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1、(10)申请公布号 CN 102228471 A (43)申请公布日 2011.11.02 CN 102228471 A *CN102228471A* (21)申请号 201110175421.4 (22)申请日 2011.06.27 A61K 35/06(2006.01) A61P 13/12(2006.01) (71)申请人 山西大学 地址 030006 山西省太原市小店区坞城路 92 号 (72)发明人 张生万 杨喜花 任连生 (74)专利代理机构 山西五维专利事务所 ( 有限 公司 ) 14105 代理人 杨耀田 (54) 发明名称 一种猫棒束孢菌丝体的用途 (57) 摘要 本发明公开。
2、了猫棒束孢真菌丝体在制备治疗 顺铂引起的急性肾损伤药物中的应用。实验结果 显示， 小鼠注射顺铂、 患者使用顺铂化疗后其血清 中CRE和BUN水平明显升高， 说明顺铂对小鼠及化 疗患者均可引起急性肾损伤， 注射顺铂小鼠在灌 胃猫棒束孢菌丝体干粉、 顺铂化疗患者服用猫棒 束孢菌丝体干粉后其血清中 CRE 和 BUN 水平均明 显下降， 表明猫棒束孢菌丝体对顺铂引起的急性 肾损伤有显著的治疗作用。本发明提供了猫棒束 孢真菌丝体在制备治疗顺铂引起的急性肾损伤药 物中的应用， 猫棒束孢菌丝体可进一步开发成为 顺铂化疗治疗中的辅助药物。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12。
3、)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 CN 102228472 A1/1 页 2 1. 猫棒束孢菌丝体在制备治疗顺铂引起的急性肾功能损伤的药物中的应用。 2. 如权利要求 1 所述的猫棒束孢菌丝体在制备治疗顺铂引起的急性肾功能损伤的药 物中的应用， 所述的猫棒束孢其保藏号为 CGMCC NO. 0706。 权 利 要 求 书 CN 102228471 A CN 102228472 A1/5 页 3 一种猫棒束孢菌丝体的用途 技术领域 0001 本发明涉及猫棒束孢真菌菌丝体的用途， 具体是在制备治疗顺铂引起的急性肾损 伤药物中的应用。 背景技术 0002 猫棒束孢(I。
4、saria felina)是从天然冬虫夏草子实体中经菌种分离培养获得的一 种可工业化生产的菌株， 在分类上属于半知菌纲、 丛梗孢目、 棒束孢属。经中国科学院微生 物研究所郭英兰教授鉴定为 Isaria felina(DC. ： Fr)Fr， 该菌种已被中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心保藏 ( 保藏号 ： CGMCC NO.0706)， 并取得国家发明专利。 0003 Deffieux Gerard 等人 (J Antibiot(Tokyo).1981， 34(10) ： 1261-1265.) 从 Isaria felina 中提取分离得到环羧酚酸肽结构的杀虫剂 Isariins 。
5、B， C 和 D， 并对 Isariins B， C 和 D 的结构进行了鉴定 (J Antibiot(Tokyo).1981， 34(10) ： 1266-1270.)。 郭永霞从猫棒束孢菌丝体中分离纯化得到具有抗真菌作用的环缩肽 isarfelin， 并对 isarfelin 进行了理化性质的分析、 结构鉴定， 并发现 isarfelin 具有抑制细菌、 抵抗真菌 的活性 ( 郭永霞 . 猫棒束孢菌抗真菌多肽和巨大口蘑抗真菌蛋白的分离纯化及特性的研 究 ： 博士论文 . 北京 ： 中国农业大学， 2005)。Ikumoto 等研究发现冬虫夏草、 蛹虫草及 猫棒束孢的浸出液对离体心房有负收缩。
6、效应， 同时对电刺激回肠的收缩反应及人血小板 的凝结有抑制作用 (Journal of the Pharmaceutical Society of Japan， 1991， 111(9) ： 504-509)。 0004 目前尚未见到关于猫棒束孢在治疗肾功能损伤方面的研究报道。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种猫棒束孢菌丝体在制备治疗顺铂引起的急性肾损伤药 物中的应用。 0006 本发明所涉及的猫棒束孢菌是从天然冬虫夏草子实体中经分离培养获得， 该菌株 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC)， 保藏号为 CGMCC NO.0706。 0007 本发明。
7、使用的猫棒束孢菌丝体可按专利号 ZL02103669.1 的方法培养得到。 0008 本发明猫棒束孢菌丝体在制备治疗顺铂引起的急性肾功能损伤药物中的应用 ： 将 猫棒束孢菌丝体干燥粉碎后用于动物实验和临床观察， 实验结果显示， 小鼠注射顺铂、 患者 使用顺铂化疗后其血清中 CRE 和 BUN 水平明显升高， 说明顺铂对小鼠及化疗患者均可引起 急性肾损伤， 小鼠在灌胃猫棒束孢菌丝体干粉、 顺铂化疗患者服用猫棒束孢菌丝体干粉后 其血清中 CRE 和 BUN 水平均明显下降， 表明猫棒束孢菌丝体对顺铂引起的急性肾损伤有显 著的治疗作用。 0009 实验研究结果表明， 猫棒束孢菌丝体对顺铂引起的小鼠急。
8、性肾衰有很好的治疗作 用， 对临床化疗中因顺铂引起的急性肾损伤有很好的治疗效果， 表明猫棒束孢菌丝体是一 说 明 书 CN 102228471 A CN 102228472 A2/5 页 4 种具有良好开发前景的抗肾损伤的药物， 该药物可作为顺铂化疗治疗中的辅助药物。 附图说明 0010 图 1 注射顺铂后小鼠体重变化情况 ； 0011 图 2A 为正常组肾脏病理图 ； 0012 图 2B 为模型组肾脏病理图 ： 肾小管变性坏死， 上皮细胞浑浊肿胀， 轻度纤维增生 ； 0013 图 2C 为模型组肾脏病理图 ： 肾小管变性坏死， 出现炎性细胞浸润灶 ； 0014 图 2D 为 IF 给药组肾脏。
9、病理图 ： 肾小管基本正常， 少量炎性细胞浸润。 具体实施方式 0015 实施例 1 动物实验 0016 1. 材料和方法 0017 1.1 动物、 药品与试剂 0018 昆明小鼠， 雄性， 体重 23-26g， 由山西省肿瘤研究所实验动物中心繁殖， 实验动物 生产许可证号 ： SCXK( 晋 )2007-0001， 实验动物使用许可证号 ： SYXK( 晋 )2007-0002。 0019 猫棒束孢菌丝体 (IF) 可由专利号 ZL02103669.1 的方法培养。培养基 ： 蛋白胨 0.6， 酵母膏 1.2， 蔗糖 2.4， MgSO40.05， KH2PO40.1， 饱和 NaHCO3溶。
10、液 ； 培养方法 ： 3 只西林瓶菌种 (0.5g/ 瓶 ) 接种于 6 只 3000mL 三角瓶， 装量 500mL/ 瓶， 牛皮纸封口， 于 180r/min、 26.5条件下培养2-3d， 收获， 发酵液于2000r/min离心5min， 得菌丝体， 于80 烘 24h， 测干重， 菌丝体得率为 4.8g/500mL。所得菌丝体干燥粉碎后用于实验研究。 0020 顺铂， 南京制药厂有限公司生产， 批号 20100702。 0021 1.2 动物分组及给药 0022 雄性昆明小鼠 74 只， 随机分为 5 组， 分别为正常对照组， 模型对照组， IF 给药高、 中、 低剂量组， 正常对照组。
11、为 10 只小鼠， 其余各组为 16 只小鼠。模型对照组及各 IF 给药组 动物一次性腹腔注射顺铂 10mg/kg(1mL/100g) 以造成小鼠急性肾损伤模型， 正常对照组腹 腔注射等量生理盐水 ； IF 给药高、 中、 低剂量组动物在注射顺铂之后连续每日灌胃给予 IF 7d， 灌胃量分别为 1000mg/kg、 500mg/kg， 250mg/kg， 正常对照组及模型对照组灌胃给予等量 蒸馏水 (1mL/100g)。 0023 1.3 一般情况观察 0024 实验过程中观察小鼠皮毛色泽、 精神状态、 进食进水情况、 存活率及体重变化等一 般情况。 0025 1.4 血清生化指标测定 002。
12、6 给药结束后 24h， 称重小鼠， 腹腔注射戊巴比妥钠 (60mg/kg) 麻醉小鼠， 摘眼球取 血， 3000r/min 离心， 分离血清， 使用全自动生化分析仪 ( 荷兰威图， 仪器型号 SELECTRA-E ； 仪器编号 GLP-ZB-001) 测定血清 BUN 和 CRE 含量。 0027 1.5 脏器指数与肾脏病理学检查 0028 取血后剖取小鼠左肾、 右肾、 肝脏、 脾脏及胸腺， 计算各脏器指数 ； 观察比较两组动 物肾脏外观 ； 取左肾， 剥除外膜， 以 10甲醛固定过夜， 常规脱水、 透明、 石蜡包埋、 切片、 HE 染色， 镜下观察肾脏病理改变。 说 明 书 CN 1022。
13、28471 A CN 102228472 A3/5 页 5 0029 1.6 统计学分析 0030 实验数据以表示， 采用 SPSS17.0 软件进行数据统计分析， 组间均数比较采用 单因素方差分析， 两组间比较采用最小显著差异法 (LSD)， 取 0.05 为检验水准。 0031 2. 结果 0032 2.1 动物的一般情况 0033 各造模组小鼠在注射顺铂后体重明显下降， 到第 5 天体重下降至最低点， 之后体 重开始恢复 ( 见图 1)。与正常对照组相比， 造模组小鼠进食量和饮水量均明显减少， 5d 后 进食量和饮水量开始增加， 皮毛松散、 无光泽， 体重下降明显(见表1)。 各IF给药。
14、组较模型 对照组小鼠状态明显好转， 活动增加， 皮毛略有光泽。正常对照组动物无死亡现象发生， 各 造模组动物有一定量的死亡， 且模型对照组动物死亡数最多， 表明顺铂对小鼠造成了一定 的伤害， 各IF给药组动物死亡数量有所减少， 说明IF对由顺铂致小鼠伤害有一定的保护作 用。 0034 表 1. 小鼠存活率及体重变化情况 0035 0036 注 ： * 表示与正常对照组相比较有极显著性差异 (p 0.01) ； 表示与模型组相 比较有极显著性差异 (p 0.01)。 0037 2.2 血清 BUN、 CRE 水平变化 0038 模型组动物血清 BUN、 CRE 水平较正常对照组明显升高 (p 0。
15、.01)， IF 给药各剂量 组 BUN、 CRE 水平与模型对照组相比有明显的回落 (p 0.01)， 且未显示出一定的剂量依赖 性， 其中中、 低剂量组改善 CRE、 BUN 水平的能力优于高剂量组 ( 见表 2)。 0039 表 2. 小鼠血清 BUN、 CRE 水平变化 0040 0041 注 ： * 表示与正常对照组相比较有极显著性差异 (p 0.01) ； 表示与模型组相 说 明 书 CN 102228471 A CN 102228472 A4/5 页 6 比较有极显著性差异 (p 0.01)。 0042 2.3 脏器指数的变化 0043 正常对照组动物肾脏大小适中， 颜色褐红， 。
16、表面光滑 ； 而模型组动物肾指数降低 (p 0.01)， 肾脏苍白， 表面凹凸不平， IF 给药各剂量组肾指数较模型组有明显的增加 (p 0.05) ； 与正常对照组相比， 模型组肝脏指数有明显的增加 (p 0.05)， IF 中、 低剂量组 与模型组相比较， 其肝指数显著回落 ； 与正常组相比， 模型组动物脾指数和胸腺指数有所下 降(p0.01)， 各IF给药组的脾指数和胸腺指数都没有得到恢复， 说明IF对顺铂导致的免 疫器官的损伤未起到保护作用 ( 见表 3)。 0044 表 3. 脏器指数 ( 脏器重量 / 体重 ) 0045 0046 注 ： * 表示与正常对照组相比较有极显著性差异 。
17、(p 0.01)， * 表示与正常对照组 相比较有显著性差异 (p 0.05) ； 表示与模型组相比较有极显著性差异 (p 0.01)， 表示与模型组相比较有显著性差异 (p 0.05)。 0047 2.4 肾脏病理学检查 0048 病理切片结果显示， 空白对照组小鼠肾脏肾小管未见扩张， 肾小管上皮完好、 无水 肿现象， 肾间质未见炎症细胞浸润 ( 图 2A) ； 模型组动物肾小管变性坏死， 上皮细胞浑浊肿 胀， 轻度纤维增生 ( 图 2B)， 肾间质有炎性细胞浸润 ( 图 2C) ； 给药组动物肾小管基本正常， 少量炎性细胞浸润 ( 图 2D)。 0049 3. 结论 0050 实验结果表明。
18、， 一次性大剂量注射顺铂 10mg/kg 可引起小鼠急性肾损伤， 注射顺 铂后小鼠体重明显降低， 肾脏指数、 脾指数及胸腺指数显著降低， 肝指数显著升高， 小鼠血 清 BUN、 CRE 显著升高 ； IF 对顺铂导致的肾脏萎缩以及肝脏肿大有显著的恢复作用， 但对顺 铂导致的免疫器官脾脏及胸腺的损伤未起到保护作用， IF 在一定剂量下能够降低急性肾损 伤小鼠血清 CRE、 BUN 水平， 改善肾脏病理变化， 减轻由顺铂造成的小鼠急性肾损伤。 0051 实施例 2 临床试验 0052 1. 试验方法 0053 将采用顺铂联合化疗方案的各类肿瘤患者随机分为对照组和 IF 治疗组， IF 治疗 组患者。
19、自化疗当日开始每天服用 IF 胶囊 3g/d， 连续 7d， 对照组常规化疗， 分别测定化疗前 及化疗后一周时患者血清 CRE、 BUN 等水平， 以评价 IF 在减轻顺铂所致急性肾损伤的作用， 疗效评价为 ： IF 治疗组与化疗后相比较， 各项指标显著低于对照组为有效， 无显著差别为 无效。 数据采用SPSS17.0统计软件处理， 统计方法为T检验， 以P0.05为有显著性差异。 0054 2. 结果 说 明 书 CN 102228471 A CN 102228472 A5/5 页 7 0055 表 1 顺铂联合化疗前后肾功能变化 0056 0057 注 ： 表示与化疗前相比有显著性差异 (。
20、P 0.05) ；* 表示与化疗后相比有显著性 差异 (P 0.05)。 0058 由上表可见， 对照组患者化疗后其血清CRE和BUN水平较化疗前显著升高， 说明顺 铂联合化疗引起患者急性肾损伤， IF 治疗组患者血清 CRE 和 BUN 水平较化疗后对照组患者 显著降低， 表明 IF 对顺铂致化疗患者急性肾损伤有很好的保护作用。 0059 3. 结论 0060 IF 对顺铂化疗致临床患者肾损伤有很好的保护作用。 说 明 书 CN 102228471 A CN 102228472 A1/3 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102228471 A CN 102228472 A2/3 页 9 图 2A 图 2B 说 明 书 附 图 CN 102228471 A CN 102228472 A3/3 页 10 图 2C 图 2D 说 明 书 附 图 CN 102228471 A 。