CellfectinReagent转染试剂说明书进行。 约。
27、72h后， 待细胞 出现明显病变， 收集细胞液， 即为P1代重组杆状病毒rBac-VP3。 0048 实施例7： 参照Invitrogen公司Bac-to-Bac说明书， 将P1代rBac-VP3按MOI为0.1感 染处于对数生长期的Sf9细胞， 直至约72h后， 细胞出现明显病变， 收集上清即为P2代重组病 毒， 按此方法将病毒传至P3代。 同样参照Invitrogen公司Bac-to-Bac说明书， 空斑试验测定 P3代rBac-VP3的病毒滴度为4.621012pfu/ml。 0049 实施例8： 将杆状病毒rBac-VP3与本实验已经制备的表达禽腺联病毒功能蛋白Rep 的重组杆状病毒r。
28、Bac-Rep及表达禽腺联病毒结构蛋白的重组杆状病毒rBac-VP分别以感染 复数为5， 共感染悬浮培养的密度为2106cells/ml的Sf9细胞， 72h后， 收集细胞沉淀， 经3 次反复冻融后， 离心收获上清， 即为含鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒rAAAV- DHAVP3。 0050 为检测rAAAV能否介导VP3基因表达， 将纯化的含鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺 联病毒rAAAV-DHAVP3感染DF-1细胞， 72h后， 以VP3多抗为一抗， FITC标记的羊抗兔IgG为二 抗进行间接免疫荧光检测， 结果rAAAV-DHAVP3感染的DF-1细胞在显微镜下可以观察到明显 的。
29、绿色荧光， 而未感染的细胞中未见荧光， 见图8， 说明重组禽腺联病毒能介导VP3基因在鸡 细胞中表达。 0051 将纯化的含鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒rAAAV-DHAVP3以免疫剂量为2 1010V.G.经肌肉免疫3日龄SPF级雏鸭， 以商品化弱毒疫苗A66作为阳性对照， PBS组作为阴 性对照， 于注射7d和14d后采集血请， 通过间接ELISA检测抗体效价。 ELISA结果显示rAAAV- DHAVP3可以刺激雏鸭产生较高滴度的抗体， 其水平与弱毒疫苗组相当。 如表1。 0052 以上说明， 本发明的含鸭肝炎病毒VP3基因的重组禽腺联病毒可作为预防和治疗 鸭病毒性肝炎用药物进行。
30、开发。 说 明 书 4/5 页 7 CN 108187037 A 7 0053 表1重组禽腺联病毒rAAAV-VP3免疫雏鸭的抗体检测 0054 0055 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说 明 书 5/5 页 8 CN 108187037 A 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/4 页 9 CN 108187037 A 9 图3 图4 说 明 书 附 图 2/4 页 10 CN 108187037 A 10 图5 图6 说 明 书 附 图 3/4 页 11 CN 108187037 A 11 图7 图8 说 明 书 附 图 4/4 页 12 CN 108187037 A 12 。