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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610619829.9 (22)申请日 2016.07.29 (71)申请人 江苏泰康生物医药有限公司 地址 225300 江苏省泰州市药城大道1号 G03幢厂房 (72)发明人 严守升 郭斌 谢宁 李虎 (51)Int.Cl. A61K 9/08(2006.01) A61K 38/26(2006.01) A61K 47/12(2006.01) A61K 47/18(2006.01) A61K 47/26(2006.01) A61K 47/02(2006.01) A61P 。
2、3/10(2006.01) (54)发明名称 含有GLP-1 类似物融合蛋白的稳定液体制 剂及其制备 (57)摘要 本发明公开了一种GLP-1类似物融合蛋白的 稳定液体制剂及其制备。 本发明所述制剂包含有 效成分GLP-1 类似物融合蛋白， 药用缓冲剂， 渗 透压调节剂， 保护剂， 表面活性剂和辛酸钠等。 该 制剂可用于治疗糖尿病及其相关病症。 权利要求书1页 说明书9页 CN 107661288 A 2018.02.06 CN 107661288 A 1.一种GLP-1类似物融合蛋白的稳定液体制剂， 所述制剂包含有效成分GLP-1类似物融 合蛋白， 药用缓冲剂， 渗透压调节剂， 保护剂， 表。
3、面活性剂和辛酸钠等： 2.权利要求1所述的稳定液体制剂， pH在5.0-7.4之间， 优选pH在6.0-7.0之间， 更优选 pH在6.4-7.0之间。 3.权利要求1所述的稳定液体制剂， 药用缓冲剂选自柠檬酸/Na2HPO4混合物、 醋酸盐混 合物、 Na2HPO4/NaH2PO4混合物， 优选为柠檬酸/Na2HPO4混合物、 Na2HPO4/NaH2PO4混合物， 优选 浓度为15-50 mol/ml， 再优选浓度为15-40 mol/ml。 4.权利要求3所述的稳定液体制剂， 药用缓冲剂优Na2HPO4/NaH2PO4混合物， 优选浓度为 20-30 mol/ml。 5.权利要求1所述的。
4、稳定液体制剂， 渗透压调节剂选自甘露醇、 海藻糖或木糖醇， 优选 浓度为10-80mg/ml， 再优选浓度为20-60mg/ml。 6.权利要求5所述的稳定液体制剂， 渗透压调节剂优选甘露醇， 优选浓度为30-45mg/ ml。 7.权利要求1所述的稳定液体制剂， 保护剂优选氨基酸， 优选浓度为2-50mg/ml， 再优选 浓度为5-30mg/ml。 8.权利要求7所述的稳定液体制剂， 保护剂优选甘氨酸、 组氨酸或蛋氨酸， 浓度优选10- 15mg/ml。 9.权利要求1所述的稳定液体制剂， 表面活性剂选自聚山梨酯20、 聚山梨酯80、 丙二醇、 二甲基亚砜， 优选浓度为0.1-1.2mg/m。
5、l， 再优选浓度为0.2-1.0mg/ml。 10.权利要求9所述的稳定液体制剂， 表面活性剂优选聚山梨酯80， 优选浓度为0.3- 0.6mg/ml。 11.权利要求1所述的稳定液体制剂， 辛酸钠优选浓度为1-5mg/ml， 再优选浓度为2- 4mg/ml， 更优选浓度为3mg/ml。 12.权利要求1-11任意一项所述的稳定液体制剂的制备方法， 包含以下步骤： GLP-1类 似物融合蛋白原液中加入辛酸钠固体， 45-55保温0.5-1.5h， 加入药用缓冲剂、 渗透压调 节剂、 表面活性剂、 保护剂等， 混合均匀， 过滤除菌， 分装。 13.权利要求1-11任意一项所述的稳定液体制剂， 用。
6、于治疗糖尿病及其相关疾病。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107661288 A 2 含有GLP-1 类似物融合蛋白的稳定液体制剂及其制备 技术领域 0001 本发明涉及一种GLP-1类似物融合蛋白的稳定液体制剂及其制备方法， 该制剂用 于治疗糖尿病及相关的多种疾病的治疗。 背景技术 0002 胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其类似物例如Exendin-4被广泛应用于2型糖尿病的 治疗研究， 但是由于胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其类似物对蛋白酶二肽基肽酶(DPP- IV)的敏感性， 导致其在血浆中的半衰期很短， 从而造成给药频率过高， 给临床应用带来不 便。 目前解决上述问。
7、题的技术手段主要包括缓释微球、 PEG修饰、 脂肪酸链修饰、 白蛋白融合 等， 其中人白蛋白融合技术使用较多， 此技术在保持目的蛋白的生物学活性和治疗功能的 同时， 提高其在体内半衰期。 0003 目前在国内已有多种改造后的GLP-1类似药物上市， 但是改造后的GLP-1制剂生物 学活性下降， 导致临床剂量的大幅增加， 增加潜在的免疫原性风险。 限于注射给药容量问 题， 剂量增大势必导致药物制剂浓度的增高， 高浓度的蛋白制剂在运输和贮存期间容易造 成蛋白质聚体增加。 已有的研究表明， 治疗用蛋白聚体增加， 会增加免疫原性(Anne S.De Grootand David W.Scott,Tre。
8、nds Immunol Vol.28No.11:482-490)。 重组蛋白多聚体会通 过交联B细胞受体， 激活B细胞增生从而启动B细胞和T细胞免疫。 而且， 重组蛋白多聚体也更 容易被抗原递呈细胞(APC)所吞噬， 从而加快驱使树突细胞(dendritic cell,DC)的成熟从 而激发多种免疫反应。 0004 另外蛋白质药物易降解易失活， 不易长期保存。 通常采用冻干粉针剂的方法来保 存蛋白质药物， 以延长保质期。 但是， 冻干粉针剂在使用前必须先溶解， 病人自行使用不方 便， 甚至会出现安全性问题。 针对上述问题， 本发明提供一种GLP-1类似物融合蛋白的稳定 液体制剂及其制备方法。 。
9、发明内容 0005 本发明的目的是提供一种GLP-1类似物融合蛋白的稳定液体制剂及其制备方法。 0006 本发明所述制剂包含有效成分GLP-1类似物融合蛋白， 药用缓冲剂， 渗透压调节 剂， 保护剂， 表面活性剂， 辛酸钠等； 0007 说 明 书 1/9 页 3 CN 107661288 A 3 0008 为了维持GLP-1类似物融合蛋白稳定性和活性， 本发明所述制剂包含药用缓冲剂， 调节pH在5.0-7.4之间， 优选pH在6.0-7.0之间， 更优选pH在6.4-7.0之间。 所述缓冲剂包含 但不仅限于柠檬酸/Na2HPO4混合物、 醋酸盐混合物、 N a2HPO4/NaH2PO4混合物。
10、、 Tris盐酸、 组 氨酸/组氨酸盐酸混合物。 药用缓冲剂的浓度优选为15-50 mol/ml， 再优选为15-40 mol/ ml， 更优选为20-30 mol/ml。 本发明优选药用缓冲剂为柠檬酸/Na2HPO4混合物、 醋酸盐混合 物、 Na2HPO4/NaH2PO4混合物， 再优选为柠檬酸/Na2HPO4混合物、 Na2HPO4/NaH2PO4混合物， 更优 选为Na2HPO4/NaH2PO4混合物。 0009 为了满足GLP-1类似物融合蛋白在治疗时的等渗状态， 本发明所述制剂包含渗透 压调节剂， 渗透压调节剂是生理耐受性化合物， 可赋予制剂合适的张力以阻止穿过细胞膜 的净水流。 。
11、这类化合物包含NaCl， 甘露醇， 蔗糖， 海藻糖和木糖醇等。 渗透压调节剂优选浓度 为10-80mg/ml， 再优选浓度为20-60mg/ml， 更优选浓度为30-45mg/ml。 渗透压调节剂的优选 为甘露醇、 海藻糖或木糖醇， 更优选的渗透压调节剂是甘露醇。 0010 为了防止GLP-1类似物融合蛋白降解， 增加其稳定性， 本制剂加入一些氨基酸作为 保护剂， 所述氨基酸选自但不仅限于甘氨酸、 丝氨酸、 半胱氨酸、 丙氨酸、 苏氨酸、 赖氨酸、 精 氨酸、 脯氨酸、 异亮氨酸、 组氨酸、 蛋氨酸、 亮氨酸、 色氨酸、 谷氨酸和天冬氨酸等。 优选氨基 酸为甘氨酸、 组氨酸、 丙氨酸、 苏氨酸。
12、、 脯氨酸和蛋氨酸， 更优选为甘氨酸、 组氨酸和蛋氨 酸。 保护剂优选浓度为2-50mg/ml， 再优选浓度为5-30mg/ml， 更优选浓度为10-15mg/ml。 0011 为了增加药物制剂的稳定性， 抑制聚体生成， 本药物制剂包含聚山梨酯20、 聚山梨 酯80、 丙二醇、 二甲基亚砜或其它药学上可以接受的表面活性剂中的一种或多种。 表面活性 剂的优选浓度为0.1-1.2mg/ml， 再优选浓度为0.2-1.0mg/ml， 最优选浓度为0.3-0.6mg/ml。 表面活性剂优选为聚山梨酯20和聚山梨酯80， 更优选为聚山梨酯80。 0012 本发明所述药物制剂还包含辛酸钠， 优选浓度为1-。
13、5mg/ml， 再优选浓度为2-4mg/ ml， 更优选浓度为3mg/ml。 0013 本发明的技术人员发现， 对GLP-1类似物融合蛋白进行短暂的热处理有利于制剂 稳定性的提高。 热处理的优选温度为45-55， 时间0.5-1.5小时， 更优选时间为0.5-1小时。 0014 本发明所述制剂的制备方法： 向GLP-1类似物融合蛋白原液中加入辛酸钠固体至 终浓度0.3-6mg/ml， 充分混匀后加热至45-55， 并保温0.5-1.5h。 加热后样品冷却至室温 后加入相应药用缓冲剂、 渗透压调节剂、 表面活性剂、 保护剂等， 混合均匀， 过滤除菌， 分装。 0015 本发明的药物制剂可以通过多。
14、种途径给予病人， 包括但不局限于静脉给药， 肌肉 注射给药， 皮下给药， 腹膜给药， 下呼吸道给药或者口服给药。 0016 本发明药物制剂可治疗多种疾病和病症， 主要用途是治疗糖尿病及其相关疾病。 所述疾病包括： 2型糖尿病、 1型糖尿病、 肥胖、 2型糖尿病患者严重心血管事件和其他严重并 发症等 0017 为了进一步阐明本发明， 提供了下列例子， 这些例子仅仅是为了进一步说明本发 明， 并不意味着作为一种限制。 具体实施例 0018 实施例1不同pH对制剂稳定的影响 0019 1.1pH初步筛选 说 明 书 2/9 页 4 CN 107661288 A 4 0020 各组含5.0mg/ml 。
15、GLP-1类似物融合蛋白、 不同pH的20 mol/ml醋酸/醋酸钠缓冲液 或Tris-HCl缓冲液， pH4.0-10.0， 设置13组， 如表1所示。 各组样品经无菌过滤后分装至无菌 无热源西林瓶中， 加塞轧盖后放置37恒温箱中， 分 别于第15天和第30天取样， 采用10 非还原SDS-PAGE检测样品， 结果详见表2。 0021 表1pH初筛表格 0022 组别 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 pH 4.0 4.4 5.0 5.4 6.0 6.4 7.0 7.4 8.0 8.4 9.0 9.4 10.0 0023 表2不同pH下10非还原SDS-PAGE结果。
16、 0024 0025 结果表明， pH4.4组蛋白全部析出。 其他组进行电泳后发现pH5.0、 pH8.0的样 品聚体明显升高。 在该实验中pH5.4-7.4的缓冲体系中的样品变化相对较少。 0026 1.2pH及缓冲体系筛选 0027 使用不同的缓冲溶液配制150mg/ml GLP-1类似物融合蛋白药物制剂， 详见表3。 各 组经无菌过滤分装至无菌无热源的西林瓶中， 加塞轧盖后37放置15 天， 采用10非还原 SDS-PAGE检测纯度， 结果详见表3。 0028 表3不同缓冲体系及10非还原SDS-PAGE结果 说 明 书 3/9 页 5 CN 107661288 A 5 0029 003。
17、0 结果表明， pH6.4与7.0组相对较好， 且各缓冲对间没有明显差异。 0031 实施例2辛酸钠对于GLP-1类似物融合蛋白稳定性的影响 0032 考察辛酸钠对GLP-1类似物融合蛋白稳定性的影响。 GLP-1类似物融合蛋白置换至 30 mol/ml磷酸盐缓冲液(pH6.5)中， 终浓度25mg/ml， 按表4处理。 处理后样品无菌过滤分装 至无菌无热源的西林瓶中， 加塞轧盖后置于37恒温培养箱中进行加速考察， 于第15天和 第30天取样， 采用10非还原SDS-PAGE方法检测， 结果详见表5。 0033 表4各组样品添加辛酸钠及热处理情况 0034 组别 处理方式 1 未添加辛酸钠并5。
18、0热处理1h 2 添加辛酸钠(0.3mg/ml)并50热处理1h 3 添加辛酸钠(3mg/ml)并50热处理1h 4 添加辛酸钠(6mg/ml)并50热处理1h 5 添加辛酸钠(6mg/ml)并55热处理1h 6 未添加辛酸钠， 未热处理 0035 表5不同热处理下10非还原SDS-PAGE检测结果 说 明 书 4/9 页 6 CN 107661288 A 6 0036 0037 结果发现， 组1和对照组2在热处理过程中均已发生浑浊， 而其余各组在热处理过 程中没有明显变化。 同时通过SDS-PAGE检测结果发现， 未添加辛酸钠组与添加不同浓度辛 酸钠组相比， 纯度明显降低。 0038 实施例。
19、3不同保护剂(氨基酸)对GLP-1类似物融合蛋白稳定性影响 0039 氨基酸有利于抑制蛋白降解及聚体的生成。 本实施例考察了各种氨基酸对GLP-1 类似物融合蛋白稳定性的影响。 各组含GLP-1类似物融合蛋白置换至30 mol/ml磷酸盐缓冲 液(pH6.5)中， 至终浓度5mg/ml， 添加各组氨基酸单组分并适当调节pH至6.5， 种类及浓度详 见表6， 所有组均经过无菌分装至西林瓶， 加塞轧盖后置于37恒温培养箱中进行加速考 察。 分别于第15天和第30天取样， 采用10非还原SDS-PAGE和SEC-HPLC方法检测， 结果详见 表7。 0040 表6不同氨基酸添加浓度 0041 组别 。
20、名称 添加终浓度 1 甘氨酸 25mg/ml 2 丝氨酸 30mg/ml 3 半胱氨酸 36mg/ml 4 丙氨酸 27mg/ml 5 苏氨酸 36mg/ml 6 赖氨酸 45mg/ml 7 精氨酸 55mg/ml 8 脯氨酸 50mg/ml 9 异亮氨酸 33mg/ml 10 组氨酸 31mg/ml 11 蛋氨酸 22mg/ml 12 亮氨酸 13mg/ml 13 色氨酸 4mg/ml 14 谷氨酸 6mg/ml 15 天冬氨酸 2.5mg/ml 0042 表7不同氨基酸缓冲液10SDS-PAGE及SEC-HPLC检测结果 说 明 书 5/9 页 7 CN 107661288 A 7 004。
21、3 0044 综合SDS-PAGE和SEC-HPLC结果分析， 甘氨酸， 组氨酸及蛋氨酸有利于GLP-1类似物 融合蛋白稳定性的提高。 0045 实施例4不同渗透压调节剂对GLP-1类似物融合蛋白稳定性影响 0046 考察不同多元醇、 NaCl等对GLP-1类似物融合蛋白稳定性的影响。 各组含GLP-1类 似物融合蛋白置换至30 mol/ml磷酸盐缓冲液(pH6.5)中， 至终浓度5mg/ml， 添加各组渗透 压调节剂单组分， 种类及浓度详见表8。 各组经无菌过滤分装至西林瓶， 加塞轧盖后， 置于37 恒温培养箱中， 分别于第15天和第30天取样， 采用10非还原SDS-PAGE和SEC-HP。
22、LC方法 检测， 结果详见表9。 0047 表8渗透压调节剂配制浓度 0048 组别 名称 最终浓度 1 NaCl 9mg/ml 2 NaCl 0.9mg/ml 3 甘露醇 55mg/ml 4 甘露醇 5.5mg/ml 5 蔗糖 100mg/ml 6 蔗糖 12mg/ml 7 海藻糖 120mg/ml 8 海藻糖 12mg/ml 9 木糖醇 50mg/ml 说 明 书 6/9 页 8 CN 107661288 A 8 10 木糖醇 5mg/ml 0049 表9不同氨基酸缓冲液10非还原SDS-PAGE及SEC-HPLC检测结果 0050 0051 0052 结果表明， 较好的渗透压调节剂为甘露。
23、醇和海藻糖。 0053 实施例5不同表面活性剂对GLP-1类似物融合蛋白的影响 0054 表面活性剂可抑制蛋白分子间相互作用， 增加蛋白质溶解性。 我们考察了聚山梨 酯80和聚山梨酯20对GLP-1类似物融合蛋白浓度聚体的影响。 0055 各组GLP-1类似物融合蛋白置换至30 mol/ml磷酸盐缓冲液(pH6.5)中， 至浓度 25mg/ml， 加入甘露醇至浓度40mg/ml， 组氨酸浓度5mg/ml。 同时加入5的聚山梨酯80及5 的聚山梨酯20母液分别使其终浓度为0.03mg/ml， 0.25mg/ml及1.6mg/ml。 置于37恒温培 养箱中， 15天和30天取样， 采用SEC-HP。
24、LC方法检测。 结果表明， 聚山梨酯80可以明显抑制 GLP-1类似物融合蛋白聚体生成， 聚山梨酯20没有抑制聚体生成的效果， 结果详见表10。 0056 表10不同聚山梨酯体系条件下37考察SEC纯度 0057 0058 实施例6 GLP-1类似物融合蛋白制剂处方制备方法及处方的筛选 说 明 书 7/9 页 9 CN 107661288 A 9 0059 结合上述若干实验， 将一些辅料组合进行处方长期稳定性实验。 GLP-1类似物融合 蛋白超滤至30 mol/ml的磷酸盐缓冲液中， 按3mg/ml加入辛酸钠固体， 50保温1h。 配制含 30 mol/ml磷酸盐缓冲液的甘氨酸、 组氨酸、 蛋。
25、氨酸、 甘露醇及海藻糖浓配液， 与加热后GLP- 1类似物融合蛋白混合至蛋白浓度为25mg/ml， 再用稀NaOH或稀磷酸调节pH至6.5左右， 处方 详见表11。 各组经无菌过滤分装至无菌无热源的西林瓶中， 加塞轧盖后置于4-8冰箱长期 考察。 取样进行检 测， 检测项目为SEC-HPLC和生物学细胞活性检测， 结果详见表12。 0060 表11不同制剂处方组分 0061 0062 表12各组制剂处方SEC-HPLC及活性检测结果 0063 0064 注： 所有组别活性均与初始样比较。 0065 从实验结果来看， 除组7外， 其余各组SEC-HPLC及活性检测没有明显差异。 0066 实施例。
26、7体外活性研究 0067 利用CHO DG44细胞研究GLP-1类似物融合蛋白的体外活性(所用融合蛋白为实施 说 明 书 8/9 页 10 CN 107661288 A 10 例6制剂处方组别6在4-8放置6个月的样品)， 以albiglutide作为 对照。 主要研究原理为 GLP-1能与细胞膜上的GLP-1receptor结合， 激发细胞膜信号通路使胞内cAMP(环化腺苷酸) 的量上升， 作用于下游元件cAMP response element(CRE)， 从而使其下游的luciferase(荧 光素酶)基因表达， 通过检测luciferase催化其底物产生的荧光强度而到达检测GLP-1类产 品生物活性的目的。 GLP-1类似物融合蛋白和albiglutide的RLU数值分别取平均值， 以浓度 的对数值为横坐标， RLU数值平均值为纵坐标， 通过Origin70分析软件进行四参数拟合， 绘 制量效曲线， 获得EC50值。 结果， aibiglutide的EC50为2.55nmol/L， 而GLP-1类似物融合蛋 白的EC50为0.55nmol/L， 即GLP-1类似物融合蛋白的活性约为aibiglutide的5倍。 说 明 书 9/9 页 11 CN 107661288 A 11 。