一种抗肿瘤的药物组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种药物组合物及其制备方法，特别涉及一种抗肿瘤的药物 组合物及其制备方法。
背景技术
癌症是严重危害人类健康的疾病，世界卫生组织公布的统计资料表明： 每年全世界癌症发病约1000万人，死亡约700万人。目前临床应用的抗癌 药物的毒副作用多较大。因此研究开发安全高效的抗癌药是当务之急，特别 是从博大精深的传统中医药中开发新的抗癌药一直是新药研究的热门课题。
三七是名贵中药，传统中医认为“人参补气第一，三七补血第一”，在 我国名贵药材中是治疗广泛、保健作用持久的“扶正固本”食药兼用品。三 七对机体免疫系统的影响是相当广泛的，它可促进机体粒细胞单核巨噬细胞 系统的增殖和活化。可使T淋巴细胞增殖，较高剂量有促进B淋巴细胞的作 用，在病理免疫病情况下起调节的作用，在抗肿瘤中也有一定作用。三七总 皂甙有显著的镇静作用，并能协同中枢抑制药的抑制作用。冬虫夏草也是传 统名贵药材，最初见于清《本草备要》入肺经止咳，又作为肝肾双补佳品。 经现代科学分析表明，虫草含真菌多糖、虫草素及多种氨基酸、维生素、酶、 钙、磷、锌等数十种微量元素，具有提高肌体免疫功能，促进造血和新陈代 谢功能。冬虫夏草煎剂腹腔注射可明显抑制小鼠自发性活动，延长小鼠戊巴 比妥钠睡眠时间。故皂苷、虫草结合能在提高人体免疫功能、改善睡眠上发 挥更好的保健作用。在本发明之前没有关于本发明药物组合物抗肿瘤作用的 报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种药物组合物及其制备方法，本发明另一目的在 于提供该药物组合物制剂的用途。本发明目的是通过如下技术方案实现：
本发明是通过如下两味原料组成：
天然虫草1-4重量份 人参皂苷1-4重量份。
上述三味原料药的最佳配比如下：
天然虫草2重量份 人参皂苷3重量份。
上述三味原料药的配比如下：
天然虫草3重量份 人参皂苷2重量份。
上述三味原料药的配比如下：
天然虫草3重量份 人参皂苷4重量份。
上述组合物可以制成片剂、软胶囊剂、胶囊剂、缓释剂、颗粒剂、滴丸 剂、口服液体制剂或冻干粉针剂。
本发明原料药人参皂苷的具体制备工艺如下：
取5-15目人参或三七粗粉，用40-100％乙醇回流提取1-4次，每次1-3 小时，收集提取液，过滤，滤液回收乙醇，至无乙醇味后，真空浓缩1.5-2 小时，浓缩液加入等体积蒸馏水，搅拌均匀，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱 吸附；用2-4倍量树脂床体积蒸馏水洗去水溶性杂质，吸附人参皂苷的树脂 柱备用；将上述吸附树脂柱用20-50％乙醇洗脱，20-50％乙醇用量为1-5倍量 树脂床体积，用薄层色谱法跟踪检测，其中的薄层色谱法是：展开剂为 30-100∶10-50∶2-20的氯仿∶甲醇∶水下层；显色剂：5-20％硫酸乙醇溶液；当 薄层色谱上出现原人参二醇组皂苷斑点后，停止用20-50％乙醇洗脱，改用 30-100％乙醇洗脱，并收集洗脱液；洗脱液用0.5-2％活性炭加热回流0.5-2 小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱 盐除杂，并用30-100％乙醇洗脱树脂吸附的原人参二醇组皂苷，回收乙醇， 真空浓缩，真空干燥，粉碎，得原人参二醇组皂苷；取上述原人参二醇组皂 苷粉溶解于30-70％醋酸、20-50％枸橼酸、20-50％草酸、20-50％丙二酸、0.5-2％ 盐酸、0.5-2％硫酸的水或乙醇溶液中，控制反应条件：水解温度为20℃-100 ℃，水解时间为0.5小时-10小时，酸水解反应完成后加入与酸水解液等体 积蒸馏水，用6％氢氧化钠溶液中和至中性，过滤，收集水解产物次生皂苷的 沉淀，用10倍重量蒸馏水，分2-3次洗沉淀，真空干燥，粉碎，得水解产 物粗次生皂苷粉，备用；将水解产物粗次生皂苷粉溶解于5-10倍重量 50-140％乙醇中，溶解，过滤，滤液用1％活性炭加热回流0.5-2小时脱色， 过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并 用30-100％乙醇洗脱树脂吸附的次生皂苷，回收乙醇至洗脱液总体积的 1/4-3/4，冷却，放置结晶，真空抽滤，收集结晶，真空干燥，粉碎；用高 效液相色谱法测定结晶中的人参皂苷Rh2和Rg3的含量；此结晶即为含人参 皂苷Rh2和人参皂苷Rg3的抗肿瘤药物精制物人参皂苷；收率约为原人参二 醇组皂苷投料量的4-5％。
本发明原料药皂苷的具体制备工艺优选制备方法如下：
取10目人参或三七粗粉，用70％乙醇回流提取3次，每次2小时，收集 提取液，过滤，滤液回收乙醇，至无乙醇味后，真空浓缩2小时，浓缩液加 入等体积蒸馏水，搅拌均匀，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱吸附；用3倍量 树脂床体积蒸馏水洗去水溶性杂质，吸附人参皂苷的树脂柱备用；将上述吸 附树脂柱用35％乙醇洗脱，35％乙醇用量为2.5倍量树脂床体积，用薄层色谱 法跟踪检测，其中的薄层色谱法是：展开剂为65∶35∶10的氯仿∶甲醇∶水下 层；显色剂：10％硫酸乙醇溶液；当薄层色谱上出现原人参二醇组皂苷斑点 后，停止用35％乙醇洗脱，改用65％乙醇洗脱，并收集洗脱液；洗脱液用1％ 活性炭加热回流0.5小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交 换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用65％乙醇洗脱树脂吸附的原人参二醇组皂 苷，回收乙醇，真空浓缩，真空干燥，粉碎，得原人参二醇组皂苷；取上述 原人参二醇组皂苷粉溶解于50％醋酸或1％盐酸中，水解时间：盐酸水解1小 时，醋酸水解6小时，水解温度为75℃，酸水解反应完成后加入与酸水解液 等体积蒸馏水，用6％氢氧化钠溶液中和至中性，过滤，收集水解产物次生皂 苷的沉淀，用10倍重量蒸馏水，分2-3次洗沉淀，真空干燥，粉碎，得水 解产物粗次生皂苷粉，备用；将水解产物粗次生皂苷粉溶解于8倍重量95％ 乙醇中，溶解，过滤，滤液用1％活性炭加热回流0.5小时脱色，过滤去除活 性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用95％乙醇 洗脱树脂吸附的次生皂苷，回收乙醇至洗脱液总体积的1/2，冷却，放置结 晶，真空抽滤，收集结晶，真空干燥，粉碎；用高效液相色谱法测定结晶中 的人参皂苷Rh2和Rg3的含量；此结晶即为含人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3的抗肿瘤药物精制物人参皂苷；收率约为原人参二醇组皂苷投料量的5％。
本发明皂苷含人参皂苷Rh220％-25％和人参皂苷Rg340％-50％。
下述实验和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例：三七虫草混合粉抑制小鼠黑色素瘤效应实验
选用小鼠黑色素瘤(B16)动物模型，观察三七虫草混合粉对B16小鼠一 般状况、肿瘤抑制率影响。
1材料
1.1动物与瘤块
雄性C57纯种小鼠，体重20±2g，由北京维通利华实验动物技术有限公 司购入(合格证号：京动许字004049)，并北京中医药大学第一临床医学院 重点实验室的清洁级环境下饲养；小鼠黑色素(B16)瘤块由中国医学科学院 肿瘤研究所实验中心提供。
1.2药品与试剂
三七中提取分离的Rh2、Rg3以及天然虫草提取成分由云南天秀植物科技 开发有限公司提供。依据实验需要，研究者将以上三种成分按照不同配伍比 例混合。配伍混合比例如下：皂苷Rh2、Rg3混合粉按照1∶1比例；三七虫 草混合粉1组为：虫草∶皂苷为2∶3比例；三七虫草混合粉2组为：虫草∶ 皂苷为3∶2比例；三七虫草混合粉3组为：虫草∶皂苷为3∶4比例。三健 牌环磷酰胺由上海华联制药有限公司生产(批号050405)，购入中国国药集 团总公司。
2方法
2.1建立模型
按照相关文献建立小鼠黑色素瘤(B16)动物模型[5]。选择肿瘤生长旺盛 的B16荷瘤小鼠，无菌条件下取出瘤块，加PBS用玻璃匀浆器按1∶4稀释制 成单细胞悬液，调整细胞数约为5×106/L，各取0.2ml接种于C57小鼠右 前肢腋窝皮下，接种时间在1小时内完成。
2.2分组给药
将接种B16细胞的C57小鼠随机分为10组，8只/组。即：①正常对照组； ②模型对照组；③环磷酰胺组；④Rh2组；⑤Rg3组；⑥天然虫草组；⑦Rh2与Rg3混合粉组；⑧三七虫草混合粉1组；⑨三七虫草混合粉2组；⑩三七 虫草混合粉3组。该实验除环磷酰胺组以50mg/(kg·d)腹腔注射用药外(隔 日1次，共3次)，其余各组均采用灌胃途径给药、给水。为有利实验观察 与评价效果，除环磷酰胺外，药物剂量均为10mg/(kg·d)。实验用药以无 水乙醇溶解后，再以生理盐水稀释配制成所需浓度，于接种后次日灌胃给药， 每日1次，共10天，第15天处死小鼠，制备标本备检。
2.3观察指标
实验过程中动态观察小鼠一般生长状况、体重与动物死亡情况。第15 天称体重并脱颈处死小鼠、剥离肿瘤称重，依据公式计算抑瘤率。抑瘤率(％) ＝(1-给药组平均瘤重/模型对照组平均瘤重)×100％；脏器指数(mg·g-1) ＝脏器质量/体质量×1000。
2.4统计方法
所有数据采用SPSS14.0统计软件进行处理，计数资料采用 表示；
多组资料均数比较采用单因素方差分析，当P＜0.05时，表示有统计学意义。
3结果
3.1一般状况观察
实验前各组小鼠一般状况良好，实验结束后小鼠全部存活。实验过程中 动态观察各组小鼠一般状况发现，模型组、CTX组小鼠一般状况较差，主要 表现为进行性反应迟钝、行动迟缓、进食量减少、形体消瘦、毛色少光泽， 并有脱毛现象。尤其以CTX组更为明显。余各实验组小鼠毛色光泽、食欲增 加、反应及运动状态良好。其中，以三七虫草混合粉3∶1配伍比例的小鼠 状态最佳。3∶4比例次之。从动态观察可以看出，三七皂苷、冬虫夏草及皂 苷与冬虫夏草混合粉能明显改善模型小鼠整体机能状态，提高生活质量，具 有明显的扶正作用。
3.2体重变化
给药前分别称各组小鼠体重，各组间比较，无统计学意义。实验结束后 显示，模型组、CTX组小鼠体重明显下降，其余各组小鼠体重均有不同程度 增加，与模型组、CTX组比较，具有统计学意义，实验结果见表1。
表1各组小鼠平均体重比较( )
组别 只数 Δ体重(g) P1 P2 P3 P4 正常对照组 8 2.56±1.32 - - - - 模型对照组 8 1.17±1.63 ＜0.05 - - - CTX对照组 8 -1.27±1.45 ＜0.01 ＜0.01 - - Rh2剂量组 8 3.34±0.98 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01 ＞0.05 Rg3剂量组 8 3.45±1.14 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01 ＞0.05 天然虫草组 8 3.89±1.07 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01 ＞0.05 皂苷混合物组 8 3.68±1.28 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01 ＞0.05 三七虫草组1 8 3.64±1.45* ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01 ＞0.05 三七虫草组2 8 3.99±1.49* ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01 ＞0.05 三七虫草组3 8 3.61±1.28* ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01 ＞0.05
注1：采用Anova检验，P1为实验各组小鼠体重与正常小鼠体重比较的 P值；P2为实验各组小鼠体重与模型组小鼠体重比较的P值；P3为实验各组 小鼠体重与CTX组小鼠体重比较的P值；P4为三七虫草实验各组小鼠体重分 别与Rh2剂量组、Rg3剂量组、天然虫草组、皂苷混合物组小鼠体重比较的P 值。
注2：Δ平均体重变化量＝(治疗后体重-治疗前体重)
通过表1分析有如下结果：①与正常对照组比较，CTX组、模型组小鼠 体重明显下降。说明肿瘤可导致体能消耗、体重下降，而CTX明显促进了这 一病理进程。②给药各组均有明显减轻/阻止小鼠体重下降效应，其中，以 天然虫草与三七虫草混合粉最佳。结合实验过程中小鼠一般状态观察可以看 出，三七主要活性成分Rh2与Rg3、冬虫夏草能调节小鼠机能状态，改善生活 质量，尤以冬虫夏草效果最为明显。冬虫夏草具有滋补功效，调节整体机能 可能是其抗肿瘤治疗的关键机制之一。
3.3肿瘤抑制率
实验结束后，分别取出各组小鼠肿瘤称重，按照公式计算肿瘤抑制率。 结果见表2。
表2各组肿瘤抑制率比较( )
组别 只数 瘤重(g) 抑瘤率(％) P1 P2 P3 P4 P5 模型对照组 8 3.32±1.24 - - - - - - CTX对照组 8 0.31±0.37 90.6 ＜0.01 - - - - Rh2剂量组 8 2.32±0.76 30.1 ＜0.05 - - - - Rg3剂量组 8 2.62±1.11 21.1 ＞0.05 - - - - 天然虫草组 8 2.06±1.15 38.1 ＜0.05 - - - - 皂苷混合物组 8 2.03±1.05 39.2 ＜0.05 - - - - 三七虫草组1 8 2.07±0.87 42.0 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.05 三七虫草组2 8 1.70±0.66 48.0 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.05 三七虫草组3 8 2.11±0.90 36.4 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05
注：采用Anova检验，P1为实验各组肿瘤抑制率与模型组比较的P值； P2为Rh2组肿瘤抑制率与三七虫草混合粉各组比较的P值；P3为Rg3组与 三七虫草混合粉各组比较的P值；P4为天然虫草组与三七虫草混合粉各组比 较的P值；P5为皂苷混合粉与三七虫草混合粉各组比较的P值
从表2分析可以看出：①除Rg3组外，实验用药各组肿瘤抑制率均在30％ 以上，单味成分以天然虫草抑瘤率最佳，Rh2次之。②Rh2、Rg3组合后的抑瘤 率高于单味成分，具有一定的协同加和作用。③按不同配伍比例的三七虫草 混合粉抑瘤率高于单味成分，具有明显的协同加和效应，其中，以虫草、皂 苷比例为3∶2疗效最佳，2∶3比例次之，3∶4比例最低，与天然虫草、皂 苷混合物抑瘤率相似。以上说明冬虫夏草不同的配伍比例对肿瘤抑制率有一 些影响。
4、结论
该实验选用B16动物模型，观察三七与天然虫草混合粉对模型小鼠一般 状况、体重以及肿瘤抑制率影响。研究结果显示：①与正常对照组比较，CTX 组、模型组小鼠体重明显下降，尤其以CTX组下降幅度最大。说明肿瘤可导 致体能消耗、体重下降，而CTX明显促进了这一病理进程。②给药各组均有 明显减轻/阻止小鼠体重下降效应，其中，以天然虫草与三七虫草混合粉最 佳。结合实验过程中小鼠一般状态观察可以看出，三七主要活性成分、冬虫 夏草能调节小鼠机能状态，改善生活质量，尤以冬虫夏草效果最为明显。冬 虫夏草具有滋补功效，调节整体机能可能是其抗肿瘤治疗的关键机制之一。 ③除Rg3组外，实验用药各组肿瘤抑制率均在30％以上，单味成分以天然虫 草抑瘤率最佳，Rh2次之。④Rh2、Rg3组合后的抑瘤率高于单味成分，具有一 定的协同加和作用。⑤按不同配伍比例的三七虫草混合粉抑瘤率高于单味成 分，具有明显的协同加和效应，其中，以虫草、皂苷比例为3∶2疗效最佳， 2∶3比例次之，3∶4比例最低，与天然虫草、皂苷混合物抑瘤率相似。以 上说明冬虫夏草不同的配伍比例对肿瘤抑制率有一些影响。
下述实施例均能实现上述实验例的效果
具体实施方式
实施例1：口服凝胶的制备
天然虫草2kg人参皂苷3kg，加常规辅料制成口服凝胶。
上述的人参皂苷的制备方法如下：
取10目人参或三七粗粉，用70％乙醇回流提取3次，每次2小时，收集 提取液，过滤，滤液回收乙醇，至无乙醇味后，真空浓缩2小时，浓缩液加 入等体积蒸馏水，搅拌均匀，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱吸附；用3倍量 树脂床体积蒸馏水洗去水溶性杂质，吸附人参皂苷的树脂柱备用；将上述吸 附树脂柱用35％乙醇洗脱，35％乙醇用量为2.5倍量树脂床体积，用薄层色谱 法跟踪检测，其中的薄层色谱法是：展开剂为65∶35∶10的氯仿∶甲醇∶水下 层；显色剂：10％硫酸乙醇溶液；当薄层色谱上出现原人参二醇组皂苷斑点 后，停止用35％乙醇洗脱，改用65％乙醇洗脱，并收集洗脱液；洗脱液用1％ 活性炭加热回流0.5小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交 换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用65％乙醇洗脱树脂吸附的原人参二醇组皂 苷，回收乙醇，真空浓缩，真空干燥，粉碎，得原人参二醇组皂苷；取上述 原人参二醇组皂苷粉溶解于50％醋酸或1％盐酸中，水解时间：盐酸水解1小 时，醋酸水解6小时，水解温度为75℃，酸水解反应完成后加入与酸水解液 等体积蒸馏水，用6％氢氧化钠溶液中和至中性，过滤，收集水解产物次生皂 苷的沉淀，用10倍重量蒸馏水，分2-3次洗沉淀，真空干燥，粉碎，得水 解产物粗次生皂苷粉，备用；将水解产物粗次生皂苷粉溶解于8倍重量95％ 乙醇中，溶解，过滤，滤液用1％活性炭加热回流0.5小时脱色，过滤去除活 性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用95％乙醇 洗脱树脂吸附的次生皂苷，回收乙醇至洗脱液总体积的1/2，冷却，放置结 晶，真空抽滤，收集结晶，真空干燥，粉碎；用高效液相色谱法测定结晶中 的人参皂苷Rh2和Rg3的含量；此结晶即为含人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3的抗肿瘤药物精制物人参皂苷；收率约为原人参二醇组皂苷投料量的5％。
实施例2：胶囊剂的制备
天然虫草3kg人参皂苷2kg，加常规辅料制成胶囊剂。
上述的人参皂苷的制备方法如下：
取15目人参或三七粗粉，用60％乙醇回流提取4次，每次2小时，收集 提取液，过滤，滤液回收乙醇，至无乙醇味后，真空浓缩2小时，浓缩液加 入等体积蒸馏水，搅拌均匀，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱吸附；用4倍量 树脂床体积蒸馏水洗去水溶性杂质，吸附人参皂苷的树脂柱备用；将上述吸 附树脂柱用30％乙醇洗脱，60％乙醇用量为4倍量树脂床体积，用薄层色谱法 跟踪检测，其中的薄层色谱法是：展开剂为65∶45∶10的氯仿∶甲醇∶水下层； 显色剂：10％硫酸乙醇溶液；当薄层色谱上出现原人参二醇组皂苷斑点后， 停止用30％乙醇洗脱，改用60％乙醇洗脱，并收集洗脱液；洗脱液用2％活性 炭加热回流2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱， 进一步脱色脱盐除杂，并用80％乙醇洗脱树脂吸附的原人参二醇组皂苷，回 收乙醇，真空浓缩，真空干燥，粉碎，得原人参二醇组皂苷；取上述原人参 二醇组皂苷粉溶解于50％醋酸溶液中，控制反应条件：水解温度为65℃，水 解时间为8小时，酸水解反应完成后加入与酸水解液等体积蒸馏水，用6％ 氢氧化钠溶液中和至中性，过滤，收集水解产物次生皂苷的沉淀，用10倍 重量蒸馏水，分2次洗沉淀，真空干燥，粉碎，得水解产物粗次生皂苷粉， 备用；将水解产物粗次生皂苷粉溶解于10倍重量85％乙醇中，溶解，过滤， 滤液用1％活性炭加热回流2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴 离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用85％乙醇洗脱树脂吸附的次生皂苷， 回收乙醇至洗脱液总体积的2/3，冷却，放置结晶，真空抽滤，收集结晶， 真空干燥，粉碎；用高效液相色谱法测定结晶中的人参皂苷Rh2和Rg3的含 量；此结晶即为含人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3的抗肿瘤药物精制物人参皂 苷；收率约为原人参二醇组皂苷投料量的4％。
实施例3：滴丸的制备
天然虫草3kg人参皂苷4kg，加常规辅料制成滴丸。