一种败血症检测芯片及其制备工艺和使用方法 一、技术领域：本发明涉及医学体外诊断技术，具体的讲是一种基因芯片——一种败血症检测芯片及其制备工艺和使用方法。
二、背景技术：败血症是常见的临床疾病，几乎在各个科室均可能出现。虽然目前医疗水平提高，新药物新疗法不断出现，败血症的发病率显著降低，但严重的败血症一旦出现往往是致命的。因而能否得到及时恰当的治疗很大程度上取决于诊断是否准确迅速。有多种因素影响败血症的治疗效果，可概括的分为：致病菌的毒力，患者自身的免疫力以及医疗护理情况。日益增加的抗生素的使用使临床治疗不得不面临致病菌耐药问题，以及由此所造成的人力、物力的浪费。致病菌种类多种多样，各种属的理化性质和耐药特性不同，甚至同种属中、不同亚型间致病毒力差异都很大，同样给临床治疗造成很大麻烦。
传统检测败血症致病菌的方法包括：革兰氏染色，基于抗体的免疫法检测和细菌培养等。镜检简单快速，却需要有相当数量的细菌。抗体检测虽然速度较快，但一次只能检测一种抗体，效率低。细菌培养将灵敏度提高了，培养时间却成为不可逾越的障碍。而且抗生素的应用还可以造成革兰氏染色及细菌培养的假阴性结果。发明一种高效高灵敏度的检测方法成为必需。
三、发明内容：
1、发明目的：本发明提供一种败血症检测芯片及其制备工艺和使用方法，其目的在于解决败血症检测中存在地效率低、诊断不准确等方面存在的问题。
2、技术方案：本发明是通过以下技术方案来加以实现的：
一种败血症检测芯片及其制备工艺和使用方法，其特征在于：该芯片为玻璃基片上分布有多个不同区域的微阵列，在每个微阵列区域中，分别固定有常见的败血症致病菌的特异性探针。
探针的大小为15-20个碱基，设计60个探针，所设计的探针序列见下文；
本发明制备工艺按如下步骤进行：
(1)、设计败血症特异性探针和引物；
从数据库中获得可靠的败血症致病菌基因序列，根据所述的探针序列设计探针；
从数据库中获得可靠的败血症致病菌病毒基因序列，选择同用引物F482：5`-CGGCTAACTC TGTGCCAGC；R789：ATCTATGGGA CCATCAGGTACGG-5`针对16s部分基因序列进行扩增，扩增同时标记荧光素；
(2)、合成探针；
(3)、制备芯片；
用去离子水将合成的探针溶解，浓度为200mmol/l，在玻璃基片上进行点样；点好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小时；以探针缓冲液及蒸馏水冲洗玻片，吹干；以封闭液封闭玻片，之后洗涤3次，吹干备用。
对待测血样的预处理过程中，PCR扩增引物序列见下文；
探针5’端加氨基修饰。
点样从几十点到上千点，点的大小为50-100微米左右。
探针缓冲液为1xSSC，0.1％SDS；封闭液为1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB。使用方法按如下步骤进行：
(1)取病人静脉血3-5毫升，分别提取DNA，备用；如需长时间放置，在-20℃下冻存；
(2).PCR扩增
在反应管中加入扩增反应混合物——Taq酶，相应的处理好的样品和引物，足量的dNTP以及荧光素Cy3标记的dUTP；扩增条件如下：
94℃ 5min
94℃ 30sec
56℃ 30sec
72℃ 1min
72℃ 5min
以上步骤为30个循环；
(3).杂交；
PCR产物与芯片上的探针在60℃下杂交2小时，杂交缓冲液(10xSSC，0.1％SDS)与PCR产物的比例为1∶1，洗涤3次。
(4).检测；
用扫描仪扫描杂交后的芯片，得到图像并输出结果；
(5).数据分析
将芯片分析结果输出。
3、优点及效果：
基因芯片是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一，它是物理学、化学、微电子学、精密机械与生命科学交叉综合的高科技。基因芯片集成的不是电子元器件，采用在位组合化学、微电子芯片光刻技术，或者利用其它方法将大量特定序列的DNA探针有序地固定在基片上，在与待测样品DNA作用后，即可检测到大量的生命信息，包括基因识别、基因突变和基因表达等。利用基因芯片可以快速、高效地获取或处理大量的生命信息，它对生命科学研究、医学诊断、新药筛选和司法鉴定等具有革命性的推动作用。
本发明提供了一种败血症检测芯片。将已经合成的特异性探针矩阵固定于基片表面，通过芯片与待测样本DNA杂交，即可获取大量与败血症相关的生物学信息。利用这种芯片，通过一次操作就可以同时完成败血症致病菌的检测。该基因芯片具有诊断准确、特异性高、信息量大的特点。如果将此芯片成功应用于临床，必将带来极大的经济效益和社会效益。
四、具体实施方式：本发明实施的具体步骤是：
1.设计败血症特异性探针和引物
从NCBI等数据库获得可靠的败血症致病菌基因序列以及耐药特征序列等，选择败血症致病菌16s基因序列，利用生物信息学软件设计引物和特异性的探针。选择同用引物F482：5`-CGGCTAACTC TGTGCCAGC；R789：ATCTATGGGA CCATCAGGTACGG-5`针对16s部分基因序列进行扩增，扩增同时标记Cy3荧光素。在基因芯片上以点样的方式固定61种不同病原菌特异探针，鉴别Acinetobacter、Actinomyces、Borrelia burgdorferi、Burkholderia cepacia、Bacteroides fragilis、Burkholderia pseudomallei、Bartonella sp.、Borrelia afzelii、Borrelia garinii、Clostridium difficile、Clostridium perfringens、Capnocytophaga ochracea、Chlamydia pneumoniae、Clostridium septicum、Coxiella burnetii strain1M、Escherichia coli、Enterobacter aerogenes、Enterococcus dispar[duran]、Enterococcus faecalis strainK4、Enterococcus faecium、Flavimonasoryzihabitans、Flavobacterium sp.、Fusobacterium necrophorum、Haemophilus influenzae、Klebsiellaoxytoca-16、Klebsiella pneumoniae、Leptospira interrogans、Lactobacillus sp.B5406、Legionellasp.strain LLAP9、Mycobacterium tuberculosis、Moraxella sp.、Mycoplasma pneumoniae strainATCC15531、Neisseria meningitidis、Nocardia asteroides、p-mor、p-pro、Peptococcus niger、Peptostreptococcus sp.、Prevotella intermedia ATCC25611、Proteus vulgaris、Pseudomonas sp.、Rhodococcus sp.、Rickettsia typhi strain Wilmington、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcushaemolyticus、s-aea、Streptococcus agalactiae、Streptococcus bovis、Streptococcus milleri、Streptococcus pyogenes、Staphylococcus haemolyticus、Salmonella、Serratia sp.、Staphylococcusaureus、Staphylococcus saccharolyticus、Stenotrophomonas sp.、Treponema pallidum、V.cholerae、V.vulnificus、bacillus subtilis病原微生物。
2.合成探针
由上海生物工程有限公司合成。探针5’端加氨基修饰。
3.制备芯片
根据需要设定点样程序，矩阵分布根据探针杂交动力学要求及点样方便与否安排。用去离子水将合成的探针溶解，浓度为200mmol/l。使用CEL公司生产的玻璃基片，用BioRobotics公司的点样仪按预先设定好的程序进行点样。按照不同要求从几十点到上千点，点的大小为50-100微米左右，点间距依点的数量而定。点好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小时。以探针缓冲液(1xSSC，0.1％SDS)及蒸馏水冲洗玻片，吹干。以封闭液(1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB)封闭玻片，之后洗涤3次。吹干备用。
上述败血症检测芯片的应用方法包括以下步骤：
(1).处理样品
取病人静脉血3-5毫升，用溶菌酶溶解，氯仿抽提，乙醇沉淀法提取细菌DNA，备用。如需长时间放置，在-20℃下冻存。
(2).PCR扩增
在反应管中加入扩增反应混合物，Taq酶，处理好的样品和引物，足量的dNTP以及荧光素(Cy3)标记的dUTP。扩增条件如下：
94℃ 5min
94℃ 30sec
56℃ 30sec 30个循环
72℃ 1min
72℃ 5min
以上步骤为30个循环；
(3).杂交
PCR产物与芯片上的探针在60℃下杂交2小时，杂交缓冲液(10xSSC，0.1％SDS)与PCR产物的比例为1∶1。洗涤3次。
(4).检测
用Genomic Solutions公司的扫描仪扫描杂交后的芯片，得到图像并输出结果。
(5).数据分析
Genomic Solutions公司的扫描仪的配套分析软件将芯片分析结果输出。
以下结合具体的实施例对发明的技术方案作进一步的说明：
实施例：
设计败血症引物及常见致病菌特异性探针60个。探针的大小为15-20个碱基。由上海生物工程有限公司合成。探针5’端加氨基修饰。
制备基因芯片：
用CEL公司生产的玻璃基片，使用BioRobotics公司的点样仪按预先设定好的程序进行点样。用去离子水将合成的探针溶解，浓度为200mmol/l。点好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小时。以探针缓冲液(1xSSC，0.1％SDS)及蒸馏水冲洗玻片，吹干。以封闭液(1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB)封闭玻片，之后洗涤3次。吹干备用。
处理样品：取临床培养结果为金黄色葡萄球菌感染的患者静脉血少量，用苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀法沉淀得DNA，备用。
PCR扩增：采用的引物序列是：F482：5`-CGGCTAACTC TGTGCCAGC；R789：ATCTATGGGA CCATCAGGTACGG-5`.。
反应总体积为20μl，在反应管中加入10X buffer 2μl，Taq酶0.2μl，处理好的样品0.8μl和上下游引物各2μl，dNTP0.8μl以及Cy3标记的dUTP1.2μl，其余的用H2O。扩增条件如下：
94℃ 5min
94℃ 30sec
56℃ 40sec
72℃ 1min
72℃ 5min
以上步骤为30个循环；
杂交：PCR产物与芯片上的探针在60℃下杂交2小时，杂交缓冲液(10xSSC，0.1％SDS)与PCR产物的比例为1∶1。洗涤3次。
检测：用Genomic Solutions公司的扫描仪扫描杂交后的芯片，得到图像并输出结果。
数据分析：Genomic Solutions公司的扫描仪的配套分析软件将芯片结果输出。与临床检验结果比较，符合率100％。
败血症检测芯片引物及探针序列表
Sepsis
primer Sequence
F482 5`-CGGCTAACTC TGTGCCAGC
R789 ATCTATGGGA CCATCAGGTACGG-5`
Probe Sequence
Acinetobacter F577 5`-CAAATGTGAA ATCCCCGAGC
Actinomyces F577 5`-CCGTGAAATC CCCTGGCT
Borrelia burgdorferi F577 5`-AAGTCTATGC ATAAAATACC ACAGCTC
Burkholderia cepacia F577 5`-TGAAATCCCC GGGCTCA
Bacteroides fragilis F577 5`-TTGTGAAAGT TTGCGGCTCA
Burkholderia pseudomallei F557 5`-CTAAGACCGA TGTGAAATCC CC
Bartonella sp. F557 5`-TAAGTCAGAG GTGAAATCCC AGG
Borrelia afzelii F557 5`-TCTATGCATA AAATACCACA GCTCA
Borrelia garinii F557 5`-TGCATAAAAT ACCACGGCTC A
Clostridium difficile F557 5`-AGTCAGGAGT GAAAGGCTAC GG
Clostridium perfringens F557 5`-GATGATTAAG TGGGATGTGA AATACC
Capnocytophaga ochracea F557 5`-TATTAAGTCA GGGGTGAAAG GTTTC
Chlamydia pneumoniae F557 5`-AAGGAAAGTT AGATGTTAAA TTTTGGG
Clostridium septicum F557 5`-GCGGACTTTT AAGTGAGATG TGA
5`-ATGTGAAATA CCCGGGCTCA
Coxiella burnetii strainlM F557 5`-TCTAAGTCGG ATGTGAAAGC CC
Escherichia coli F557 5`-TGTTAAGTCA GATGTGAAAT CCCC
Enterobacter aerogenes F557 5`-AGGCGGTCTG TTAAGTCAGA TGT
Enterococcus dispar[duran] F557 5`-AGGCGGTTTC TTAAGTCTGA TGT
e-dis， 5`-CAGGCGGTTT CTTAAGTCTG ATG
Enterococcus faecalis strainK4 F557 5`-AGGCGGTTTC TTAAGTCTGA TGT
e-faeci 5`-GCAGGCGGTT CTTAAGTCTG A
Enterococcus faecium F557 5`-AGGCGGTTCT TAAGTCTGAT GTG
Flavimonas oryzihabitans F557 5`-GGGTGGTTTG TTAAGTTGGA TGT
Flavobacterium sp. F557 5`-TTAAGTCAGT AGTGAAATCT TGCAGC
Fusobacte rium necrophorum F557 5`-GCGGGTTCAT AAGTCTGATG TTAA
Haemophilus influenzae F557 5`-AGGCGGTTAT TTAAGTGAGG TGT
Klebsiella oxytoca-16 F557 5`-CGGTCTGTCA AGTCGGATGT G
k-oxy 5`-GATCTGGAGG AATACCGGTG G
Klebsiella pneumoniae F557 5`-CGGTCTGTCA AGTCGGATGT G
Leptospira interrogans F557 5`-TGTGAAAACT GCGGGCTCA
Lactobacillus sp.B5406 F557 5`-AAGTCTGATG TGAAAGCCCT CG
Legionella sp.strain LLAP9 F557 5`-AGGTGGTTTG GTAAGTTATC TGTGA
Mycobacterium tuberculosis F557 5`-GTTTGTCGCG TTGTTCGTGA
Moraxella sp. F557 5`-TGACTTTTAA GTCAGGGGTG AAAT
Mycoplasma pneumoniae strain ATCC 15531 F557 5`-GGATTGAAAA GTCTGGTGTT AAAGG
Neisseria meningitidis F557 5`-AGACGGTTAC TTAAGCAGGA TGTG
Nocardia asteroides F557 5`-GTCGTTTGTG AAAACTTGGG G
p-mor F557 5`-GGTTGATTGA GTCAGATGTG AAATC
p-pro F557 5`-GCGGTTGATT AAGTTAGATG TGAAA
Peptococcus niger F557 5`-AGGCGGTAAA TTAAGTCAGG TGT
Peptostreptococcus sp. F557 5`-GTGGTCTTTC AAGTCGGTGG TT
Prevotella intermedia ATCC 25611 F557 5`-ATGATTAAGC GTGACGTGAA ATG
Proteus vulgaris F557 5`-CAATTAAGTC AGATGTGAAA GCCC
Pseudomonas sp.strain Circle F557 5`-AGGTGGTTAG TTAAGTTGGATGTGA
Rhodococcus sp F557 5`-CGTTTGTGAA AACCAGCAGC
Rickettsia typhi strain Wilmington F557 5`-TTTAGTAAGT TGGAAGTGAA AGCCC
Staphylococcus epidermidis F557 5`-AGTCTGATGT GAAAGCCCACG
epi-hae 5`-AACTGGAAAA CTTGAGTTCA GAAGAG
Staphylococcus haemolyticus F557 5`-AGTCTGATGT GAAAGCCCACG
hae-epi 5`-ATTGGAAACT GTAAAACTTG AGTGC
s-aea F557 5`-AGGCGGTTCT TTAAGTCTGA AGTT
Streptococcus agalactiae F557 5`-AGGCGGTTAG ATAAGTCTGA AGTT
Streptococcus bovis F557 5`-AGGCGGTTTA ATAAGTCTGA AGTTAA
Streptococcus milleri F557 5`-GCGGTTAGAA AAGTCTGAAG TGAA
Streptococcus pyogenes F557 5`-TCTGAAGTTA AAGGCATTGG CTC
Staphylococcus haemolyticus F557 5`-TCAAGTCGGA TGTGAAGTCC C
Salmonella F557 5`-TGAAATCCCC GGGCTCA
Serratia sp. F557 5`-GTGAAATCC CCGCGCTTA
Staphylococcus aureus F557 5`-AGTCTGATGT GAAAGCCCACG
Staphylococcus saccharolyticus F557 5`-AGTCTGATGT GAAAGCCCAC G
Stenotrophomonas sp. F557 5`-AGGTGGTCGT TTAAGTCTGT TGTG
Treponema pallidum F557 5`-GCGGACTGGT AAGCCTGGT
V.cholerae F557 5`-TCAGATGTGA AAGCCCTGGG
V.vulnificus F557 5`-GAAAGCCCGG GGCTCA
bacillus subtilis F557 CTGATGTGAAAGCCCCCG
PCR扩增引物序列如下：
Sepsis
primer Sequence
F482 5`-CGGCTAACTC TGTGCCAGC
R789 ATCTATGGGA CCATCAGGTACGG-5`