对虾白斑杆状病毒WP486基因及其编码的多肽 【技术领域】
本发明涉及一种对虾白斑杆状病毒基因的核苷酸序列。具体地说，本发明涉及对虾白斑杆状病毒极早期调控基因WP486的核苷酸序列，还涉及由该核苷酸序列编码的一种具有基因调控活性的多肽。本发明这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和活性多肽的生产方法。
背景技术
对虾白斑杆状病毒(white spot bacilliform virus，WSBV)又称为对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus，WSSV)是近年来危害我国及亚洲太平洋地区人工养殖对虾的主要病毒病原之一，它能高致死率地侵染绝大多数种类的对虾，此外还可侵染淡水及海洋生态系统中多种蟹类、龙虾类、端足类、水蝇类等甲壳纲动物，具有较广泛的宿主范围，因此它不仅严重危害对虾养殖，还对海洋生态造成了影响。WSBV是双链DNA病毒，基因组全长305kb，是迄今为止发现的最大的动物病毒(J.Virol.2001，75：11811-11820)。基因组序列遗传分析及形态学特征都表明WSBV是一种新病毒，它不属于目前已知的任一种病毒家族。目前还难以对WSBV进行预防和控制，一方面由于WSBV能在自然环境中存活较长时间，更重要的是人们对此病毒分子水平的了解还很少。基因组Microarray分析表明WSBV编码一种病毒感染极早期的基因，可能调控蛋白(其中预测的WP486可能编码WP486蛋白)，在WSBV的感染、复制、转录及翻译过程中具有重要的调控功能。
【发明内容】
本发明中的编码WP486活性多肽的核苷酸序列是如此获得的。以纯化的WSBV基因组DNA构建文库，测定病毒基因组全序列，根据序列合成SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的序列作为引物，经PCR扩增获得了SEQ ID No.1的序列。然后通过重组表达WP486基因，纯化WP486基因的表达产物，预测具有基因调控功能。在本发明被公布之前，尚没有任何人公开过本申请中涉及的WP486蛋白序列。本发明将可能为WSBV的防治提供新的途径。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该核苷酸编码一种新的WSBV蛋白，此蛋白被命名为WP486。
本发明的另一个目的是提供一种新的WSBV蛋白，该蛋白被命名为WP486。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的WSBV蛋白的方法。
本发明还提供了这种WSBV基因序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括：一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括：编码WP486蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID No.1中1-1458的核苷酸序列有至少70％的相似性；或者所述核苷酸序列能在中等严谨条件下与SEQ ID No.1中1-1458的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID No.2所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID No.1中1-1458位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的WP486蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或者其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID No.2序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有WP486蛋白活性的多肽的方法。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明中分离的多核苷酸全长为1458个核苷酸，其详细序列见SEQ ID No.1，其中开放阅读框位于1-1458位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“WP486蛋白(和多肽)编码序列”是指编码具有WP486蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID No.1中的1-1458位序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID No.1序列的编码框1-1458位核苷酸中，由一个和多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID No.1中1-1458位核苷酸相似性低至约70％地简并序列也能编码出SEQ ID No.2所述的序列。该术语还包括能在严谨条件下，更佳地在高度严谨条件下，与SEQ ID No.1中从核苷酸1-1458位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID No.1中1-1458的核苷酸序列的相似性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与WP486相同功能的蛋白的、SEQ IDNo.1序列的变异形式。这些形式包括：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地10个以内，最佳地5个以内)核苷酸。
在本发明中，“纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少50％，较佳地至少75％，更佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯化可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC测量多肽的纯度。
在本发明中，术语“WP486蛋白多肽”指具有基因调控活性的SEQID No.2序列的多肽。该术语还包括具有基因调控功能的、SEQ IDNo.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括WP486蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、修饰形式、在高或低的严谨度条件下能与WP486 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗WP486多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其它多肽，如包含WP486多肽或者其片段的融合蛋白。
本发明还提供WP486蛋白或多肽的类似物，这些类似物与天然WP486多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传突变体，诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生的随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知的分子生物学技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基的序列，还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
另一方面，本发明还包括对WP486 DNA或是其片段编码的多肽能特异性相互作用的多克隆抗体、单克隆抗体及其它能够抑制WP486蛋白功能的分子。这里，“特异性”是指能相互作用并结合于WP486基因产物或片段。
附图说明：
图1重组WP486表达纯化的SDS-PAGE图谱；
【具体实施方式】
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 WP486基因片段的克隆和测序
以WSBV基因组DNA为模板，用引物P1、P2扩增WP486基因。
P1：5′-CGT
GGATCCGACACAGACGATTTTGAGCC-3′(SEQ IDNo.3)；
P2：5′-GA
GCGGCCGCA
GCTAGCTTGGCTGGACAATAAAT-3′(SEQ IDNo.4)；
划线部分
GGATCC为BamH I酶切位点，
GCGGCCGC为NotI酶切位点，
GCTAGC为NheI酶切位点。
PCR反应条件为：
94℃ 60秒
55℃ 60秒
72℃ 1.5分钟(30圈)
琼脂糖凝胶电泳纯化扩增片段后，克隆到原核表达质粒载体pGEX4T-1，获得重组表达质粒pGEX-WP486，进行测序，测序所得WP486基因序列详见SEQ ID No.1。
根据得到的核苷酸序列推导出的WP486的氨基酸序列，共486个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID No.2。
实施例2 重组WP486片段的表达与纯化
将含有WP486基因的重组表达质粒pGEX-WP486转化大肠杆菌BL21，选取阳性克隆在含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中37℃摇培至A
600＝0.6时，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L，37℃诱导6h后收集菌体。加入冰冷的裂解缓冲液(1×PBS，10mM NaHPO
4，140mM NaCl，2.7mM KCl，1.8mM KH
2HPO
4)，超声裂解细菌(300W×10s×10次)，4℃ 15,000rpm离心20min；上清与预先用裂解缓冲液平衡的Glutathione Sepharose 4B混匀，4℃反应10min，装柱；用5-10个柱床体积的洗涤缓冲液(1×PBS)洗去杂蛋白；洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，10mM还原型谷胱甘肽，pH8.0)洗脱目的蛋白。用SDS-PAGE鉴定纯化的融合蛋白的分子量约为64.5kD，纯度达90％以上。结果见图1。
图1重组WP486表达纯化的SDS-PAGE图谱；图1说明如下：
V：IPTG诱导的空载质粒菌株；I：IPTG诱导的重组质粒菌株；N：未经IPTG诱导的重组质粒菌株；S：诱导细胞的可溶性蛋白；P：诱导细胞的不可溶性蛋白；E：经Glutathione Sepharose 4B柱纯化所得的目的蛋白
实施例3 重组WP486片段的抗体制备
将实施例2中获得的纯化的重组蛋白用等体积的完全Freund’s佐剂乳化，用0.25-0.5mg/mL乳化过的蛋白对小鼠进行皮下注射，每只0.2mL。2周后用不完全Freund’s佐剂乳化的同样剂量的相同抗原再注射以加强免疫产生抗体，之后每隔7天加强免疫一次，至少进行2次。分析所获抗血清的滴度和特异性。
在阅读了本发明的上述讲述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
1.SEQ ID No.1的信息
1)序列特征
A)长度：1458bp
B)类型：核酸
C)链性：双链
D)拓扑结构：线性
2)分子类型：DNA
3)序列描述：SEQ ID No.1
1 ATGTTCGTCA TAAGCATAGC TACGTCATTG GTGTTATTCT TCTTCCTTCT TTTCGTCTCA
61 ATAACAATTT TAGATGGTGC AAAAACAATC GACTCTCAAC CTTTTAGGAA AAGGAGGAAG
121 AGGAAGAGAT ATCGTACCAG TGAGAGTGGT GACGGCATAG ACGGAGGAAC TGGAACAACA
181 AACGGAGGAG GAGGAGGTGG AGGAGAAGGA GGTGGTGGTG GAACAAATGG AAATGGAACT
241 GGAACAACAA ACGGAGGAGG AGGTGGAGGA GAAGGAGGTG GTGGTGGAAC AAATGGAAAT
301 GGTTCTGGAA CAACAAACGG AGGAGGAGGT GGAGGAGAAG GAGGTGGTGG TGGAACAAAT
361 GGAGGAGGAA ATGGAAATGG AGGAGGAAAT GGAAATGGAA ATGGAAATGG AGGGGATACA
421 GACACAGACG ATTTTGAGCC TACGCCAGCC CTTCTAAAAG AACGTCTACT TAATTCCATA
481 TCTTCAAAAC CTAAAGAATA CTATGAAGCA TTCGTATCTG CAGAGGTAGA AACTGCCTTA
541 CAATTATCTC GAGATGATTC TACCCAAACT ATAATAATTG ATGACGACCA ATTAGAATTG
601 GACGCCTCAG ACACTCTACA AGGAAAACCA AGGGATTATT TGTTCAAGCT CGCAGGTGTT
661 TCATCGGCCT TTTTAGAAGG TACCACTATC CGCAAAGCGG AAGACCGTGC CCGTAATATA
721 AATGAGGAAG AAATTGCACA AACAATATTA AGTCAACTAA GAGAAAAACA CATCAACGAT
781 GAATACGATG GAAAATATGC CACACCCGAG GAAAGAGCTG ATTTTTCCAA TAGTCTTAAT
841 CTTGTTACTA AATACACAAA CCATGAAGTG GGTCTTTTAG TAGGAGAAAC TATTGAAAAG
901 GCTTTCCCTC ATGAGATTGA GTTTGAGAGA TGCATAATTC TAGTAGAGGA TTTTAATAGT
961 GGAACTATTA CTTCAAACAC TATGCAGTAC AGGTCCAACG CTTACAAAAT CAGAGTAGTA
1021 GAAGGATCAA CAACAGATCC AGGGGAAGTT GTCCCTGATG ATTGTTTGGT TTTTGCCGTA
1081 GTAGTAAATA AGGAACAACA TTCTCTAGAA ATATCTGCAA CTAACAGATG CCAAGACATA
1141 TGCTTTGTAA TTATTCCTCG TTTATCCGCA ATAGGAAAAA ATGCTACCAT GGTAATAAGG
1201 AAAGGTGATG AAATTAAACA AGAAACCTAT CTGTTTGTGG CCAATAAGAA TGACACTACT
1261 CATTTTTCAA TCATCACAGA CAAGGATGAA TCTGTTGGAA TAGAATTAAA CATGCTCATT
1321 TTCTCAGAAA GAATTCTCCC CACTTTGAGT GACCCTGCAA CCGTTCCAAG ACCTTTGACT
1381 GACGCCAACG TACTGTCAGC CTACGGAAAG CGCCTAGGTG TTGGTGCCTT TACAGACAAA
1441 AATTTATTGT CCAGCCAA
2.SEQ ID No.2的信息
1)序列特征
A)长度：486个氨基酸
B)类型：氨基酸
C)拓扑结构：线性
2)分子类型：蛋白质
3)序列描述：SEQ ID No.2
1 MFVISIATSL VLFFFLLFVS ITILDGAKTI DSQPFRKRRK RKRYRTSESG DGIDGGTGTT
61 NGGGGGGGEG GGGGTNGNGT GTTNGGGGGG EGGGGGTNGN GSGTTNGGGG GGEGGGGGTN
121 GGGNGNGGGN GNGNGNGGDT DTDDFEPTPA LLKERLLNSI SSKPKEYYEA FVSAEVETAL
181 QLSRDDSTQT IIIDDDQLEL DASDTLQGKP RDYLFKLAGV SSAFLEGTTI RKAEDRARNI
241 NEEEIAQTIL SQLREKHIND EYDGKYATPE ERADFSNSLN LVTKYTNHEV GLLVGETIEK
301 AFPHEIEFER CIILVEDFNS GTITSNTMQY RSNAYKIRVV EGSTTDPGEV VPDDCLVFAV
361 VVNKEQHSLE ISATNRCQDI CFVIIPRLSA IGKNATMVIR KGDEIKQETY LFVANKNDTT
421 HFSIITDKDE SVGIELNMLI FSERILPTLS DPATVPRPLT DANVLSAYGK RLGVGAFTDK
481 NLLSSQ
3.SEQ ID No.3的信息
1)序列特征
A)长度：29bp
B)类型：核酸
C)链性：单链
D)拓扑结构：线性
2)分子类型：寡核苷酸
3)序列描述：SEQ ID No.3
CGTGGATCCGACACAGACGATTTTGAGCC
4.SEQ ID No.4的信息
1)序列特征
A)长度：34bp
B)类型：核酸
C)链性：单链
D)拓扑结构：线性
2)分子类型：寡核苷酸
3)序列描述：SEQ ID No.4
GAGCGGCCGCAGCTAGCTTGGCTGGACAATAAAT