试剂 本发明涉及用于检测体液样品中血清碳酸氢盐浓度的酶方法中的试剂。本发明尤其涉及用于其中反应样品中氧化辅酶的量直接相当于样品中存在的碳酸氢盐浓度的方法中的试剂。本发明也涉及测定碳酸氢盐浓度的改进方法。
体液样品中待分析物(特别是碳酸氢盐)的定量可包括将空白样品与发生待分析物酶转化的样品进行对照。
欲完成碳酸氢盐的酶转化，让底物特异酶作用于已知用于血清碳酸盐定量的酶底物。相对空白而言，反应混合物中的变化可通过用不同方法测定混合物吸收度的变化来计算出。吸收度的变化与样品中存在的碳酸氢盐的数量直接相关。
虽然包括比色法测定、分压分析和电极测试在内的传统方法已证明令人满意，但酶分析法在测定血清碳酸氢盐水平方面比其它这些方法更精确、可靠和简单。
样品中总CO2地常用定量方法要求将病人的样品与底物磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)混合，在此时读取空白读数。然后向混合物中加入底物特异酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)，引起PEP转化成草酰乙酸盐(OAA)和磷酸盐。
尽管随后可有不同方法使草酰乙酸盐与样品中总CO2相关联，但最常用的方法要求草酰乙酸盐与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和苹果酸脱氢酶(MDH)偶合，此反应结果是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化和苹果酸盐的生成。
产生的NAD+浓度与最初样品中存在的总CO2浓度相关。
从历史上来看，碳酸氢盐酶试剂重构稳定性差。不稳定的原因归于溶液中内源性成份的破坏，加之试剂摄入空气中的CO2。通常来自玉米叶的PEPC(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)特别易受氧化降解作用的影响，通过内源性污染物如NADH氧化酶和蛋白酶缓慢地降低PEPC的效力。尽管将NADH贮存在碱性的PH环境中能明显改善其重构稳定性，但NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)在溶液中特别是在酸性介质中仍将迅速降解。
大多数测定血清碳酸氢盐的试剂是在PH约为8.0的碱性条件下配制。在此PH值时，空气中的CO2就成问题了。外源性CO2的吸收引发一连串酶反应，导致后来的NADH损失和吸收度及试剂稳定性的必然降低。用劣质的实验用水进行试剂配制具有与上述相同的危害效应。
因此，即使是很大程度地减少试剂与空气中CO2的接触，试剂也只有非常短的有效寿命。
克服以这一困难的一种方法是在用此试剂前生成还原型辅酶。
在F.Hoffmann La Roche AG的澳大利亚专利申请Au-A-61906/90中述及一种这样的方法。所披露的方法中，还原型的辅酶就地生成于辅酶被待分析物、底物和特异酶再氧化的同时或之前。此步是通过包括酶和酶底物的反应混合物来实现的，使空气氧化的辅酶能够还原。F.Hoffmann La Roche AG披露且优选的这一特异反应是：
此反应能使烟酰胺腺苷二核苷酸还原。
这种生成NADH的方法的问题是不可能有稳定的单一瓶装的试剂形式。
F.Hoffmann La Roche AG通过将试剂分成2瓶在一定程度上克服这一问题。第一类试剂含底物特异酶，就CO2定量而言为PEPC、MDH和G-6-P-DH。第二类试剂为酶底物和辅酶，就CO2测定而言为PEP、G-6-P和NAD+(氧化状态)。因此检测反应按如下进行：
其中(A)和(B)代表可选择的相等同的途径。
然而，这种试剂系统仍有困难。除两种试剂瓶装造价高、分列目录和浪费外，要求6-磷酸葡萄糖水平非常精确，而且此试剂系统限用于特定的化学分析仪。只要两种试剂一结合，通过6-磷酸葡萄糖的耗竭，就由NAD+生成NADH。如果两种试剂结合而没有立即使用，因为6-磷酸葡萄糖这样被耗竭，结合的试剂的稳定性可能受到很大影响。如果6-磷酸葡萄糖量不精确或过量，则试剂的保温时间选择很关键。结果可以是假象性低吸收度变化和总体不精确的结果。
Modrovich的美国专利4,394,449中描述的一种早期方案用底物/酶对产生还原型辅酶，如同Roche的方案，然而，此例中6-磷酸葡萄糖是按下式由葡萄糖生成的。
然后在有酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶存在下，NAD+与生成的6-磷酸葡萄糖反应形成NADH。Modrovich配方中也同时包括NADH和NAD+以便当NADH被氧化或降解时，试剂中的NAD+将有助于产生NADH。这也是一种两瓶装试剂。
第三种方法是Crowther等在美国专利5,116,728中描述的方法。此发明中利用酶/底物对的概念再生成NADH。此发明与Roche和Modrovich的不同，再生成反应由于用很低水平的酶而降低至约最大反应速率的2％。另外包括一种稳定剂，实际上是加入NAD+，其加入量是理论上预先确定的、将建立NADH和NAD+之间平衡的量，以控制生成速率。该体系中既有NADH的生成也有再生。系统更依赖哪个还不清楚。此体系的不足是溶液中很低水平的酶很不稳定，将影响试剂的长期稳定生。从ALT试剂声称的稳定性可清楚向出这一点，即在冷冻环境中存放22天。另外它也要求试剂分为两部分。
与上文所述每个发明采纳的NADH产生机制，即
相关的总的问题是：此反应不可能是用单一瓶的一步反应，因为只要一加入病人血清，就同时发生两种反应：
(a)由于NADH转化为NAD+而致的吸收度的降低，
(b)由NAD+生成NADH导致吸收度的升高。
这两个反应以相似的速度进行，结果是假象性低吸收度变化和总体不精确的结果。
因而，本发明的一个目的就是提供一种可用于血清碳酸氢盐水平检测的试剂系统，其基本上改进了那些用于依赖于辅酶氧化而检测血清碳酸氢盐的酶分析法中的现有技术试剂系统所存在的问题，特别是那些与试剂的内源性和外源性污染有关的问题。本发明的更进一步目的是提供一种检测病人样品中碳酸氢盐浓度的改进方法，这种方法克服了那些包括辅酶的过早氧化和为最大限度减低试剂污染需要多种瓶系统在内的与现有技术有关的问题。
为此，提供了一种用于通过测定辅酶的氧化程度来进行病人血清碳酸氢盐浓度酶检测的试剂，其特征在于通过选择包括酶/底物对的辅酶还原系统来抗氧化、使所述试剂的整个贮存过程中能持续再生所述辅酶，从而稳定所述试剂。
优选的是辅酶还原系统包括一种酶和一种底物，所述酶对所述底物有不完全特异性，因而导致交叉反应速率降低。
该试剂优选是单一瓶装剂型。
整个此说明书中用的术语“不完全特异性”是就酶/底物对而言的，其中所选的底物不是所述酶的天然底物，因此对相关酶的交叉特异性小于100％。
本发明是基于通过彼此有不完全特异性的酶与底物结合，辅酶还原速度明显减慢这一发现的。通过减慢还原反应，试剂的必要组分可存放于一个贮存瓶内，内容物通过低水平持续的辅酶再生来抗污染维持稳定。通过减慢此过程，NADH的再生可在不影响血清碳酸氢盐测定的情况下进行。在试剂没被应用时，这种再生就可进行，再生的速率可通过调节选择的酶/底物对的种类和水平而进行精细的调节。
在本发明的一个可选择的实施方案中，提供了一种用于通过测定辅酶的氧化程度来测定病人血清碳酸氢盐浓度的酶方法中的试剂，其特征在于通过包含酶/底物对的辅酶还原系统来抗氧化稳定所述试剂，选择酶/底物对使所述辅酶在20-25℃时以0.10-0.90mAbs/min的速率再生。
根据本发明这一方面，试剂中再生速率优选为20-25℃时0.20-0.80mAbs/min。
本发明的一个优选实施方案中，辅酶还原系统的底物和酶间等摩尔基础上的特异性程度优选小于100％，更优选小于50％，最优选小于10％。使用等摩尔基础的交叉反应性小于5％的酶/底物对为最佳。
优选用于本发明试剂中的辅酶是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，但烟酰胺次黄嘌呤二苷酸磷酸或硫代-NADH这些辅酶类似物也可是合适的。
在检测血清样品中的CO2含量时，辅酶还原系统中优选应用的酶是6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-P-DH)和葡萄糖脱氢酶。
诸如甲酸脱氢酶、甘油脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、L-丙氨酸脱氢酶、3α-羟基-类固醇脱氢酶、L-乳酸脱氢酶(产自乳杆菌菌种)或3-磷酸甘油脱氢酶也是合适的。优选用于总CO2测定的试剂中的酶是6-磷酸葡萄糖脱氢酶。这可从任何合适的来源得到，如肠膜明串珠菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、Zymomonas Mobilus或酵母。
这类酶优选源于微生物。已经发现，试剂中加入来自微生物的酶能消除象NADH氧化酶和蛋白酶这类以前严重影响试剂稳定性的内源性污染物的出现。微生物酶还有热稳定性更高的附加优点，因此可提高其在溶液中的长期稳定性。
6-磷酸葡萄糖脱氢酶的更优选来源是肠膜明串珠菌。如果使用来自嗜热脂肪芽孢杆菌或Zymomonas Mobilus的6-磷酸葡萄糖脱氢酶，反应速率降低。与此相似，如果用酵母作为6-磷酸葡萄糖脱氢酶的来源，必须用辅酶NADPH作为NADH的替代物，因为酵母6-磷酸葡萄糖脱氢酶仅作用于NADP+。
要注意的是，辅酶还原系统中底物和酶的选择必须是二者彼此有不完全特异性，用于本发明试剂中的合适的底物包括：5-磷酸核糖、1-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖酸、6-磷酸-2-脱氧葡萄糖、6-磷酸-2-脱氧-2-氟葡萄糖、6-磷酸-2-脱氧-2-氯葡萄糖、6-磷酸-2-脱氧-2，2-二氟葡萄糖、6-磷酸-2-O-甲基葡萄糖、6-磷酸甘露糖、6-磷酸葡糖胺、6-磷酸-3-脱氧葡萄糖、6-磷酸-3-脱氧-3-氟葡萄糖、6-磷酸-3-O-甲基葡萄糖、6-磷酸阿洛糖、6-磷酸ahrose、6-磷酸-4-脱氧-4-氟葡萄糖、6-磷酸半乳糖、6-磷酸-5-硫-葡萄糖、膦酸酯类似物、6-stallate-葡萄糖、β-D-葡萄糖、D-半乳糖、2-脱氧葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、1-山梨糖、D-甘露糖、D-果糖、D-乳糖、D-山梨醇、D-甘露醇、蔗糖、肌醇、麦芽糖。
用NAD+作为试剂中优选的辅酶，优选的酶/底物组合是6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-P-DH)/D-葡萄糖。优选的D-葡萄糖的替代底物是那些，相对6-磷酸葡萄糖(G-6-P)和G-6-P-DH间的特异性，G-6-P-DH酶与所选择的底物间反应的速率小于50％，更优选小于10％，最优选小于5％。
D-葡萄糖/G-6-P-DH的一个优选的替代物是根据下述D-葡萄糖为100％反应底物的反应应用葡萄糖脱氢酶(GLD)。＋H+
如果将葡萄糖脱氢酶作为酶，用于NAD辅酶还原的优选的底物和它们与D-葡萄糖相比交叉反应的相对程度如下：
底物 相对活性
木糖 8.9％
L-山梨糖 0.3％
D-甘露糖 2.4％
D-果糖 0.8％
D-半乳糖 0.1％
D-乳糖 1.2％
D-山梨醇 0.1％
肌醇 0.2％
麦芽糖 3.9％
栏中的数字代表相对葡萄糖脱氢酶1β-D-葡萄糖与1β-D-葡萄糖的反应速率的反应速率。
或者，用甘油脱氢酶(GLY.DH)作为酶，在反应
中合适的底物和其相对于甘油(100％)的活性为：
底物 相对活性
α-氯乙醇甘油 48.5％
乙二醇 7.8％
2，3-丁二醇 52.6％
亮氨酸脱氢酶(L.D)作为酶时，根据下述反应 合适的底物和它们相对于L-亮氨酸(100％)的活性为：
底物 相对活性
L-缬氨酸 74％
L-异亮氨酸 58％
L-正缬氨酸 41％
L-正亮氨酸 10％
L-蛋氨酸 0.6％
L-半胱氨酸 0.3％
如果L-丙氨酸脱氢酶(A.D)类似亮氨酸脱氢酶那样作为酶用于反应系统中，合适的底物和其相对于L-丙氨酸(100％)的活性是：
底物 相对活性
L-丝氨酸 5％
3α-羟基类固醇脱氢酶(H.DH)与可用作酶与下列底物结合，这些底物相对于胆酸的活性也被列出：
底物 相对活性
石胆酸 96％
本胆酸 60％
来自乳杆菌菌种的L-乳酸脱氢酶(LDH)在下述反应中作为酶：
合适的底物和它们相对于L-乳酸的活性为：
底物 相对活性
α-氧代戊二酸 0.09％
草酰乙酸 36％
例如来自酵母的NADP为辅酶，优选的底物/酶组合为：
G-6-P-DH/6-磷酸半乳糖 25％
G-6-P-DH/6-磷酸-2-脱氧葡萄糖 18％
G-6-P-DH/6-磷酸葡糖胺 2％
右边的数字代表相对G-6-P-DH/G-6-P对的相对反应性。
还可用NADP作为辅酶结合酶/底物对：3-磷酸甘油脱氢酶和磷酸二羟丙酮。
如本说明书前言中所述及的，用于测定血清碳酸氢盐水平的根据本发明试剂的其它需求为磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)，还原型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和苹果酸脱氢酶(MDH)。
为使试剂达到最佳性能状态，必须选择PEP的水平。这可根据试剂选用的其它成分而变，然而，已经发现在本发明中1.5mmol/l到至少15mmol/L的浓度范围是合适的。低于1.5mmol/L出现底物耗竭从而影响试剂的稳定性。用PEP的不同盐并不危及试剂的稳定性。应注意的是PEP水平越高，试剂的PH值越低。因此缓冲水平需调至最适PH水平。
试剂中辅酶的水平将根据下列因素变动：
·测定中的线性要求
·选择的波长
·样品与试剂的体积比率
·所选分析仪的光度系统
总的来说，增大样品体积增进敏感性但降低所得读数的线性，而降低样品体积在损害灵敏度的情况下提高线性。
优选的测量波长是320-400nm，然而应调节所用辅酶的水平以便吸收度不超过2.0A。根据本发明，吸收度的优选波长是380nm。
最好选择PEPC的水平以便反应终点能在要求的时间内完成。例如，37℃下50mmol样品，如果要求的完成时间为5分钟，可选择380U/L的水平。PEPC优选得自微生物来源，以便降低试剂内源性污染的危险。
MDH也优选得自微生物来源以便限制内源性污染的危害。合适的水平是150-1500U/L，更优选200-400U/L。
本发明的试剂除包括辅酶还原系统、其它必需底物和测定待分析物浓度必需的酶外，还可包括防腐剂、螯合剂、表面活性剂、蛋白酶抑制剂、缓冲剂、辅助因子、LDH抑制剂、抗菌剂和具有增强稳定性功能但实质上不影响本发明特征的其它成分。
选择缓冲液的基本原则是在选择的PH内结合二价阳离子最少且缓冲能力好。根据经验作法，若一种缓冲液的pKa值是所选的PH±1.0PH单位则认为它是有效的。20℃根据时本发明试剂优选的PH是7-9，更优选8.0。在此优选PH时，在溶液中最佳酶活性与酶和辅酶的稳定性间达成平衡。较低的PH可导致辅酶的降解。
合适的缓冲液有HEPES，4-吗啉丙磺酸(MOPS)或2-〔三(羟甲基)甲氨基〕-1-乙烷磺酸(TES)或其它好的缓冲液，TRICINE、BICINE、TEA和TAPS。根据本发明，优选的缓冲液是总离子强度优选为30-100mmol/L，更优选为约58mmol/L的TRIS和/或HEPES。待检测的样品用合适的稀释剂如去离子水或盐水进行稀释。
在本说明书别处所述的PEPC反应中要求镁离子作为辅助因子。4-20mmol/L的浓度是合适的。镁离子的合适来源包括硫酸镁(无水的)、氧化镁和醋酸镁以及其它合适的镁盐。
防腐剂如叠氮化钠(NaN3)、羟苯甲酸、庆大霉素、麝香草酚和来自Boehringer Mannheim的无汞防腐剂是合适的。防腐剂的适当用量是其在2-8℃贮存至少6-8个月仍保持防腐能力而不抑制试剂中的酶。要达这一标准，合适的范围为0.1-1.0g/L。
诸如辛基苯氧基聚乙氧基乙醇或聚氧乙烯脂肪醇醚的非离子表面活性剂是合适的。PMSF或抑蛋白酶肽(Aprotinin)是已知的蛋白酶抑制剂，草氨酸钠，草酸或棉子酚将抑制由乳酸脱氢酶造成的干扰。对丙酮酸盐水平高的病人来说，需要最后这种成份，因丙酮酸盐可干扰碳酸氢盐酶反应。例如，草氨酸钠合适的水平为1.0g/L。其它酶稳定剂包括牛血清白蛋白、牛γ球蛋白、N-乙酰半胱氨酸和甘油。
还可用许多螯合剂，如EDTA、EGTA、N-(2-羟乙基)-乙二胺三乙酸(HEDTA)等等。若需要的话，也可以加入合适的消泡剂。
本发明的一个优选实施方案中，试剂基本含有：
G-6-P-DH 辅酶还原
D-葡萄糖 系统
PEP 底物
PEPC 底物特异性
MDH 酶
NADH 辅酶
另外，优选还包括TRIS缓冲液、HEPES游离酸、草氨酸钠、叠氮化钠、牛血清白蛋白、硫酸镁(无水的)。
根据本发明配制的一种试剂如下： 原料 分子量 浓度 量/升TRIS缓冲剂 21.14 40mM 3.5-5.5gHEPES游离酸 238.3 18mM 3.5-5.3gPEP-MCHA盐 267.1 6.0mM 1.0-2.2g草氨酸钠 111.03 9mM 0.5-1.5g叠氮化钠 65.01 7.7mM 0.25-0.75g牛血清白蛋白 0.1％ 0.5-1.5gNADH.Na23H2O 763.5 1.6mM 0.6-1.80g硫酸镁(无水) 120.4 8mM 0.5-1.3gD-葡萄糖 180.16 0.25mM 40.0-50.0gG-6-PDH(肠膜明串珠菌) 3000-4000UPEPC(微生物) 380-440U MDH(微生物) 220-290U
本发明的另一方面，提供了通过测定辅酶氧化程度检测体液样品中碳酸氢盐浓度的酶检测方法的改进，这种改进包括通过选择一种含酶/底物对的辅酶还原系统，使在整个试剂贮存过程中能持续再生辅酶来对抗辅酶的氧化，从而稳定所述试剂。
本发明在这方面的一个优选的方法中，酶/底物对的酶对所说的底物具有不完全特异性，因而降低酶和底物间的交叉反应速率。
本发明这方面的一个优选的实施方案中，辅酶还原系统包含彼此间特异性如下的一种酶和底物：相对于该酶与其天然底物的特异性，小于100％，优选小于50％，最优选小于10％。最合适的是酶/底物对相互间的特异性相对于该酶与其天然底物的特异性小于5％，最好大约为2％。
辅酶、底物和酶可根据待分析物从上文提到的与本发明试剂相关的那些物质中选出。
本发明中此方面的一个实施方案中，用于测定总CO2浓度的辅酶还原系统的优选成分为NADH、G-6-P-DH和D-葡萄糖以发生下述稳定化反应：
由于G-6-P-DH对D-葡萄糖的特异性低，该稳定化反应慢因而不与主要反应发生竞争：
当加入体液样品时发生这些反应。
实施例
一种按本发明配制的具体CO2试剂的稳定性测试如下：
配方 TRIS缓冲剂4.86g/L HEPES游离酸4.31g/L PEP-MCHA盐1.60g/L 草氨酸钠1.00g/L 叠氮化钠0.50g/L 牛血清白蛋白1.00g/L NADH.Na23H2O1.20g/L 硫酸镁(无水)0.96g/L D-葡萄糖45.04g/L G-6-PDH(肠膜明串珠菌)3500 U/L PEPC(微生物)410 U/L MDH(微生物)250 U/L
D-葡萄糖和G-6-P-DH的最佳水平是通过测试在D-葡萄糖和G-6-PDH浓度改变时NADH的再生速率来决定的。由NAD+到NADH的再生速率与酶G-6-PDH的量及在较小程度上与D-葡萄糖水平成比例。将2ml(每份)含250U/LMDH、400U/LPEPC、6mmol/L PEP和50mmol/L D-葡萄糖的碳酸氢盐PH8.0的配制液加入石英杯中，并加入20μL50mmol/L碳酸氢盐样品。石英杯用封口膜密封防止CO2进一步污染。NADH再生的时间过程用Shimadzu分光光度计在25℃、380nm波长下监测48小时。由这些结果确定优选使用250mmol/L的D-葡萄糖，以使用较少的G-6-PDH达到相似的再生速率。G-6-PDH的最适范围确定为2.5-5.0KU/L，因为这不会影响主要反应达稳定的终点。选择G-6-PDH的水平为3.5KU/L，因为此浓度下试剂加盖贮存在4℃时能供合适的NADH再生速率达6个多月。认为合适的再生速率为20-25℃时0.10-0.90mAbs/min。
贮存条件：
加盖且冷藏(2-8℃)
分光检测的参数(Shimadzu PC2101)
·反应温度 37℃
·试剂与样品体积比 100∶1
·波长 380nm
·杯道长 1cm
这些分光检测参数用于检测下述指标：
·380nm处试剂的初始吸收度
·380nm处无试剂空白速率
·反应Δ吸收度)
·37℃时完成时间)用50mmol/L的标准品去检测
·20℃时的再生速率(用mAbs/min表示)
得到下列结果在2-8℃储存时间(周) 6 9 12 16 21 24 28 新鲜试剂原始吸收度 1.81 1.83 1.76 1.69 1.65 1.61 1.56 1.68空白速率(ΔAbs/10min) 0.02 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01完成时间(min) 4′ 4′ 5′ 5′ 5′ 5′ 5′ 4′△吸收度 0.67 0.7 0.69 0.68 - 0.68 0.7 0.68再生速率 0.41 0.38 0.35 0.31 0.28 0.25 0.2 0.47
相关性研究
用新鲜试剂、2-8℃贮存达6个月的试剂和新鲜的常规试剂(不含再生系统)检测病人血清中碳酸氢盐水平。结果(mmol/L)如下：常规新鲜试剂再生技术(6个月)再生技术(新鲜) 0 0 0 15 17 15 20 22 20 21 22 21 22 23 22 23 25 23 23 24 22 23 24 23 24 26 24 24 24 23 28 29 27 28 29 28 28 29 28 29 32 30 29 29 28 30 31 30 30 32 30 30 31 30 31 32 30 33 34 33 33 33 33 33 33 33 35 36 35 35 36 36 36 37 36 37 38 37 39 40 39 40 41 40 44 44 44 44 45 44 29 30 29
从上述列出的结果看，试剂加盖贮存在2-8℃情况下，再生性CO2试剂显示出至少6-7个月的稳定性。试剂必须有1.0A的初始吸收度才起作用。7个月后，试剂仍有至少1.5A的吸收度。完成时间为4-5分钟，几乎没有改变，因为在测试时间内灵敏度保持在0.67-0.7A，表明良好的稳定性。线性关系的研究表明在新鲜试剂和28周的样品中，线性关系都保持在至少40mmol/L处。
病人的相关资料进一步证实，比较新鲜试剂与在2-8℃情况下贮存6个月的试剂在功能上没有显著性差异(r2＝0.997)。
根据本发明，与再生系统的联合导致血清碳酸氢盐检测试剂在2-8℃加盖时，重构稳定性从一个月提高到6-8个月。在室温下、不加盖的试剂的稳定性从1天提高到大约7天。根据本发明的试剂和方法的其它优点是试剂为单一瓶装，从而减少了与现有技术试剂有关的空间和目录问题，并且适合各种测试设备系统。
应认识到有许多合适的“非天然”底物/酶对可用以减慢本发明中的试剂和方法中的辅酶的再生。除文中提到的那些外，还有其它非市售的或价格昂贵的这种酶/底物。