用功率超声解聚包涵体的方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN94111488.0	申请日：	1994.11.02
公开号：	CN1122339A	公开日：	1996.05.15
当前法律状态：	终止	有效性：	无权
法律详情：	专利权的终止(未缴年费专利权终止)申请日:1994.11.2公告日:1999.7.14\|\|\|授权\|\|\|公开\|\|\|
IPC分类号：	C07K1/36	主分类号：	C07K1/36
申请人：	南京大学;
发明人：	王进; 冯若; 华子春; 朱德煦; 陈兆华
地址：	210093江苏省南京市汉口路22号
优先权：
专利代理机构：	南京大学专利事务所	代理人：	胡锡瑜
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内容摘要

本发明属于基因工程下游技术。其特征是用适当剂量的低频超声波辐照蛋白质包涵体的悬浮液，使包涵体松散、解聚而成为可溶性的蛋白质溶液。本发明所使用超声功率为30W-60W(电功率)，超声频率为50KHz以下的低频段。本发明工艺简单，可完全避免强烈变性剂的使用，对包涵体的处理效率高，成本低，无污染。是一项高效、价廉、实用价值高并易于推广的发明。

权利要求书

1：一种对蛋白质包涵体进行解聚的工艺方法，其特征是采用超声波辐照包涵体的悬浮液。
2：由权利要求1所述的方法，其特征是超声辐照功率为30W-60W(该功率是指电功率)；超声波频率为50kHz以下的低频段；超声波辐照时间控制为悬浮液转变成透明澄清的液体。
3：由权利要求2所述的方法，其特征是对超声解聚过程的温度进行控制，控制的范围应当在悬浮液的凝固点以上，同时解聚操作的温度应避免引起蛋白质的热变性。

说明书

用功率超声解聚包涵体的方法
    本发明属于基因工程下游技术。

    用原核细胞表达的基因工程产物普遍存在包涵体问题，在现有技术中，解聚包涵体的方法是用强烈变性剂，如高浓度尿素(6-8Murea)或盐酸胍(7M)将包涵体溶解，得到变性蛋白质的溶液，然后再将其中的变性剂透析去除。其工艺过程复杂，消耗大，成本高。目前尚未见有其它简单价廉的包涵体解聚方法。

    本发明的目的是建立一种简单、高效、低耗的解聚包涵体的全新的方法，以使基因工程产品的高成本得以显著降低。

    本发明的技术方案是：用适当剂量的低频超声波辐照蛋白质包涵体的悬浮液，以使包涵体解聚。在自然状态下的包涵体悬浮液中溶有大量空气，构成空化核。当辐照超声强度超过一定阈值时，空化核被激活，或进行非线性振荡，或体积在负声压相内突然增大随后又被压缩至崩溃，即产生空化效应。空化效应伴随产生的冲击波、声流等，破坏包涵体中蛋白质分子的链内及链间次级键，从而使包涵体松散、解聚而成为可溶性的蛋白质溶液。

    本发明所使用超声功率为30W-60W(电功率)，当功率小于20W时解聚效率降低，当功率大于60W时易导致蛋白质分子肽链的断裂。超声频率为50kHz以下的低频段。

    本发明工艺简单，可完全避免强烈变性剂的使用，对包涵体的处理效率高，成本低，无污染。因此是一项高效、价廉、实用价值高并易于推广的发明。

    本发明实施例：

    对大肠杆菌体系表达产物人巨噬细胞集落刺激因子(hM-CSF)包涵体的解聚。hM-CSF是一同源二聚体糖蛋白，共含18个半胱氨酸，表达产物地单体分子量为17kDa。用4M尿素清洗包涵体去除杂蛋白后制成浓度为10mg/ml的包涵体悬浮液(4M urea，0.1M Tris-HCl，50mM 2-巯基乙醇，pH8.0)，超声处理过程控温0℃，超声波频率为28.2kHz，超声辐照系统如图1。超声辐照(电)功率45W，辐照时间6分钟。将包涵体悬浮液受辐照后的结果进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，并以包涵体用8M尿素溶解的溶解液作对照，结果显示，在17kDa处均有清晰的条带，对超声辐照后的样品用考马斯亮蓝检测蛋白质含量，结果显示经辐照后溶解的蛋白含量随时同增加至达到饱和，其饱和值与包涵体用8M尿素的溶解对照相同。

    附图说明：

    图1.超声辐照系统框图.

    [1]信号源、[2]衰减器、[3]监示器、[4]放大器、

    [5]适配器、[6]超声换能器(28.2kHz)、[7]样品池、

    [8]控温水浴(冰水混和液)