高温、高传真脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶(HiFi Bst) 本发明涉及用于DNA顺序测定的聚合酶和它的分析系统。
我们从嗜热脂防芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)中制备得到DNA聚合酶，进而又用Subtilisin将此DNA聚合酶水解成二个片段。其中一个大片段定名为Bst。经过反复研究，证明Bst具有如下九个重要的技术指标：
(1)Bst可在65—70℃测定DNA顺序，从而消除堆积现象；
(2)在此高温条件下，无非专一的引物与模块的结合，从而消除了杂带；
(3)包括胞嘧啶在内的所有四种核苷酸都能均匀地渗入，消除了“C”不清的现象；
(4)此高温DNA顺序测定系统既可用于标准的Sanger一步法，也可用于将同位素标记和聚合—终止反应分开的二步法；
(5)此高温体系同样适用于双链DNA顺序测定；
(6)此高温体系同样适用于36S标记和32P标记的核苷酸；
(7)二种去压缩剂—7-deaza-dGTP和dITP均可在此高温体系中使用；
(8)此高温体系在室温可放置二个星期而不失活力，充分满足了DNA顺序测定自动化的高稳定性要求；
(9)此高温体系既适用于荧光法自动化DNA顺序测定，也适用于放射性同位素法自动化DNA顺序测定。
经与其他DNA聚合酶比较，Bst的特点总结如下；特性 T7 Klenow Taq Bst Vent AMVRT3′→5′外切酶 无 低 无 无 无5′→3′外切酶 无 无 有 无 无 无延伸率 高 中 中 高 中 低对核苷酸衍生物的利用dITP 能 能 不 能 能 ？7-deaza-dGT 能 能 能 能 能条带的均一性 极好 差 好 较好 好 一般顺序测定温度(℃) ＜55 ＜50 ＜70 ＜65 ＜75 ＜42
从上表可看出，Bst的特性使它成为测定DNA顺序的理想的酶。从上表也可看出，关于Bst的3′→5′外切酶的特性不知。而其余的酶均没有3′→5′活力(Klenow具有较低的3′→5′活力。由于Klenow的延伸率不高，条带均一性差，及顺序测定温度低，在DNA顺序测定中已不应用)。
我们用紫外线处理Bacillus Stearothermophilus获得高产菌Mo-1。从Mo-1中获得HiFi Bst。用双链DNA作模板，证明HiFi Bst有3′→5′外切酶活力，并具有如下两个特性；(1)它切除配对地核苷酸，也切除不配对的核苷酸。(2)切除不配对的核苷酸的速度大于切除配对核苷酸的速度。这两个特性是目前国际上所有用于DNA顺序测定的DNA聚合酶所没有的，从而使HiFi Bst具有特殊的高度校正活力。本发明提供了DNA顺序测定中校正活力最好的DNA聚合酶HiFi Bst，因为HiFi Bst可以有效切除不配对的核苷酸，使DNA顺序反应具有独特的专一性，从而保证了DNA顺序测定图谱的高质量。
本文中简写说明：
TE： 100mmol/L Tris(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)
HiFi Bst反应缓冲液：15mM Tris-Cl，pH8.5，15mM MgCl2
DE-81：whatman产品
图1是活力测定结果
：HiFi Bst切除非配对核苷酸的活力反应
■：HiFi Bst切除配对核苷酸的活力反应
X轴：单位：小时
Y轴：计数/30秒(由FH-408自动定标器测定)
在下述的实施例中对本发明进行具体的描述：
实施例1：高温、高传真DNA聚合酶(HiFi Bst)的制备嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)，经紫外线处理获得高产菌Mo-1，经制备得到DNA聚合酶，进而用枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)将此DNA聚合酶水解成二个片段[Ye，S.and Hong，G.，Scientia Sinica，30，503-506(1987)]，其中大片段即是高温、高传真DNA聚合酶(HiFi Bst)。
实施例2：引物的设计
5′ C A T T T T G C T G C C G G T C A 3′
实施例3：DNA模板设计
(a)3′——G T A A A A C G A C G G C C A G T C T T——5′
(b)3′——G T A A A A C G A C G G C C A G T C G G——5′
实施例4：引物的同位素标记
5′ C A T T T T G C T G C C G G T C A 3′
——G T A A A A C G A C G G C C A G T C T T——
↓ α32pdATP，dGTP，Taq酶
C A T T T T G C T G C C G G T C A G A* A*(*表示32P标记)
实施例5：将标记引物与DNA模板配对
引物
＋ ＋
DNA模板(a) DNA模板(b)
5′C A T T T T G C T G C C G G T C A G A*A* 3′
3′——G T A A A A C G A C G G C C A G T C G G——5′
5′C A T T T T G C T G C C G G T C A G A* A* 3′ 3′——G T A A A A C G A C G G C C A G T C T T —5′
实施例6：HiFi Bst切除配对核苷酸的活力的测定：
将退火的模板DNA(a)和标记的引物混合物溶于10μl TE中，加入4μl HiFi Bst反应缓冲液，2单位HiFi Bst酶，加水至20μl，充分混合后，以3μl/管分装入多个0.5ml微型离心管中，再加3μl石蜡油封管，置65℃水浴中保温。每间隔一定时间取出一管，将管内反应混合物滴到DE-81纸上，在定标仪上进行初级计数。然后用0.3M磷酸钠缓冲液(pH6.8)洗涤三次，每次10分钟，然后进行第二次计数，二次计数之差即为被HiFi Bst切除的游离的同位素的量。外切酶活力以单位时间内产生游离同位素的量表示。
实施例7：HiFi Bst切除非配对核苷酸的活力的测定
将退火的模板DNA(b)和标记的引物混合物溶于10μl TE中，加入4μl Bst反应缓冲液，2单位HiFi Bst酶加水至20μl，充分混匀后，以3μl/管分装入多个0.5ml微型离心管中，再加入3μl石蜡油封管，置65℃水浴中保温。每间隔一定时间取出一管，将管内反应混合物滴到DE-81纸上，在定标仪上进行初级计数。然后用0.3M磷酸钠缓冲液(pH6.8)洗涤三次，每次10分钟，然后进行第二次计数，二次计数之差即为被HiFi Bst切除的游离的同位素的量。外切酶活力以单位时间内产生游离同位素的量表示。