《一种抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法.pdf（17页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410492940.7 (22)申请日 2014.09.24 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104208719 A (43)申请公布日 2014.12.17 (73)专利权人 北京天广实生物技术股份有限公 司 地址 101111 北京市大兴区亦庄经济技术 开发区东区经海1路科创14街99号汇 龙森科技园3号楼 专利权人 浙江海正药业股份有限公司 (72)发明人 刘慧芳 黎晓维 金春阳 郜富权 谢晨颖 王海彬 李锋 (74)专利代理机构 北京国林贸知识产权代。
2、理有 限公司 11001 代理人 李桂玲 许文娟 (51)Int.Cl. A61K 47/68(2017.01) B01D 15/36(2006.01) 审查员 许慧 (54)发明名称 一种抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化 方法 (57)摘要 本发明提供了一种抗体偶联药物 （ADC） 的阳 离子交换层析纯化方法， 所述阳离子交换层析可 选用结合-洗脱模式或过载模式进行纯化， 可将 ADC药物的偶联比 （DAR） 控制在目标工艺范围内， 同时起到去除多聚体的作用。 这是一种新的ADC 制备纯化工艺， 可降低生产的成本和风险， 同时 实现对ADC药物的小分子/抗体的摩尔偶联比 （DAR） 和多聚体。
3、的控制， 有助于开发可控性更强、 成本和风险更低的ADC生产工艺， 以获得质量更 高的产品， 保证用药安全和治疗效果。 权利要求书1页 说明书8页 附图7页 CN 104208719 B 2017.05.03 CN 104208719 B 1.一种抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法， 其特征在于， 利用阳离子交换层析 来纯化抗体偶联药物， 控制小分子/抗体偶联比 （DAR） 和多聚体， 所述纯化方法包括以下步 骤： 调节ADC样品及平衡缓冲液至pH 4-7、 电导2-8 mS/cm， 选用结合-洗脱模式或过载模式 进行纯化； 所述的抗体偶联药物由小分子毒素通过接头与抗体偶联构成， 其中偶联比。
4、 （DAR） 为2- 5； 所述的过载模式上样量不低于300 mg/mL介质； 所述的过载模式的过程包括： 平衡缓冲液平衡层析介质， 然后进行抗体偶联药物上样， 待ADC样品吸附饱和继而开始流穿后， 收集目标蛋白流穿液， 杂质多聚体以及DAR值偏高的 蛋白质则吸附在层析柱上； 所述的结合-洗脱模式上样量不超过层析介质实际动态载量的90%； 所述的结合-洗脱模式的过程包括： 平衡缓冲液平衡层析介质， 然后进行抗体偶联药物 上样， 并用pH 4-7、 电导10-30 mS/cm的洗脱缓冲液对结合的ADC抗体进行梯度洗脱， 收集目 标蛋白洗脱液， 而杂质多聚体以及DAR值偏高的蛋白质则在其后洗脱出来。
5、； 所述的阳离子交换层析介质选自Eshmuno CPX、 POROS HS、 POROS XS、 Toyopearl Gigacap S-650M、 Toyopearl SP-650M、 Nuvia HR-S和SP Sepharose。 2.如权利要求1所述的抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法， 其特征在于， 所述的 平衡缓冲液和洗脱缓冲液为醋酸盐缓冲液、 柠檬酸盐缓冲液、 琥珀酸缓冲液或磷酸盐缓冲 液。 3.如权利要求1所述的抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法， 其特征在于， 所述的 抗体为单克隆抗体。 4.如权利要求3所述的抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法， 其特征在于， 所述的 。
6、单克隆抗体为人源化单克隆抗体。 5.如权利要求1所述的抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法， 其特征在于， 所述的 小分子毒素包括美登素及其衍生物和海兔毒素及其衍生物。 6.如权利要求3-5任一项所述的抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法， 其特征在 于， 所述的抗体偶联药物的偶联方式包括赖氨酸偶联、 轻重链间还原性二硫键偶联和定点 偶联。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104208719 B 2 一种抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法 技术领域 0001 本发明属于蛋白质分离纯化技术领域， 具体而言， 本发明涉及一种抗体偶联药物 (ADC)的阳离子交换层析纯化方法。 技术背景 。
7、0002 抗体-小分子药物偶联物(Antibody-drug conjugate， ADC)是新一代抗体靶向治 疗药物， 主要应用于癌症肿瘤的治疗。 ADC药物由小分子细胞毒性药物(Drug)、 抗体 (Antibody)以及连接抗体和化药的接头(Linker)三部分组成， 小分子毒素通过化学偶联的 方法结合到抗体蛋白上。 抗体会特异地识别并引导小分子药物到达表达癌症特异性抗原的 癌细胞靶点， 并通过细胞内吞效应进入癌细胞。 接头部分在胞内低pH值环境或溶酶体蛋白 酶的作用下断裂， 释放出小分子细胞毒素， 从而达到特异杀死癌细胞而不损伤正常组织细 胞的作用。 因此， ADC药物同时结合了抗体的。
8、靶向专一性和小分子毒素对癌细胞的高毒性的 特点， 大大扩展了药物的有效治疗剂量窗口(Therapeutic window)。 临床研究已证明， ADC 抗体药效高、 在血液中相对稳定， 能有效地降低小分子细胞毒素(化药)本身对循环系统以 及健康组织的毒性， 是目前国际上抗癌药物的研发热点(Rachel S.Zolot,Satarupa Basu, Ryan P.Million.Antibodydrug conjugates.Nature reviews Drug Discovery.2013, 12:259-260)。 0003 目前国外已有两个ADC药物获批上市销售。 2011年8月19日，。
9、 FDA批准Seattle Genetics公司开发的Brentuximab Vedotin(商品名Adcetris)上市， 用于治疗CD30阳性的 霍杰金淋巴瘤(HL)和罕见疾病系统性间变性大细胞淋巴瘤(SALCL)。 2013年2月22日， Genentech公司开发的ado-trastuzumab emtansine(T-DM1， 商品名Kadcyla)获FDA批准上 市销售， 主要用于治疗Her2阳性晚期(转移性)乳腺癌。 另外， 国际上还有超过30种ADC药物 处在临床开发阶段(Asher Mullard.Maturing antibodydrug conjugate pipelin。
10、e hits30.Nature reviews Drug Discovery,2013,12:329-332)。 0004 目前ADC药物常用的偶联方式包括： 赖氨酸偶联、 轻重链间还原性二硫键偶联和定 点偶联(Beck A， Reichert J M.Antibody-drug conjugates:Present and future.MAbs, 2014,6:15-17)。 赖氨酸随机偶联平台技术利用双功能团交联试剂， 对抗体的赖氨酸残基进 行随机修饰， 再与美登素衍生物DM1、 DM4或其它类似物的巯基反应实现偶联， 已经上市的T- DM1(Kadcyla)即采用这一技术。 轻重链间还。
11、原性二硫键偶联则通过还原抗体链间的二硫键 产生的半胱氨酸残基， 再与含多肽接头的海兔毒素衍生物甲基澳瑞他汀E(MMAE)、 甲基澳瑞 他汀F(MMAF)或其它类似物反应实现偶联， 另一种市售的ADC药物Adcetris则采用了这种平 台技术。 定点偶联模式目前还处于早期研发阶段(Siler Panowski,Sunil Bhakta,Helga Raab,Paul Polakis and Jagath R Junutula .Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy.MAbs,2014,6:3445)。 0005 对于赖。
12、氨酸随机偶联技术， 由于IgG单克隆抗体上有几十个赖氨酸残基可供修饰， 因此双功能交联试剂与赖氨酸残基的连接是非特异的， 小分子毒素与抗体结合数量和位置 说 明 书 1/8 页 3 CN 104208719 B 3 呈随机正态分布模式。 而对于轻重链间还原性二硫键偶联， 如IgG1单抗中有8个链间半胱氨 酸可供偶联。 偶联位点的多样性导致了ADC产品的异质性， 偶联反应得到的产品实际是各种 ADC的混合物， 因此小分子药物和抗体的摩尔偶联比(Drug Antibody Ratio， DAR)是十分重 要的质控参数。 DAR值代表每个抗体上平均偶联的小分子个数， DAR值过低则导致ADC药物未 。
13、能达到预期的生物活性， 而DAR值过高则会影响ADC药物的安全性、 稳定性及代谢特征， 甚至 药效也有可能随着DAR值的增加而降低(Hamblett KJ， Senter PD， Chace DF， et al.Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody drug conjugate.Clin Cancer Res， 2004， 10:7063-7070)。 对于目前已经上市的ADC药物而 言， 理想的DAR值应该控制在34之间， 甚至更窄的范围。 另外， 由于偶联工艺过程常涉及有 机溶剂。
14、的加入以及搅拌操作， 不可避免地导致抗体蛋白产生交联物和多聚体， 这些与工艺 相关的杂质常可能引起免疫原性及其他副作用。 0006 鉴于DAR值和多聚体含量均为ADC药物的关键质控参数， 因此需要从偶联和纯化工 艺着手， 将DAR值控制在目标范围内， 确保批间生产的一致性和稳定性， 并尽可能控制和去 除产品中副产物聚集体的含量。 修饰偶联工艺非常复杂， 尤其是随机偶联工艺。 如要将DAR 值控制在很窄的范围内相当具有难度， 对工艺的要求极高。 而偶联工艺失败的概率高(主要 体现在DAR值的控制方面)， 若没有很好的手段避免DAR值控制失败的风险， 则会使生产成本 大量增加。 对现有技术文献进行。
15、检索后发现， ADC药物的纯化工艺主要涉及采用G25葡聚糖 凝胶层析或切向流过滤(UF/DF)的方式去除未偶联到抗体上的小分子接头和小分子毒素， 其层析介质和膜介质均为非离子交换模式(CN 101267841B； Brun MP ,Gauzy-Lazo L.Protocols for lysine conjugation.Methods Mol Biol.,2013,1045:173-87； Stefano JE,Busch M,Hou L,Park A,Gianolio DA.Micro-and mid-scale maleimide-based conjugation of cytotox。
16、ic drugs to antibody hinge region thiols for tumor targeting.Methods Mol Biol.,2013,1045:145-71)。 而阴离子层析介质在ADC药物纯化的 应用发面， 也仅涉及采用流穿模式的阴离子层析方法进行多聚体的去除(CN 103254311 A)。 通过纯化手段控制DAR值的技术目前是空缺的。 另外， 无论随机偶联还是定点偶联技术， 均存在修饰偶联反应过程中蛋白质聚集的问题。 若能通过纯化的手段， 降低抗体偶联药物 的副产物， 同时提高DAR值的可控性， 对于提升ADC产品质量以及降低工艺风险和成本而言， 具有十。
17、分重要的现实意义。 发明内容 0007 针对ADC药物纯化方面现有技术的不足和空缺， 本发明提供了一种抗体偶联药物 (ADC)的阳离子交换层析纯化方法， 通过所述阳离子纯化技术， 同时实现对ADC药物的小分 子/抗体的摩尔偶联比(DAR)和多聚体的控制， 这有助于开发可控性更强、 成本和风险更低 的ADC生产工艺， 以获得质量更高的产品， 保证药物的安全性和治疗效果。 0008 为了实现上述目的， 本发明详细的技术方案如下： 0009 一种抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法， 利用阳离子交换层析来纯化抗体 偶联药物， 控制小分子/抗体偶联比(DAR)和多聚体， 所述纯化方法包括以下步骤： 0。
18、010 调节ADC样品及平衡缓冲液至pH 4-7、 电导2-8mS/cm， 选用结合-洗脱模式或过载 模式进行纯化。 说 明 书 2/8 页 4 CN 104208719 B 4 0011 进一步的， 所述的过载模式上样量不低于300mg/mL介质； 所述的过载模式的过程 包括： 平衡缓冲液平衡层析介质， 然后进行抗体偶联药物上样， 待ADC样品吸附饱和继而开 始流穿后， 收集DAR值和多聚体含量符合要求的目标蛋白流穿液， 杂质多聚体以及DAR值偏 高的蛋白质则吸附在层析柱上。 0012 进一步的， 所述的结合-洗脱模式上样量不超过层析介质实际动态载量的90； 所 述的结合-洗脱模式的过程包括。
19、： 平衡缓冲液平衡层析介质， 然后进行抗体偶联药物上样， 并用洗脱缓冲液(pH 4-7， 电导10-30mS/cm)对结合的ADC抗体进行梯度洗脱， 分段收集洗脱 液， 收集DAR值和多聚体含量符合要求的目标蛋白洗脱液， 而杂质多聚体以及DAR值偏高的 蛋白质则在其后洗脱出来。 0013 进一步的， 所述的平衡缓冲液和洗脱缓冲液选自但不限于醋酸盐缓冲液、 柠檬酸 盐缓冲液、 琥珀酸缓冲液或磷酸盐缓冲液。 0014 进一步的， 所述的阳离子交换层析介质选自但不限于Eshmuno CPX(Millipore)、 POROS HS(AB)、 POROS XS(AB)、 Toyopearl Gigac。
20、ap S-650M(TOSOH)、 Toyopearl SP-650M (TOSOH)、 Nuvia HR-S(Bio-Rad)和SP Sepharose(GE)， 优选Eshmuno CPX和POROS XS这两种 新型的高载量阳离子层析介质。 0015 进一步的， 所述的抗体偶联药物由小分子毒素通过接头与抗体偶联构成， 其中偶 联比(DAR)为2-5。 尤其适用于处理DAR值偏高(3.7)的ADC样品。 0016 进一步的， 所述的抗体为单克隆抗体， 优选的， 所述的单克隆抗体为人源化单克隆 抗体。 0017 进一步的， 所述的小分子毒素选自但不限于美登素及其衍生物和海兔毒素及其衍 生物。。
21、 0018 进一步的， 所述的抗体偶联药物的偶联方式包括但不限于赖氨酸偶联、 轻重链间 还原性二硫键偶联和定点偶联。 0019 收集的样品分别采用紫外(UV)分光光度法进行DAR值监测， 采用分子排阻液相色 谱法(SEC-HPLC)进行多聚体含量监测。 0020 本发明中， ADC样品的定义为： 将抗体通过接头与小分子毒素进行共价结合后所形 成的抗体偶联药物， 涉及赖氨酸偶联、 轻重链间还原性二硫键偶联和定点偶联等不同的偶 联方式。 所述的抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体， 优选单克隆抗体。 小分子毒素可选自美 登素衍生物DM1(N2 -脱乙酰-N2 -3-巯基-1氧代丙基)-美登素)、 DM4。
22、(N2 -脱乙酰-N2 -4- 甲基-4巯基-1氧代戊基)-美登素)及其类似物、 海兔毒素衍生物MMAE(Monomethyl Auristatin E， 甲基澳瑞他汀E)、 MMAF(Monomethyl Auristatin F， 甲基澳瑞他汀F)及其类 似物。 优选的小分子毒素为DM1。 所述的接头优选为SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷- 1-羧酸琥珀酰亚胺酯)。 0021 本发明通过pH 4-7、 电导2-8mS/cm范围内的动态载量DOE实验确定所述的阳离子 交换层析法的上样条件。 0022 在本发明中， 所述的过载阳离子交换层析法采用流穿模式， 适用于大规模样品的 处理。
23、， 层析载量超过300mg/mL介质。 0023 在本发明中， 所述的阳离子交换层析法采用结合-洗脱模式， 上样量不超过层析介 质实际动态载量的90。 对于高载量阳离子层析介质而言， 通过控制收集范围可将DAR值维 说 明 书 3/8 页 5 CN 104208719 B 5 持在极窄的目标范围(3.50.1)内。 对于赖氨酸偶联的ADC样品， 多聚体的去除率可达到 40以上， 回收率可维持在86以上； 对于半胱氨酸偶联的ADC样品， 多聚体的去除率可达 到60以上， 回收率也可维持在79以上。 0024 本发明相比现有技术的有益效果为： 0025 1、 本发明提供了一种ADC制备和纯化的新思。
24、路。 ADC药物的DAR值决定了产品的有 效性和毒性， 因此需将其控制在一个稳定的范围内。 另外， 作为工艺相关杂质， 多聚体的存 在会引起免疫原性， 应尽可能使产品中多聚体的含量降至最低。 本发明通过一种纯化的手 段， 即采用阳离子交换层析的方法， 对修饰偶联工艺的关键中控指标DAR值实施有效地控制 和纠偏， 同时实现多聚体的大比例去除； 本发明有别于传统裸抗体的纯化策略， 首次将阳离 子交换层析应用于ADC样品的DAR值控制， 扩展了阳离子交换层析方法的应用范围和用途； 0026 2、 本发明还提供过载模式与结合-洗脱模式这两种不同的纯化方案， 在实际研发 和生产过程中， 可根据工艺规模、。
25、 处理量、 产品的状态灵活地选择最适合的纯化方式。 如过 载模式尤其适用于大量ADC样品的纯化， 因其受纯化介质的载量限制较少， 而且操作简便。 而结合-洗脱模式虽然处理量不如过载模式， 但可通过控制收集范围对DAR值和多聚体含量 实现更为精细的控制。 综上所述， 本发明可起到降低ADC产品的生产成本和控制风险、 提高 工艺可控性和产品质量的作用。 附图说明 0027 图1为实施例5中三种层析介质POROS HS(A)、 POROS XS(B)和Eshmuno CPX(C)的动 态载量(DBC)等高线图， 横坐标为pH， 纵坐标为电导。 颜色越深的区域DBC越高， 亦即选用颜 色越深的区域所对。
26、应的pH和电导， 介质对样品的吸附载量越高。 DOE实验的考察范围为pH 4-7， 电导2-8mS/cm。 0028 图2为实施例6中采用层析介质POROS HS的过载模式进行不同流速纯化ADC样品的 结果。 其中图A为AKTA谱图， 横坐标为ADC样品的上样量， 纵坐标为UV280nm处的吸收值(mAU)， 样品吸附饱和后开始流穿， P1和P2分别为400mM醋酸钠缓冲液(pH 5， 电导24mS/cm)洗脱峰 和0.5M NaOH洗脱峰。 其中图B为多聚体及DAR值的测定结果， 横坐标为经纯化的ADC样品的 合并收集量(mg)， 左纵坐标为收集的样品合并后的多聚体含量与原液中多聚体含量的比。
27、值 (C/C0)， 右纵坐标为收集的样品所对应的合并后DAR值。 先流穿出来的ADC样品， 多聚体含量 和DAR值均较低。 不同流速下， DAR值曲线均呈上升趋势， 而C/C0曲线上升的速率不同， 低流 速下C/C0到达平台期更缓慢， 有利于多聚体的去除。 0029 图3-图7均为实施例7中的结合-洗脱模式纯化结果， 其中图3、 图4、 图5分别为层析 介质POROS 50HS(图3)、 POROS XS(图4)和Eshmuno CPX(图5)在赖氨酸偶联ADC样品中的应 用， 图6、 图7分别为层析介质POROS XS(图6)和Eshmuno CPX(图7)在半胱氨酸偶联ADC样品 中的应用。
28、。 其中A图为纯化AKTA色谱图， 横坐标为流出体积(mL)， 左纵坐标为UV280nm处的吸收 值(mAU)， 右纵坐标为溶液的电导值， ADC样品随着电导逐渐升高不断被洗脱下来。 其中B图 为分段收集ADC样品的多聚体(HMW)和DAR值测定结果， 横坐标为收集的体积， 左纵坐标为收 集的样品中多聚体含量与原液中聚体含量的比值(C/C0)， 右纵坐标为收集的样品所对应的 DAR值。 先洗脱出来的样品多聚体含量低， DAR值也较低； 而多聚体含量高、 DAR值较高的组分 则在其后洗脱下来， 这样就可达到分离多聚体组分和控制样品DAR值的目的。 图C为分子排 说 明 书 4/8 页 6 CN 。
29、104208719 B 6 阻色谱(SEC-HPLC)的色谱图， 横坐标为蛋白质出峰时间(min)， 纵坐标为UV280nm处的吸收值 (mAU)， 单体目标蛋白在15-16min出峰， 多聚体在12-14min出峰， 后洗脱出来的样品多聚体 比例明显升高。 具体实施方式 0030 实施例1 0031 一种抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法， 利用阳离子交换层析来纯化抗体 偶联药物， 控制小分子/抗体偶联比(DAR)和多聚体， 所述纯化方法包括以下步骤： 0032 调节ADC样品及平衡缓冲液至pH 4-7、 电导2-8mS/cm， 选用结合-洗脱模式或过载 模式进行纯化。 0033 进一步的。
30、， 所述的过载模式上样量不低于300mg/mL介质； 所述的过载模式的过程 包括： 平衡缓冲液平衡层析介质， 然后进行抗体偶联药物上样， 待ADC样品吸附饱和继而开 始流穿后， 收集DAR值和多聚体含量符合要求的目标蛋白流穿液， 杂质多聚体以及DAR值偏 高的蛋白质则吸附在层析柱上。 0034 进一步的， 所述的结合-洗脱模式上样量不超过层析介质实际动态载量的90； 所 述的结合-洗脱模式的过程包括： 平衡缓冲液平衡层析介质， 然后进行抗体偶联药物上样， 并用洗脱缓冲液(pH 4-7， 电导10-30mS/cm)对结合的ADC抗体进行梯度洗脱， 分段收集洗脱 液， 收集DAR值和多聚体含量符合。
31、要求的目标蛋白洗脱液， 而杂质多聚体以及DAR值偏高的 蛋白质则在其后洗脱出来。 0035 进一步的， 所述的平衡缓冲液和洗脱缓冲液选自但不限于醋酸盐缓冲液、 柠檬酸 盐缓冲液、 琥珀酸缓冲液或磷酸盐缓冲液。 0036 进一步的， 所述的阳离子交换层析介质选自但不限于Eshmuno CPX(Millipore)、 POROS HS(AB)、 POROS XS(AB)、 Toyopearl Gigacap S-650M(TOSOH)、 Toyopearl SP-650M (TOSOH)、 Nuvia HR-S(Bio-Rad)和SP Sepharose(GE)， 优选Eshmuno CPX和PO。
32、ROS XS这两种 新型的高载量阳离子层析介质。 0037 进一步的， 所述的抗体偶联药物由小分子毒素通过接头与抗体偶联构成， 其中偶 联比(DAR)为2-5。 尤其适用于处理DAR值偏高(3.7)的ADC样品。 0038 进一步的， 所述的抗体为单克隆抗体， 优选的， 所述的单克隆抗体为人源化单克隆 抗体。 0039 进一步的， 所述的小分子毒素选自但不限于美登素衍生物和海兔毒素衍生物。 0040 进一步的， 所述的抗体偶联药物的偶联方式包括但不限于赖氨酸偶联、 轻重链间 还原性二硫键偶联和定点偶联。 0041 收集的样品分别采用紫外(UV)分光光度法进行DAR值监测， 采用分子排阻液相色 。
33、谱法(SEC-HPLC)进行多聚体含量监测。 0042 本发明通过pH 4-7、 电导2-8mS/cm范围内的动态载量DOE实验确定所述的阳离子 交换层析法的上样条件。 0043 实施例2 抗体偶联药物(ADC)的制备 0044 赖氨酸偶联ADC样品的制备： 进行修饰反应前， 将抗体(Ab)原液置换至修饰反应缓 冲溶液中。 加入双功能交联试剂SMCC(接头)对赖氨酸进行修饰， 反应持续2-3小时。 修饰反 说 明 书 5/8 页 7 CN 104208719 B 7 应结束后， 通过G25葡聚糖凝胶层析或切向流过滤(UF/DF)系统除去未与抗体连接的SMCC， 并将修饰后的中间产物Ab-MCC。
34、置换到偶联缓冲液(pH 5-6)中。 随后加入小分子毒素DM1， 与 抗体上的接头偶联， 反应持续3-15小时， 得到备用的赖氨酸偶联ADC样品(Ab-DM1)， 紫外分 光光度法测得DAR值为3.7-3.8。 0045 半胱氨酸偶联ADC样品的制备： 将Ab原液置换至反应缓冲液中(pH 7-8)。 加入还原 剂TCEP反应1-2小时， 使得抗体的链间二硫键被打开， 形成游离的巯基。 随后加入连有接头 的小分子毒素MMAE(MC-VC-PAB-MMAE)， 与抗体上被还原的巯基偶联。 反应结束后， 加入N-乙 酰基-L-半胱氨酸(NAC)终止反应。 调节pH至5-6， 得到备用的半胱氨酸偶联A。
35、DC样品(Ab- MMAE)， 紫外分光光度法测得DAR值为4.1-4.2。 0046 实施例3 DAR值测定 0047 实施例2制备所得的ADC样品， 采用紫外(UV)分光光度法测定小分子药物/抗体的 偶联比。 根据抗体和药物在不同波长处的消光系数不同， 由二元一次方程求导药物抗体偶 联比(DAR)。 具体为： 将抗体偶联物稀释至0.30.5mg/mL， 在230330nm波长内对稀释后的 ADC样品进行吸光度扫描。 抗体的最大吸收峰在280nm， 小分子DM1的最大吸收峰在252nm， 小 分子MMAE的最大吸收峰在248nm。 对于Ab-DM1样品分别选取252nm和280nm处的吸光度。
36、， 对于 Ab-MMAE样品则分别选取248nm和280nm处的吸光度， 按照文献(于传飞等.一种抗体药物偶 联物中药物抗体偶联比的测定.药学学报,2014,49(3):363-367)所述的方法， 计算DAR值以 及ADC样品的浓度。 0048 实施例4 多聚体检测 0049 实施例2制备所得的ADC样品， 通过分子排阻色谱法(SEC)测定其多聚体的含量。 所 使用的液相色谱柱为TSKG3000SWXL， 使用的高效液相系统为Agilent HPLC系统。 流动相为 含15异丙醇的磷酸盐缓冲液(pH 7)， 检测波长为280nm。 充分平衡色谱柱， 待基线稳定后 进样。 进行等度洗脱， 流速。
37、为0.5mL/min， 柱温25。 按照面积归一法计算ADC样品中多聚体 和单体所占的比例。 0050 实施例5 不同的层析介质中ADC样品的动态载量 0051 将实施例2中制得的ADC样品置换到65mM醋酸钠缓冲液中(pH 5-6， 电导5mS/cm)。 置换后的样品等分后， 分别用1M醋酸或1M NaOH将ADC样品的pH调整至4-7， 用相应pH的 400mM醋酸钠缓冲液或纯化水调节电导至2-8mS/cm。 分别将层析介质POROS HS、 POROS XS和 Eshmuno CPX装填到层析柱中。 利用AKTA Purifier 100层析系统， 以相应pH和电导的醋酸 钠缓冲液(10。
38、倍柱体积以上)充分平衡层析柱后， 以120cm/hr的流速上样， 通过UV280nm处的吸 收值监测样品的流穿情况。 待UV280nm曲线上升趋于平缓， 结束上样。 流动相切换成400mM醋酸 钠缓冲液进行洗脱， 最后用0.5M NaOH溶液清洗层析柱。 计算10穿透时的动态载量。 利用 JMP 10软件， 绘制不同的层析介质、 不同的pH和电导条件下测得的ADC样品动态载量结果的 等高线图， 结果如附图1所示。 依此确定阳离子交换层析的上样条件， 上样载量控制为不超 过层析介质实际动态载量的90。 可以看到， Eshmuno CPX和POROS XS这两种新型的阳离子 纯化介质具有较高的动态。
39、载量。 0052 实施例6 采用过载模式的阳离子交换层析方法纯化ADC样品 0053 将实施例2中制得的ADC样品置换到90mM醋酸钠缓冲液中(pH 5， 电导6mS/cm)。 将 层析介质POROS 50HS装填到层析柱中， 利用AKTA Purifier 100层析系统进行过载模式的 说 明 书 6/8 页 8 CN 104208719 B 8 阳离子层析实验。 用90mM醋酸钠缓冲液(pH 5， 电导6mS/cm)充分平衡层析柱后上样， 上样量 为1100-1300mg/mL介质。 为了考察流速对试验结果的影响， 流速分别设定为120cm/hr和 80cm/hr。 待ADC抗体吸附饱和继。
40、而开始流穿后， 按5-7mL/管收集流穿液。 待上样完成后， 用 90mM醋酸钠缓冲液(pH 5， 电导6mS/cm)冲洗平衡至基线， 400mM醋酸钠缓冲液(pH 5， 电导 24mS/cm)洗脱， 最后利用0.5M NaOH溶液清洗层析柱。 分段收集的样品分别采用实施例3的 紫外(UV)分光光度法以及实施例4的分子排阻液相色谱(SEC-HPLC)法进行检测。 色谱图、 SEC和DAR值的测定结果参见附图2。 0054 结果显示， 不同流速下收集的目标蛋白C/C0均呈上升趋势， 说明先流穿出来的ADC 样品多聚体含量低， 可以达到去除多聚体的效果。 不同流速下C/C0曲线上升的速率不同， 低。
41、 流速下C/C0到达平台期更缓慢， 有利于多聚体的去除。 不同流速下， DAR值曲线均呈上升趋 势。 在过载模式下， 我们可以通过控制ADC样品的上样量实现DAR值的控制。 过载模式的处理 量大， 层析载量超过300mg/mL介质， 适用于大规模ADC样品的纯化。 而且通过流穿模式收集 样品， 操作相对简单。 0055 实施例7 采用结合-洗脱模式的阳离子交换层析方法纯化ADC样品 0056 将实施例2中制得的ADC样品置换到90mM醋酸钠缓冲液中(pH 5， 电导6mS/cm)。 分 别装填三种不同的层析介质(POROS HS、 POROS XS和Eshmuno CPX)的层析柱， 利用AK。
42、TA Purifier 100层析系统进行结合-洗脱模式的阳离子层析实验。 首先用A液： 90mM醋酸钠缓 冲液(pH 5， 电导6mS/cm)充分平衡层析柱后上样， 上样量为60mg/mL介质， 流速为120cm/hr。 待上样完成后， 用90mM醋酸钠缓冲液(pH 5， 电导6mS/cm)冲洗至基线。 然后用B液： 400mM醋 酸钠缓冲液(pH 5， 电导24mS/cm)按0100B液、 20CV的梯度进行线性洗脱， 分段收集洗脱 液。 最后利用0.5M NaOH溶液清洗层析柱。 分段收集的样品分别采用实施例3的紫外(UV)分 光光度法以及实施例4的分子排阻液相色谱(SEC-HPLC)法。
43、进行检测。 各层析介质的色谱图、 SEC和DAR值的测定结果分别见附图3-7及表1-5。 0057 如表1-5的结果所示， 在结合-洗脱模式的阳离子交换层析中， 合并不同阶段收集 的样品， 可得到DAR值不同且多聚体去除率各异的样品。 尤其对于POROS XS和Eshmuno CPX 这两种新型的高载量阳离子层析介质而言， 通过控制收集范围可将DAR值维持在较窄的目 标范围(3.50.1)内。 如表2和表3所示， 对于通过赖氨酸偶联的ADC样品(Ab-DM1)， 多聚体 的去除率可达到40以上， 回收率可保持在86以上。 如表4和表5所示， 对于通过半胱氨酸 偶联的ADC样品(Ab-MMAE)。
44、， 多聚体的去除率可达到60以上， 回收率也可保持在79以上。 0058 本发明能够有效地去除ADC产品中的多聚体， 提高ADC产品的质量； 也能够有效地 控制ADC产品的DAR值， 使得ADC产品的生产风险和成本降低、 工艺可控性提高。 因此， 本发明 对于ADC产品的研发和生产具有重要的意义。 0059 表1 层析介质POROS HS的结合-洗脱模式纯化结果(赖氨酸偶联ADC样品) 说 明 书 7/8 页 9 CN 104208719 B 9 0060 0061 表2 层析介质POROS XS的结合-洗脱模式纯化结果(赖氨酸偶联ADC样品) 0062 0063 表3 层析介质Eshmuno。
45、 CPX的结合-洗脱模式纯化结果(赖氨酸偶联ADC样品) 0064 0065 表4 层析介质POROS XS的结合-洗脱模式纯化结果(半胱氨酸偶联ADC样品) 0066 0067 表5 层析介质Eshmuno CPX的结合-洗脱模式纯化结果(半胱氨酸偶联ADC样品) 0068 0069 0070 上述的实施例中的描述仅为本发明的优选例， 并不用来限制本发明。 任何针对本 发明做出的变化和改进， 皆应视为不脱离本发明专利的范畴， 这些变化和改进都将落入本 发明要求的保护范围内。 说 明 书 8/8 页 10 CN 104208719 B 10 图1 说 明 书 附 图 1/7 页 11 CN 104208719 B 11 图2 说 明 书 附 图 2/7 页 12 CN 104208719 B 12 图3 说 明 书 附 图 3/7 页 13 CN 104208719 B 13 图4 说 明 书 附 图 4/7 页 14 CN 104208719 B 14 图5 说 明 书 附 图 5/7 页 15 CN 104208719 B 15 图6 说 明 书 附 图 6/7 页 16 CN 104208719 B 16 图7 说 明 书 附 图 7/7 页 17 CN 104208719 B 17 。