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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410378019.X (22)申请日 2014.08.01 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104189294 A (43)申请公布日 2014.12.10 (73)专利权人 南方医科大学珠江医院 地址 510282 广东省广州市工业大道中253 号 (72)发明人 周本杰 唐外姣 姚育法 贺帅 殷锦锦 曾璐 (74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 代理人 刘明星 (51)Int.Cl. A61K 36/884(2006.01) 。
2、A61P 1/16(2006.01) A61P 3/06(2006.01) (56)对比文件 CN 102698206 A,2012.10.03, 周本杰.正交实验优选 “脂必清” 的提取工 艺. 中药材 .2008,第31卷(第2期),第301页. 周本杰.泽泻降脂有效部位提取工艺的筛选 研究. 中国药房 .2006,第17卷(第2期),第104 页. 周本杰.护肝清脂片质量标准研究. 中药 材 .2012,第35卷(第4期),第644页. 审查员 高广宇 (54)发明名称 一种治疗非酒精性脂肪肝病的中药复方制 剂及其制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种治疗非酒精性脂肪肝病 的中药复方制。
3、剂及其制备方法。 它包括以下重量 份的原料药： 泽泻5001500、 山楂5001500、 蒲 黄250750、 荷叶3301000和三七85250。 选 用甘淡之泽泻为君， 泻膀胱经之水湿， 利水泄浊。 辅以健脾开胃、 消食化滞、 活血化痰之山楂为臣。 佐以苦平入肝之荷叶利湿升阳， 蒲黄入血， 走上 彻下， 无所不达， 能行滞破瘀， 行气通经。 再以三 七为使， 活血散瘀， 消肿止痛。 全方相伍， 以奏利 湿化痰， 活血散瘀之功。 本发明能有效改善非酒 精性脂肪肝动物模型的脂质代谢紊乱、 降低胰岛 素抵抗并减轻氧化应激损伤。 经多年临床实践表 明其在改善NAFLD患者血生化指标、 恢复正常体。
4、 重以及脂肪肝等方面具有确切的效疗。 权利要求书1页 说明书9页 附图8页 CN 104189294 B 2018.02.27 CN 104189294 B 1.一种治疗非酒精性脂肪肝病的中药复方制剂， 其特征在于， 由以下重量份的原料药 组成： 泽泻1000份、 山楂1000份、 蒲黄500份、 荷叶667份和三七167份。 2.一种权利要求1所述的治疗非酒精性脂肪肝病的中药复方制剂的制备方法， 其特征 在于， 由以下步骤组成： 按权利要求1所述的中药复方制剂中所需重量份分别称取泽泻、 山 楂、 蒲黄、 荷叶、 三七五味原料药， 三七粉碎成细粉， 其余四味混合后先用48倍量体积分数 60%9。
5、0乙醇水溶液浸提13次， 每次13小时， 再用体积分数40%70乙醇水溶液浸提1 3次， 每次13小时； 合并浸提液， 减压回收乙醇， 并浓缩至浸膏比重为1.11.5， 真空干燥， 得浸膏粉， 再加入三七细粉及辅料， 混匀， 制成颗粒， 干燥， 压制成片， 包薄膜衣， 即得治疗非 酒精性脂肪肝病的中药复方制剂。 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述的辅料为淀粉、 环糊精、 微粉硅 胶、 羟丙基纤维素、 蔗糖、 甜菊素、 聚维酮、 硬脂酸镁和香精中任何一种或多种的混合物。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104189294 B 2 一种治疗非酒精性脂肪肝病的中药复方制。
6、剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于中药领域， 具体涉及一种治疗非酒精性脂肪肝病的中药复方制剂及其 制备方法。 背景技术 0002 正常人每100g肝湿重约含45g脂类， 其中磷脂占50以上， 甘油三酯(TG)占 20， 游离脂肪酸占20， 胆固醇约7， 余为胆固醇酯等。 当肝细胞内脂质蓄积超过肝湿重 的5， 或组织学上每单位面积见1/3以上肝细胞脂变时， 即称为脂肪肝。 临床上常根据饮酒 与否， 将其分为酒精性和非酒精性。 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)， 最早是由Ludwing在1980年提出， 是一种无过量饮酒。
7、史， 以肝实质细胞脂 肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。 现在定义为： 遗传-环境-代谢应激相关性疾 病,包括单纯性脂肪肝以及由其演变的脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)和肝硬化甚至肝细胞癌。 在不同国家中NAFLD的发病率约占1024， 而在肥胖人 群中， 其发病率已高达75。 在我国NAFLD已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病， 其肝纤 维化的发生率高达25， 且约1.58.0的患者可发展为肝硬化， 尤其是肥胖患者NASH 的发病率可上升至5874。 近年来随着人们生活水平的提高和生活方式的改变,特别 是饮食结构的变化和体力活动的减少,。
8、NAFLD的发病率逐年升高， 并且有患病年龄低龄化的 趋势， 已成为全球的公共健康问题。 因此积极防治NAFLD对阻止慢性肝病进展和改善预后有 着十分重要的意义。 0003 目前NAFLD的治疗措施主要分为3类： 控制体重， 缺点在于难以坚持， 且不能完全 控制病情的进展； 药物治疗， 缺点在于大部分替代药物如噻唑烷二酮类、 降脂药等不能有 效的缓解肝组织学炎性病变的情况， 且毒副作用大， 多具有肝毒性； 肝移植手术， 缺点在 于费用高昂， 复发率高。 因此， 寻找一种有效、 安全的非酒精性脂肪肝病的防治用药已经成 为当务之急。 0004 NAFLD的发病机制至今尚未完全明确， 最为接受的理论。
9、是 “二次打击学说” 。 该学说 认为胰岛素抵抗(insulin resistant,IR)导致肝脏的脂肪堆积， 成为NAFLD发病中的首次 打击； 而在此基础上发生的多种脂肪因子(leptin,adiponectin,resintin等)调节游离脂 肪酸(Free fatty acid,FFA)引起的氧化应激(ROS)和脂质过氧化对肝脏的损伤， 成为 NAFLD发病中的第二次打击。 NAFLD的发病机制涉及到多种因素非常复杂， 但是脂肪肝的发 展仍是一个高度整合的过程。 0005 NAFLD在中医古代文献中并没有记载， 根据其症状及临床特点， 可把其归属于祖国 医学的 “积症” 、“胁痛” 。
10、、“痰证” 、“肥气病” 等范畴。 最早记载见于 难经 ：“肝之积， 名曰肥 气” ， 故也称之肥气病， 是指体内肥脂之气过多地蓄积于肝脏；素问痹论 ：“饮食自倍， 肠 胃乃伤” 和吴鞠通 “肝气之郁， 痰瘀阻络” 及 金匮翼积聚统论 ：“积聚之病， 非独痰食气 血， 即风寒外感亦能成之” ， 揭示该病成因与情志、 饮食、 痰湿及瘀血有关。 结合上述理论和 长期临床实践， 可以认为NAFLD的中医病因病机是由于饮食不当、 劳逸失度、 情志失畅等， 引 说 明 书 1/9 页 3 CN 104189294 B 3 起脾运化失权、 肝疏泄失职， 导致水湿内停、 痰浊内生、 气滞血瘀而成。 湿、 痰。
11、、 瘀为其病因病 机的关键， 治则当宜利湿、 化痰、 活血为基本大法。 0006 NAFLD的发病机制涉及到多种因素非常复杂， 因此， 要防治NAFLD就必须多层次多 靶点地对其发生相关因子进行干预， 而这恰恰正是中医药的优势。 中医药有着多靶点、 多途 径、 整体调节等特点， 对NAFLD的治疗具有疗效肯定、 副作用少、 价格低廉等明显的特色和优 势。 发明内容 0007 本发明的目的是针对现有技术中针对NAFLD的治疗没有确切药物的不足， 提供一 种具有预防和治疗非酒精性脂肪肝病， 能有效改善非酒精性脂肪肝患者的脂质代谢紊乱、 降低胰岛素抵抗并减轻氧化应激损伤的治疗非酒精性脂肪肝病的中药复。
12、方制剂及其制备 方法。 0008 本发明的治疗非酒精性脂肪肝病的中药复方制剂， 其特征在于， 包括以下重量份 的原料药： 泽泻5001500、 山楂5001500、 蒲黄250750、 荷叶3301000和三七85250。 0009 所述的治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂， 优选包括以下重量份的原料药： 泽泻 1000、 山楂1000、 蒲黄500、 荷叶667和三七167。 0010 本发明还提供了一种治疗非酒精性脂肪肝病的中药复方制剂的制备方法， 其特征 在于， 包括以下步骤： 0011 按上述中药复方制剂中所需重量份分别称取泽泻、 山楂、 蒲黄、 荷叶、 三七五味原 料药， 三七粉碎成细粉，。
13、 其余四味混合后先用48倍量体积分数6090乙醇水溶液浸 提13次， 每次13小时， 再用体积分数4070乙醇水溶液浸提13次， 每次13小 时； 合并浸提液， 减压回收乙醇， 并浓缩至浸膏比重为1.11.5， 真空干燥， 得浸膏粉， 再加 入三七细粉及辅料， 混匀， 制成颗粒， 干燥， 压制成片， 包薄膜衣， 即得治疗非酒精性脂肪肝 病的中药复方制剂。 0012 本发明的治疗非酒精性脂肪肝病的中药复方制剂其可以添加辅料制成药剂学上 接受的任何剂型， 如颗粒剂、 片剂等。 0013 所述的辅料可以为淀粉、 环糊精、 微粉硅胶、 羟丙基纤维素、 蔗糖、 甜菊素、 聚维酮、 硬脂酸镁和香精中任何一。
14、种或多种的混合。 0014 本发明来源于名老中医、 军委保健医藏堃堂教授的经验方， 由泽泻、 山楂、 蒲黄、 荷 叶、 三七等5味中药组成。 方中选用甘淡之泽泻为君， 泻膀胱经之水湿， 利水泄浊。 辅以健脾 开胃、 消食化滞、 活血化痰之山楂为臣。 佐以苦平入肝之荷叶利湿升阳， 蒲黄入血， 走上彻 下， 无所不达， 能行滞破瘀， 行气通经。 再以三七为使， 活血散瘀， 消肿止痛。 全方相伍， 以奏 利湿化痰， 活血散瘀之功。 0015 本发明能有效改善非酒精性脂肪肝动物模型的脂质代谢紊乱、 降低胰岛素抵抗并 减轻氧化应激损伤。 0016 本发明全方相伍， 以奏利湿化痰， 活血散瘀之功。 经多年。
15、临床实践表明其在改善 NAFLD患者血生化指标、 恢复正常体重以及脂肪肝等方面具有确切的效疗， 深受患者欢迎。 本发明的全方诸药配伍， 疏肝、 健脾、 利湿、 活血， 治疗非酒精性脂肪肝疗效确切、 毒副作用 小。 说 明 书 2/9 页 4 CN 104189294 B 4 附图说明： 0017 图1是药物组干预期间各组大鼠体质量和肝指数变化情况的比较， ap0.05，bP 0.01表示和正常组比较， 统计学上有显著性差异； cp0.05，dp0.01， 表示和模型组比较， 统 计学上有显著性差异。 BW： body weight， 体质量； HI： Hepatic index， 肝指数； 0。
16、018 图2是TG,CHOL,HDLC,和LDLC在各组大鼠血清中的变化， 数据以均值方差的形式 表示， 其中ap0.05， bP0.01， 表示和正常组比较， 统计学上有显著性差异；cp0.05，dp 0.01， 表示和模型组比较， 统计学上有显著性差异。 TG： triglycerides， 甘油三酯； CHOL： cholesterol， 总胆固醇； HDLC： HDL cholesterol， 高密度脂蛋白-胆固醇； LDLC： LDL cholesterol， 低密度脂蛋白-胆固醇； 0019 图3是各组大鼠肝组织匀浆液中TG、 FFA变化情况， 数据以均值方差的形式表示， 其中ap。
17、0.05， bP0.01， 表示和正常组比较， 统计学上有显著性差异；cp0.05，dp0.01， 表示 和模型组比较， 统计学上有显著性差异。 TG： triglycerides， 甘油三酯； FFA： free fatty acids， 游离脂肪酸； 0020 图4是各组大鼠的ALT、 AST的改变， 数据以均值方差的形式表示， 其中ap0.05， bP 0.01表示和正常组比较， 统计学上有显著性差异； cp0.05，dp0.01， 表示和模型组比较， 统 计学上有显著性差异。 ALT： alanine aminotransferase， 谷丙转氨酶； AST： aspartate am。
18、inotransferase， 谷草转氨酶； 0021 图5是各组大鼠血清中SOD、 GSH-PX、 TAOC、 MDA的变化， 数据以均值方差的形式表 示， 其中ap0.05， bP0.01， 表示和正常组比较， 统计学上有显著性差异；cp0.05，dp0.01， 表示和模型组比较统计学上有显著性差异。 MDA： 丙二醛， SOD： 超氧化物歧化酶， TAOC： 总抗 氧化能力， GSH-PX： 谷胱甘肽过氧化物酶； 0022 图6是各组大鼠胰岛素指标的变化情况， 数据以均值方差的形式表示， 其中ap 0.05， bP0.01表示和正常组比较， 统计学上有显著性差异；cp0.05，dp0.0。
19、1， 表示和模型组 比较统计学上有显著性差异。 FINS： fasting plasma insulin， 空腹胰岛素值； HOMA-IR： HOMA insulin resistance， 胰岛素抵抗值； HOMA-IS： HOMA insulin sensitivity， 胰岛素 敏感值； 0023 图7是各组大鼠肝脏形态学观察， A空白组； B模型组； C阳性药物组； D药物组低剂量 组； E药物组中剂量组； F药物组高剂量组； 0024 图8是各组大鼠肝脏HE染色结果(400)， A空白组； B模型组； C阳性药物组； D药物 组低剂量组； E药物组中剂量组； F药物组高剂量组； 00。
20、25 图9是各组大鼠肝脏油红O染色结果(400)， A空白组； B模型组； C阳性药物组D药 物组低剂量组； E药物组中剂量组； F药物组高剂量组； 0026 图10是各组大鼠肝组织中SIRT1mRNA的表达， 数据以均值方差的形式表示， ap 0.05， bp0.01， 表示与正常组比较有统计学差异；cp0.05，dp0.01， 表示与模型组比较有统 计学差异； 0027 图11是各组大鼠肝组织中SIRT1蛋白的表达， 数据以均值方差的形式表示， ap 0.05,bp0.01， 表示与正常组比较有统计学差异； cp0.05,dp0.01， 表示与模型组比较有 统计学差异。 说 明 书 3/9。
21、 页 5 CN 104189294 B 5 具体实施方式： 0028 以下实施例是对本发明的进一步说明， 而不是对本发明的限制。 0029 实施例1： 0030 本实施例的治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂， 包括以下原料药： 泽泻500g、 山楂 500g、 蒲黄250g、 荷叶330g、 三七85g。 0031 按上述重量份分别称取泽泻、 山楂、 蒲黄、 荷叶、 三七五味原料药。 将三七粉碎成细 粉， 其余四味混合后先后用4倍量体积分数60乙醇水溶液和体积分数40乙醇水溶液各 提取1次， 每次3小时， 合并两次的提取液， 减压回收乙醇， 并浓缩至浸膏比重为1.1， 微波真 空干燥， 得浸膏粉， 。
22、加入三七细粉及原料药总质量4倍量的环糊精混匀， 制成颗粒， 干燥， 压 制成500片， 包薄膜衣， 即得治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂。 0032 经实验证明， 本实施例的治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂能有效改善脂质代谢紊 乱、 降低胰岛素抵抗并减轻氧化应激损伤， 对非酒精性脂肪肝和脂肪肝炎有良好的效果。 0033 实施例2 0034 本实施例的治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂， 包括以下原料药： 泽泻600g、 山楂 600g、 蒲黄300g、 荷叶400g和三七100g。 0035 按上述重量份分别称取泽泻、 山楂、 蒲黄、 荷叶、 三七五味原料药。 将三七粉碎成细 粉， 其余四味混合后先后用5倍。
23、量体积分数65乙醇水溶液和体积分数45乙醇水溶液各 提取2次， 每次2小时， 合并提取液， 减压回收乙醇， 并浓缩至浸膏比重为1.2， 微波真空干燥， 得浸膏粉， 加入三七细粉及原料药总质量4倍量的淀粉， 混匀， 制成颗粒， 干燥， 压制成600 片， 包薄膜衣， 即得治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂。 0036 经实验证明， 本实施例的治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂能有效改善脂质代谢紊 乱、 降低胰岛素抵抗并减轻氧化应激损伤， 对非酒精性脂肪肝和脂肪肝炎有良好的效果。 0037 实施例3 0038 本实施例的治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂， 包括以下原料药： 泽泻800g、 山楂 800g、 蒲黄4。
24、00g、 荷叶533g、 三七133g。 0039 按上述重量份分别称取泽泻、 山楂、 蒲黄、 荷叶、 三七五味原料药。 将三七粉碎成细 粉， 其余四味混合后先后用5倍量体积分数75乙醇水溶液和体积分数55乙醇水溶液各 提取2次， 每次2小时， 合并提取液， 减压回收乙醇， 并浓缩至浸膏比重为1.25， 微波真空干 燥， 得浸膏粉， 加入三七细粉及原料药总质量4倍量的甜菊素， 混匀， 制成颗粒， 干燥， 压制成 800片， 包薄膜衣， 即得治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂。 0040 经实验证明， 本实施例的治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂能有效改善脂质代谢紊 乱、 降低胰岛素抵抗并减轻氧化应激损伤，。
25、 对非酒精性脂肪肝和脂肪肝炎有良好的效果。 0041 实施例4 0042 本实施例的治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂， 包括以下原料药： 泽泻1000g、 山楂 1000g、 蒲黄500g、 荷叶677g、 三七167g。 0043 按上述重量份分别称取泽泻、 山楂、 蒲黄、 荷叶、 三七五味原料药。 将三七粉碎成细 粉， 其余四味混合后先后用6倍量体积分数80乙醇水溶液和体积分数60乙醇水溶液各 提取3次， 每次1小时， 合并提取液， 减压回收乙醇， 并浓缩至浸膏比重为1.35， 微波真空干 说 明 书 4/9 页 6 CN 104189294 B 6 燥， 得浸膏粉， 加入三七细粉及原料药总质。
26、量3倍量的环糊精和1倍量的蔗糖， 混匀， 制成颗 粒， 干燥， 压制成1000片， 包薄膜衣， 即得治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂。 0044 经实验证明， 本实施例的治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂能有效改善脂质代谢紊 乱、 降低胰岛素抵抗并减轻氧化应激损伤， 对非酒精性脂肪肝和脂肪肝炎有良好的效果。 0045 实施例5 0046 本实施例的治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂， 包括以下原料药： 泽泻1200g、 山楂 1200g、 蒲黄600g、 荷叶800g、 三七200g。 0047 按上述重量份分别称取泽泻、 山楂、 蒲黄、 荷叶、 三七五味原料药。 将三七粉碎成细 粉， 其余四味混合后先后用7。
27、倍量体积分数85乙醇水溶液和体积分数65乙醇水溶液各 提取2次， 每次2小时， 合并提取液， 减压回收乙醇， 并浓缩至浸膏比重为1.4， 微波真空干燥， 得浸膏粉， 加入三七细粉及原料药总质量3倍量的淀粉和1倍量的蔗糖， 混匀， 制成颗粒， 干 燥， 压制成1200片， 包薄膜衣， 即得治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂。 0048 经实验证明， 本实施例的治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂能有效改善脂质代谢紊 乱、 降低胰岛素抵抗并减轻氧化应激损伤， 对非酒精性脂肪肝和脂肪肝炎有良好的效果。 0049 实施例6 0050 本实施例的治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂， 包括以下原料药： 泽泻1500g、 山楂。
28、 1500g、 蒲黄750g、 荷叶1000g、 三七250g。 0051 按上述重量份分别称取泽泻、 山楂、 蒲黄、 荷叶、 三七五味原料药。 将三七粉碎成细 粉， 其余四味混合后先后用8倍量体积分数90乙醇水溶液和体积分数70乙醇水溶液各 提取3次， 每次2小时， 合并提取液， 减压回收乙醇， 并浓缩至浸膏比重为1.5， 微波真空干燥， 得浸膏粉， 加入三七细粉及原料药总质量5倍量的环糊精， 混匀， 制成颗粒， 干燥， 压制成 1500片， 包薄膜衣， 即得治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂。 0052 经实验证明， 本实施例的治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂能有效改善脂质代谢紊 乱、 降低胰岛素抵。
29、抗并减轻氧化应激损伤， 对非酒精性脂肪肝和脂肪肝炎有良好的效果。 0053 实施例4的治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂的动物实验 0054 1.非酒精性脂肪肝大鼠模型建立 0055 SD雄性大鼠适应性喂养1周后， 按体重分层随机分为6组， 每组10只： 空白组(NC)、 模型组(M)、 非诺贝特组(PC)以及药物组(实施例4的治疗非酒精性脂肪肝的复方制剂)高 (HC)、 中(MC)、 低(LC)三个剂量组。 空白组饲喂普通饲料， 其余各组饲喂高脂饲料， 持续饲养 12周。 0056 2.给药方案 0057 在对各组大鼠施以造模因素的同时， 给予各组大鼠相应的药物干预， 其中空白组 NC及模型组M按。
30、1ml/100g给予蒸馏水灌胃， 空白组给予普通饲料喂养， 模型组给予高脂饲料 喂养； 阳性对照组PC给予0.01g/100g体重非诺贝特混悬液灌胃及给予高脂饲料喂养， 药物 组高(HC)、 中(MC)、 低(LC)剂量组给予相应的混悬液灌胃(高剂量为0.216g/100g体重、 中剂 量为0.108g/100g体重、 低剂量为0.054g/100g体重)并每日给予高脂饲料喂养， 每日一次， 直至12wk结束。 实验期间每周称取各组大鼠体重一次并观察动物进食、 饮水、 行为、 精神状 态、 毛发及二便等情况。 0058 3.样本采集及处理 说 明 书 5/9 页 7 CN 104189294 。
31、B 7 0059 3.1： 血清样本及指标检测： 于实验给药最后一天， 所有大鼠禁止饮食12h， 自由饮 水， 采用10水合氯醛麻醉， 于大鼠的腹主动脉采血， 在4下放置2h， 3000r/min， 离心 15min， 取血清， 按试剂盒所给的方法Olympus AU2700全自动生化分析仪测定CHOL、 TG、 AST 及ALT含量； 按GLU试剂盒所给的方法测定各组大鼠的GLU水平； 按试剂盒说明测定各组大鼠 血清中的SOD、 MDA、 GSH-PX、 TAOC等指标； 广州杰特伟公司实验技术专业人员采用伊艾博公 司大鼠血清胰岛素ELSA试剂盒测定各组大鼠空腹胰岛素值。 0060 3.2肝。
32、组织样本及指标检测： 0061 3.2.1肝组织形态学观察： 肉眼观察病理学观察： 肝脏固定于10的福尔马林 液中,72h后,取出,做常规石蜡包埋,连续切片,切片厚度为4um,分别做HE染色； 另取新鲜肝 脏， 固定取右叶的一小片， 做冰冻切片， 油红O染色观察药物对于肝组织脂肪变性及肝脏炎 症活动的作用情况。 0062 3.2.2肝脏组织匀浆液中脂质的含量测定： 选取肝脏左叶固定部分和生理盐水按 1:9匀浆,即200mg肝脏与生理盐水组成2ml溶液,4,1500r/min,离心15min,取匀浆上清 液,参考各试剂盒所提供方法,Olympus AU2700全自动生化仪测定FFA、 TG含量。。
33、 0063 4.实验结果 0064 4.1.药物组干预期间各组大鼠体质量和肝指数的变化 0065 实验结果如图1所示， 从图1可以看出， 各组大鼠体质量在适应性喂养1wk后无显著 性变化， 12wk后， 各组大鼠体质量有显著性差异(P0.01)， 各组大鼠体质量均呈现增长趋 势， 其中以空白组大鼠体质量增长最快。 相较于空白组， 模型组大鼠的体质量增长趋势明显 缓慢(p0.05)。 在肝指数方面， 模型组(M)明显高于空白组(p0.01)， 低剂量 组(LC)与模型组、 空白组(NC)相比均具有差异(P0.05)， 与模型组有显著性差异(p0.01)。 0066 4.2.药物组对NAFLD模型。
34、大鼠血清CHOL、 TG、 LDLC、 HDLC的调节作用 0067 具体结果如图2所示， 由图2可知， 与正常组相比， 模型组大鼠的CHOL、 TG、 LDLC等指 标显著性升高(P0.01)， HDLD则显著性降低(P0.01)： 而与模型组相比较， 阳性药物组、 药 物组高、 中剂量组的CHOL、 TG、 LDLC等指标则显著性降低(P0.01)。 以上结果说明， 高脂饮食 可造成模型组大鼠体内血脂代谢紊乱， 而非诺贝特组及高、 中剂量药物组可改善高脂饮食 所造成的大鼠体内血脂代谢紊乱， 药物组在上调机体内LDLC指标优于非诺贝特组。 0068 4.3.药物组对肝脏脂质沉积的防治作用 0。
35、069 具体结果如图3所示， 由图3可知， 高脂饮食诱导引发大鼠肝脏脂质蓄积， 与正常组 比较， 模型组大鼠肝组织匀浆液中的甘油三酯TG和游离脂肪酸FFA较空白组显著性升高(P0.05)， 但与空白组有显著性差异(p 0.01)。 药物组中、 高剂量组与非诺贝特组大鼠的肝组织匀浆液中TG和FFA与模型组相比都 有显著性差异(p0.01)。 以上结果说明， 高、 中剂量的药物组和非诺贝特组能明显改善高脂 饮食造成的大鼠肝脏脂质蓄积。 0070 4.4药物组对NAFLD模型大鼠肝功能的保护作用 0071 具体结果如图4所示， 由图4可知， 高脂饲料导致肝脏受损， 与空白组相比， 模型组 大鼠的AS。
36、T、 ALT均显著性升高(P0.01)； 与模型组相比， 阳性药物组和药物组高、 中剂量组 说 明 书 6/9 页 8 CN 104189294 B 8 大鼠的AST、 ALT则显著性降低(P0.01)。 以上结果说明， 药物组及非诺贝特具有保护大鼠肝 脏的作用。 0072 4.5.药物组(实施例4的治疗非酒精性脂肪肝病的中药复方制剂)对NAFLD模型大 鼠氧化应激/脂质过氧化损伤的保护作用 0073 具体结果如图5所示， 由图5可知， 模型组大鼠血清中脂质过氧化产物丙二醛MDA含 量显著升高， 和正常组比较， 有显著性差异(p0.01)； 药物组三个剂量组和阳性药物组的 MDA含量与模型组比。
37、较都有下降(p0.05)， 其中药物组中剂量组与模型组相比则显著性下 降(p0.01)， 经过12WK的饲养之后， 药物组中剂量组和阳性药物组大鼠肝组织匀浆液中的 MDA含量相较于模型组下降了50左右。 高脂饮食导致大鼠体内氧化应激/脂质过氧化损伤 增强， 模型组血清超氧化物歧化酶SOD和总抗氧化能力TAOC活力显著下降， 和正常组比较， 有显著性差异(P0.01,P0.01)； 相反， 此情况在药物组高、 中剂量组和阳性药物组中完全 逆转(p0.01)。 在药物组三个剂量和阳性药物组中， GSH-PX含量显著性高于模型组(P 0.01)以上结果说明， 药物组具有抑制NAFLD大鼠模型肝脏的氧。
38、化应激受损情况。 0074 4.6.药物组对NAFLD模型大鼠胰岛素抵抗的防治作用 0075 具体结果如图6所示， 由图6可知， 与空白组相比较， 模型组大鼠的空腹胰岛素值和 胰岛素抵抗值显著升高， 相反， 模型组大鼠的胰岛素敏感值则显著性下降(P0.01)， 这些数 据说明模型组大鼠已出现胰岛素抵抗的现象。 另一方面， 与模型组相比较， 药物组高、 中、 低 剂量组和阳性药物组大鼠的空腹胰岛素值和胰岛素抵抗值则显著性下降(P0.01 ,P 0.01)， 而胰岛素敏感值则显著性升高(P0.01)。 以上结果说明， 中、 高剂量组的药物组能显 著性防治NAFLD模型大鼠胰岛素抵抗及敏感。 007。
39、6 4.7.形态学指标变化 0077 4.7.1大鼠肝脏大体形态学观察 0078 具体结果如图7所示， 由图7可知， 空白组大鼠的肝脏为暗红色、 表皮光滑、 包膜紧 实(图7-A)； 模型组大鼠肝脏则发黄、 油腻、 包膜紧张(图7-B)。 药物组高、 中、 低剂量组大鼠 肝脏颜色有差异， 低剂量组大鼠肝脏(图7-D)颜色发黄， 但表面光滑， 非诺贝特组(图7-C)及 药物组中(图7-E)、 高剂量(图7-F)给药组大鼠肝脏颜色暗红、 包膜紧实更接近于空白组大 鼠肝脏。 0079 4.7.2各组大鼠肝脏HE染色观察结果(如图8所示) 0080 正常组： 肝小叶结构正常,肝小叶结构清晰， 肝索排列。
40、整齐， 肝细胞以中央静脉为 中心呈放射状排列,无肝细胞肿胀及脂肪性病变,汇管区无炎症细胞浸润,未出现胶原沉积 (图8-A)。 0081 模型组： 肝细胞明显肿胀， 胞质疏松， 气球样变， 胞质内充满了大小不等、 数量不等 的脂滴大空泡以及小空泡， 细胞核边缘化， 细胞膜扩大松散， 汇管区及肝窦出现炎症细胞浸 润(出现单核细胞浸润,中性粒细胞浸润以及淋巴细胞浸润)和散在的点状坏死(图8-B)。 0082 阳性药物组： 肝脏组织结构良好， 肝小叶结构清晰， 肝细胞脂肪变性明显减轻， 但 肝细胞仍然肿胀， 肝细胞内部可见有零星脂滴(图8-C)。 0083 药物组低剂量组： 大鼠肝细胞脂肪变性有减轻的。
41、现象， 但不明显， 在肝细胞内部存 在着1/2的大小不一， 数量不等的脂肪空泡， 肝细胞肿胀， 汇管区及肝窦出现炎症细胞浸润 的现象(图8-D)。 说 明 书 7/9 页 9 CN 104189294 B 9 0084 药物组中剂量组： 大鼠肝细胞脂肪变性明显减轻， 肝细胞内部出现零星脂滴， 汇管 区未见炎症细胞浸润， 汇管区未出现胶原沉积(图8-E)。 0085 药物组高剂量组： 大鼠肝细胞脂肪变性明显减轻； 肝细胞内部出现零星脂滴， 肝细 胞排列紧密， 汇管区未见炎症细胞浸润， 未出现胶原沉积(图8-F)。 0086 4.7.3各组大鼠肝脏HE染色评分结果 0087 表1： 肝组织病理学评。
42、分 0088 0089 根据Kleiner DE41对NAFLD大鼠肝脏HE染色评分指导， 观察各组大鼠肝脏HE染色 结果并根据文献进行评分结果， 具体如表1所示。 0090 4.7.4各组大鼠肝脏油红O染色观察结果(如图9所示) 0091 正常组： 肝细胞无红色脂滴(图9-A)。 0092 模型组： 可见细胞质内散在的多量大小不等的红色微小脂滴彼此被融合成较大脂 滴,占据大部分或整个细胞质,核被压扁,挤靠在细胞边缘(图9-B)。 0093 阳性药物组： 肝细胞间零星红色脂滴(图9-C)。 0094 药物组低剂量组： 肝细胞的细胞质内散在多量的大小不等的红色微小脂滴， 并有 融合成大脂滴的现象。
43、， 但较之模型组， 红色脂滴的区域有所缩小(图9-D)。 0095 药物组中剂量组大鼠肝细胞间有零星脂滴， 相较于非诺贝特组和药物实施例4组 的高剂量组， 红色脂滴少(图9-E)。 0096 药物组高剂量组大鼠肝细胞间有零星的红色脂滴， 较模型组有显著性改善(图9- F)。 0097 4.8机制研究 0098 4.8.1药物组对SIRT1mRNA表达的调控作用 0099 具体结果如图10所示， 由图10可知， 正常组大鼠肝脏SIRT1mRNA(Sirt1(Sirtuin type 1)是依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的组蛋白脱乙酰酶)表达正常， 模型组大鼠 肝脏SIRT1mRNA表达显。
44、著下降， 与正常组比较， 有显著性差异(p0.01)； 相反的， 和模型组比 较， 药物组高、 中剂量组以及非诺贝特组的SIRT1的mRNA的表达量都有显著性升高(p0.01, p0.01,p0.01)， 其中药物组的高、 中剂量SIRT1的mRNA表达比非诺贝特组高。 0100 4.8.2药物组对SIRT1蛋白表达的调控作用 0101 具体结果如图11所示， 从图11可以看出， 与空白组相比较， 模型组大鼠的SIRT1蛋 白的表达显著性下降(p0.01)， 与模型组相比较， 药物组高、 中、 低剂量组的SIRT1蛋白的表 说 明 书 8/9 页 10 CN 104189294 B 10 达显。
45、著性上升(p0.05)， 非诺贝特组及药物组低剂量组大鼠的SIRT1蛋白表达与空白组有显著性差 异(P0.01， P0.01)， 高、 中剂量的药物组大鼠SIRT1蛋白表达优于非诺贝特组及低剂量组 的药物组， 有一定的剂量依赖关系。 0102 实验结果显示本发明的治疗非酒精性脂肪肝病的中药复方制剂能显著延缓病变 大鼠脂质代谢紊乱， 抑制血糖升高， 降低胰岛素抵抗并减轻氧化应激/脂质过氧化损伤， 对 NAFLD模型大鼠有较好的防治作用。 此外， NAFLD模型大鼠SIRT1mRNA和蛋白表达下降， 本发 明的治疗非酒精性脂肪肝病的中药复方制剂在对NAFLD模型大鼠发挥整体药效的同时能够 上调SI。
46、RT1的表达， 提示这可能是本发明的治疗非酒精性脂肪肝病的中药复方制剂防治 NAFLD的可能作用机制之一。 总之， 本发明的治疗非酒精性脂肪肝病的中药复方制剂能够改 善肝功能， 有效治疗非酒精性脂肪肝。 说 明 书 9/9 页 11 CN 104189294 B 11 图1 图2 说 明 书 附 图 1/8 页 12 CN 104189294 B 12 图3 图4 说 明 书 附 图 2/8 页 13 CN 104189294 B 13 图5 图6 说 明 书 附 图 3/8 页 14 CN 104189294 B 14 图7 说 明 书 附 图 4/8 页 15 CN 104189294 B 15 图8 说 明 书 附 图 5/8 页 16 CN 104189294 B 16 图9 说 明 书 附 图 6/8 页 17 CN 104189294 B 17 图10 说 明 书 附 图 7/8 页 18 CN 104189294 B 18 图11 说 明 书 附 图 8/8 页 19 CN 104189294 B 19 。