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1、10申请公布号CN104152416A43申请公布日20141119CN104152416A21申请号201410002656722申请日20140103C12N7/00200601C12N15/85200601A61K39/245200601A61P31/22200601C12Q1/70200601C12Q1/68200601G01N33/569200601C12R1/9320060171申请人中国农业科学院上海兽医研究所地址200241上海市闵行区紫月路518号72发明人童光志童武郑浩刘飞梁超周艳君单同领于海姜一峰高飞74专利代理机构上海序伦律师事务所31276代理人周东萍54发明名称伪狂。
2、犬病毒基因缺失弱毒株及其制备方法和应用57摘要本发明公开了一种伪狂犬病毒基因缺失弱毒株，其缺失的基因序列包括编码伪狂犬病毒GI蛋白第198366位氨基酸的核苷酸序列、以及编码伪狂犬病毒GE蛋白第1404位氨基酸的核苷酸序列。本发明还公开了一种伪狂犬病毒基因缺失弱毒株的制备方法和应用。本发明的伪狂犬病毒基因缺失弱毒株，对伪狂犬病毒有较好的免疫保护效果，适于作为防治伪狂犬病的疫苗候选株。51INTCL权利要求书1页说明书10页序列表10页附图6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书10页序列表10页附图6页10申请公布号CN104152416ACN104152416。
3、A1/1页21一种伪狂犬病毒弱毒株，其特征在于，该弱毒株是伪狂犬病毒的基因缺失弱毒株，其缺失的基因序列包括编码伪狂犬病毒GI蛋白第198366位氨基酸的核苷酸序列、以及编码伪狂犬病毒GE蛋白第1404位氨基酸的核苷酸序列。2根据权利要求1所述的伪狂犬病毒弱毒株，其特征在于，所述弱毒株缺失的基因序列包括伪狂犬病毒GI基因第5941101位碱基的核苷酸序列、以及伪狂犬病毒GE基因第11212位碱基的核苷酸序列。3根据权利要求1所述的伪狂犬病毒弱毒株，其特征在于，所述弱毒株缺失的基因序列为SEQIDNO1所示的核苷酸序列。4一种重组载体，其特征在于，该重组载体包含伪狂犬病毒GI基因和GE基因的部分序。
4、列，其中不包含以下基因序列编码伪狂犬病毒GI蛋白第198366位氨基酸的核苷酸序列、以及编码伪狂犬病毒GE蛋白第1404位氨基酸的核苷酸序列。5一种伪狂犬病毒弱毒株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1构建权利要求4所述重组载体，该重组载体还包含有EGFP荧光标记基因；2提取伪狂犬病毒总DNA，将该总DNA与步骤1的重组载体共转染细胞，获得含EGFP荧光标记的重组伪狂犬病毒；3构建权利要求4所述重组载体，该重组载体不包含EGFP荧光标记基因；4提取步骤2获得的重组伪狂犬病毒的总DNA，将该总DNA与步骤3的重组载体共转染细胞，获得不包含EGFP荧光标记的重组伪狂犬病毒，该重组伪狂犬病毒即为伪狂。
5、犬病毒弱毒株。6一种疫苗组合物，其特征在于，所述组合物包含与佐剂或药用载体混合的权利要求1至3中任一项所述的伪狂犬病毒弱毒株。7根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物适于滴鼻、注射。8权利要求1至3中任一项所述的伪狂犬病毒弱毒株在制备预防或治疗伪狂犬病的疫苗中的应用。9一种区分权利要求1所述伪狂犬病毒弱毒株与野毒株感染的检测试剂盒，其特征在于，包含针对SEQIDNO1所示缺失基因序列设计的引物对。10一种区分权利要求1所述伪狂犬病毒弱毒株与野毒株感染的检测试剂盒，其特征在于，包含伪狂犬病毒GE蛋白抗体。权利要求书CN104152416A1/10页3伪狂犬病毒基因缺失弱毒株及。
6、其制备方法和应用技术领域0001本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种伪狂犬病毒基因缺失弱毒株及其制备方法和应用。背景技术0002伪狂犬病是由伪狂犬病毒（PSEUDORABIESVIRUS，PRV）引起的以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要特征的一种烈性传染病。PRV能感染多种宿主，但猪是该病毒主要的天然宿主、贮存者和传播者。不同年龄段的猪都可感染，主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，哺乳仔猪高死亡率，及种猪不育。PRV属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科，其基因组为线状双链DNA，长约150KB，由长独特区UL、短独特区US及US两侧的重复序列所组成，编码70多种蛋白。病毒粒子由核衣壳、外壳及囊膜三层。
7、组成。核衣壳是由6种衣壳蛋白包裹病毒基因组形成的二十面体结构；外壳介于核衣壳与囊膜层间，由14种蛋白组成；囊膜由15种蛋白镶嵌于双层脂膜组成，其中糖蛋白11种。病毒表面蛋白决定了病毒的细胞嗜性，也是主要的保护性抗原。一些重要的病毒基因，如TK，对病毒毒力存在显著影响，其缺失能使病毒致弱。0003伪狂犬最早发生于美国，我国于上世纪40年代末在猫中首次发现了PRV，60年代初在猪群中也出现了该病毒流行，至今伪狂犬病毒仍在我国广泛流行，严重威胁着我国猪群的健康，并造成了严重经济损失。猪感染PRV后，有的呈隐性感染，但长期携带病毒；出现临床症状的耐过猪也能成为病毒的携带者，成为传染源，这增加了PRV防。
8、治的难度。为了控制PRV，我国猪场自上世纪末开始广泛使用PRV弱毒活疫苗，如PRVBARTHA株活疫苗，猪伪狂犬发病率明显下降。但自2011年以来，许多使用PRV活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪产弱仔、死胎、流产，仔猪出现神经症状及死亡等伪狂犬的临床症状。童武、彭金美等人也分别从发病猪中分离到了PRV野毒株，并通过基因序列分析与抗体中和试验证实了分离的野毒株较疫苗株和经典毒发生了较大的变异。这表明，我国猪场中出现了PRV变异株，而目前使用的商品化疫苗对变异株的保护效果差，导致了我国猪场伪狂犬发病率的抬头。为了有效控制PRV变异株的流行，需要开发更为高效的PRV疫苗。发明内容0004本发明要解决。
9、目前国内出现PRV变异株，而现有商品化PRV疫苗对变异株保护效果差，亟需开发新的PRV疫苗的技术问题，提供一种伪狂犬病毒基因缺失弱毒株，该基因缺失弱毒株对PRV变异株具有较好的免疫保护效果，接种2周龄内仔猪，不出现PRV临床症状，安全性高，适于作为防治伪狂犬病的疫苗候选株。0005此外，还需要提供一种上述伪狂犬病毒基因缺失弱毒株的制备方法和应用。0006为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现0007在本发明的一个方面，提供了一种伪狂犬病毒弱毒株，该弱毒株是伪狂犬病毒的基因缺失弱毒株，其缺失的基因序列包括编码伪狂犬病毒GI蛋白第198366位氨基酸说明书CN104152416A2/10。
10、页4（SEQIDNO2）的核苷酸序列、以及编码伪狂犬病毒GE蛋白第1404位氨基酸（SEQIDNO3）的核苷酸序列。0008优选的，所述弱毒株缺失的基因序列包括伪狂犬病毒GI基因第5941101位碱基的核苷酸序列、以及伪狂犬病毒GE基因第11212位碱基的核苷酸序列。0009更优选的，所述弱毒株缺失的基因序列为SEQIDNO1所示的核苷酸序列。由SEQIDNO1缺失基因序列可知，本发明的伪狂犬病毒弱毒株，包含伪狂犬病毒GI基因的第1至593位碱基和GE基因的第1213至1740位碱基，不含有伪狂犬病毒基因组中GI基因的第594至1101位碱基、GE基因的第1至1212位碱基、以及GI基因和GE。
11、基因之间的103BP连接序列，即不含有伪狂犬病毒基因组中GI基因的第594位碱基至GE基因的1212位碱基间的DNA序列（共计缺失1823BP,如SEQIDNO1所示）。在508BP（第594至1101位碱基）的GI基因缺失序列中，第1个碱基即GI基因第594位的“C”为编码脯氨酸（P）的第三个碱基，其余507个碱基的最后3个碱基是终止密码子。0010在本发明的另一方面，提供了一种重组载体，该重组载体包含伪狂犬病毒GI基因和GE基因的部分序列，其中不包含以下基因序列编码伪狂犬病毒GI蛋白第198366位氨基酸的核苷酸序列、以及编码伪狂犬病毒GE蛋白第1404位氨基酸的核苷酸序列。0011优选的。
12、，所述重组载体还包含CMV启动子控制下的绿色荧光蛋白基因（EGFP基因），用于筛选基因缺失的重组伪狂犬病毒。0012在本发明的另一方面，还提供了一种伪狂犬病毒弱毒株的制备方法，包括以下步骤00131构建上述重组载体，该重组载体还包含有EGFP荧光标记基因；00142提取伪狂犬病毒总DNA，将该总DNA与步骤1的重组载体共转染细胞，获得含EGFP荧光标记的重组伪狂犬病毒；00153构建上述重组载体，该重组载体不包含EGFP荧光标记基因；00164提取步骤2获得的重组伪狂犬病毒的总DNA，将该总DNA与步骤3的重组载体共转染细胞，获得不包含EGFP荧光标记的重组伪狂犬病毒，该重组伪狂犬病毒即为伪狂。
13、犬病毒弱毒株。0017在本发明的另一方面，还提供了一种疫苗组合物，所述组合物包含与佐剂或药用载体混合的伪狂犬病毒弱毒株。0018所述疫苗组合物适于滴鼻、注射接种。0019在本发明的另一方面，还提供了一种上述伪狂犬病毒弱毒株在制备预防或治疗伪狂犬病的疫苗中的应用。0020在本发明的另一方面，还提供了一种区分上述伪狂犬病毒弱毒株与野毒株感染的检测试剂盒，包含针对SEQIDNO1所示缺失基因序列设计的引物对。利用设计合成的引物对，通过PCR扩增反应，能区分鉴别出本发明的伪狂犬病毒基因缺失弱毒株与野毒株。0021在本发明的另一方面，还提供了一种区分上述伪狂犬病毒弱毒株与野毒株感染的检测试剂盒，包含伪狂。
14、犬病毒GE蛋白抗体。通过检测感染猪体的GE抗体，能够区分鉴别出本发明的伪狂犬病毒基因缺失弱毒株与野毒株的感染。0022本发明的伪狂犬病毒基因缺失弱毒株，接种11日龄仔猪，不出现临床症状，安全可靠，能作为有效防治伪狂犬病的疫苗候选株。说明书CN104152416A3/10页5附图说明0023下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。0024图1是本发明实施例1的PBIEGFP质粒构建路线图；0025图2是本发明实施例1改造好的PXEGFPC3质粒NHE和XHO双酶切鉴定结果图；0026图3是本发明实施例1左右重组臂的PCR结果图；0027图4是本发明实施例1的PBIEGFP质粒用SA。
15、C和NHE、NHE和XBA、XBA和XHO分别进行双酶切鉴定结果图；0028图5是本发明实施例1构建的转移载体用不同的转染试剂转染BHK21细胞后24H的荧光显微镜观察结果图；0029图6是本发明实施例2PRVJS2012GI/GEEGFP毒在纯化过程中不同代次在荧光显微镜下的结果图；0030图7是本发明实施例2PRVJS2012GI/GEEGFP毒不同接毒剂量下的蚀斑形态；0031图8是本发明实施例2PRVJS2012GI/GEEGFP毒用GBUP/GBDOWN引物的PCR鉴定结果图；0032图9是本发明实施例2PRVJS2012GI/GEEGFP毒用GEUP/GEDOWN引物的PCR鉴定结。
16、果图；0033图10是本发明实施例2PRVJS2012GI/GEEGFP毒用GIU/GID引物的PCR鉴定结果图；0034图11是本发明实施例2PRVJS2012GI/GEEGFP毒用GEU/GED引物的PCR鉴定结果图；0035图12是本发明实施例2PRVJS2012GI/GEEGFP毒用GIU/GED引物的PCR鉴定结果图；0036图13是本发明实施例3PBIE质粒的构建路线图；0037图14是本发明实施例3PRVJS2012GI/GE毒接种细胞后在荧光及自然光下的病变图；0038图15是本发明实施例3PRVJS2012GI/GE毒用GIU/GED引物的PCR鉴定结果图；0039图16是本。
17、发明实施例4PRVJS2012GI/GE疫苗毒及其亲本毒接种仔猪后体温的变化图；0040图17是本发明实施例4PRVJS2012GI/GE疫苗毒及其亲本毒接种仔猪后的死亡结果统计图。具体实施方式0041下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如精编分子生物学实验指南FM奥斯伯,RE金斯顿,JG塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译北京科学出版社，2004中所述的方法进行。说明书CN104152416A4/10页60042由于现有的猪伪狂犬病毒疫苗不能对目前流行的伪狂犬病毒变异毒株提供较好的免疫保护效果，因此有必要研制PRV新型疫苗。本发明通过将伪狂犬病毒强毒株PRVJS2012的GI。
18、基因及GE基因的部分基因进行缺失，获得毒力致弱的伪狂犬病毒基因缺失疫苗PRVJS2012GI/GE。该疫苗对仔猪具有较好的安全性。有望作为基因工程标记弱毒疫苗应用于对伪狂犬病毒变异株的防治。0043在本发明的下述实施例中，使用的实验材料如下0044病毒和细胞BHK21细胞美国细胞保藏中心ATCC，保藏号为CCL10，VERO细胞中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,保藏号为GN010，伪狂犬病毒JS2012株本实验室保存；发表文章见童武，张青占，郑浩，刘飞，姜一峰，单同领，周艳君，童光志免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定中国动物传染病学报，2013，21317。0045质粒与菌株PEGFP。
19、N1、PEGFPC3和PBLUESCRIPTSK购自上海基音生物技术有限公司；大肠杆菌DH5感受态；购自北京天根。0046其他试剂MEM和DMEN,INVITROGEN公司产品；ASEI、SACI、XHOI、SCAI和T4DNA连接酶,NEB公司产品；FUGENEHD转染试剂，PROMEGA公司产品；DNA片段小量快速回收试剂盒，OMEGA公司；2GCBUFFER，DNTPMIX25MMOL/LEACH，LATAQ，DL15000,DL2000DNAMARKER购自TAKARA；其它化学试剂均是进口或国产分析纯。0047在本发明的实施例中，BHK21细胞的培养方法如下0048BHK21细胞在含。
20、有10FBS的MEM培养基的T25细胞培养瓶中贴壁长满单层后，弃去细胞培养瓶中培养基，并以PBS洗一次，以025的胰酶将细胞消化下，加入新的含有10FBS的MEM培养基，以18的比例分种于细胞瓶或细胞培养板中。0049在本发明的实施例中，VERO细胞的培养方法如下0050VERO细胞在含有10FBS的DMEM培养基的T25细胞培养瓶中贴壁长满单层后，弃去细胞培养瓶中培养基，并以PBS洗一次，以025的胰酶将细胞消化下，加入新的含有10FBS的DMEM培养基，以16的比例分种于细胞瓶或细胞培养板中。0051实施例1PRVJS2012GI/GE基因缺失转移载体PBIEGFP的构建0052通过PCR。
21、方法，扩增出位于PRVJS2012基因组中121632至123031位碱基和124854至126372位碱基的两条片段，用作同源重组的左、右重组臂。同时，通过内切酶酶切，从PEGFPC3质粒中切出CMV启动子EGFP基因片段，从PEGFPN1质粒中切出SV40POLYA信号序列片段，并将左重组臂CMV启动子EGFP基因SV40POLYA信号序列右重组臂依序组装于PBLUESCRIPTSK载体中，获得了重组转移载体PBIEGFP。具体构建过程如下（参见图1）005311引物设计0054根据PRVJS2012株的全基因组序列，用OLIGO60软件设计了2对引物PRELF/PRELR与PRERF/P。
22、RERR见表1，用于来扩增同源重组左臂与右臂，分别在左重组臂的前后两端加SAC和ASE酶切位点，在右重组臂的前端加了ECOR和AFL酶切位点，后端加了XHO酶切位点。左重组臂（PRELF/PRELR）的长度为1416BP，其核苷酸序列如SEQIDNO4所示，右重组臂（PRERF/PRERR）的长度为1543BP，其核苷酸序列如SEQIDNO5所示。说明书CN104152416A5/10页70055表1扩增同源重组臂的引物0056005712PEGFPC3的改造0058为了删除PEGFPC3不需要的酶切位点，利用SCA和SMA酶切PEGFPC3，回收大片段，并以T4DNA连接酶将大片段连接环化，。
23、转化挑菌并提取质粒，将质粒用NHE和XHO双酶切进行鉴定，改造好的质粒因XHO酶切位点被删除，所以只有一条带，未改造的质粒将被切割成39KB和750BP两条带。结果如图2所示，获得了新的质粒PXEGFPC3。在图2中，“M”指DNAMARKERDL2000，“1”指质粒1，“2”指质粒2，“3”指质粒3，“4”指PEGFPC3，“M”指DNAMARKERDL15000。005913同源重组臂扩增0060分别利用PRELF/PRELR与PRERF/PRERR两对引物，以PRVJS2012的全基因组为模板进行PCR操作，反应体系为50L2GCBUFFER25UL；DNTPMIX25MMOL/LEA。
24、CH4UL；上游引物1UL10PMOL/UL；下游引物1UL10PMOL/UL；LATAQ1UL；DDH2O15UL；基因组DNA3UL。反应条件为945MIN；9430S，6930S，722MIN，循环35次；最后于72延伸10MIN。置于1的琼脂糖上电泳，扩增出约1400BP的左重组臂片段和1500BP的右重组臂片段，并回收两条片段（图3）。在图3中，“1”指扩增出的左臂，“2”指阳性对照，“3”指阴性对照，“M”指DNAMARKERDL2000，“4”阴性对照，“5”指阳性对照，“6”指扩增出的右臂。006114PBLACMVEGFP载体的构建0062将回收的左同源重组臂片段以SAC和A。
25、SE双酶切，并回收约1400BP的片段。双酶切体系为（50UL）NEBUFFER25UL,BSA05UL,SAC1UL,ASE1UL,DNA片段2UG，加DDH2O至50UL。37酶切过夜。0063将PXEGFPC3用ASE和XBA双酶切后回收1300BP左右的片段。双酶切体系为（50UL）NEBUFFER25UL,BSA05UL,ASE1UL,XBA1UL,PXEGFPC32UG,加DDH2O至50UL。置于37酶切过夜。0064将PBLUESCRIPTSK以SAC和XBA双酶切后回收2900BP左右的片段。双酶切体系为（50UL）NEBUFFER45UL,BSA05UL,SAC1UL,XB。
26、A1UL,PBLUESCRIPTSK2UG,加DDH2O至50UL。37酶切过夜。0065将以上三个回收片段用T4DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌DH5感受态，经过质粒提取、PCR鉴定和测序分析筛选出阳性重组质粒，并将其命名为PBLACMVEGFP。006615PBSV40RA的构建0067将回收的右同源重组臂片段用ECOR和XHO双酶切后，回收1500BP的片段。双酶切体系为（50UL）NEBUFFER45UL,BSA05UL,ECOR1UL,XHO1UL,DNA片段2UG，加DDH2O至50UL。37酶切过夜。说明书CN104152416A6/10页80068将PBLUESCRIPTSK以。
27、ECOR和XHO双酶切后，回收2900BP左右的片段。双酶切体系为（50UL）NEBUFFER45UL,BSA05UL,ECOR1UL,XHO1UL,PBLUESCRIPTSK2UG,加DDH2O至50UL。置于37，过夜。0069将以上两步回收的相应片段用T4DNA连接酶连接并转化感受态大肠杆菌DH5，经过质粒提取、PCR鉴定和测序分析筛选出阳性重组质粒，并将其命名为PBRA。0070再将PBRA用AFL和XBA双酶切后,回收4400BP左右的片段。双酶切体系为（50UL）NEBUFFER45UL,BSA05UL,AFL1UL,XBA1UL,PBRA2UG,加DDH2O至50UL。置于37，。
28、过夜。0071以AFL和XBA双酶切PEGFPN1，并回收220BP左右的片段。双酶切体系为（50UL）NEBUFFER45UL,BSA05UL,AFL1UL,XBA1UL,PEGFPN12UG,加DDH2O至50UL。置于37，过夜。0072将上述AFL和XBA酶切回收的两片段以T4DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌DH5感受态，经过质粒提取、PCR鉴定和测序分析筛选出阳性重组质粒，并将其命名为PBSV40RA。007316PRVJS2012GI/GE基因缺失转移载体的构建0074以XBA和XHO双酶切PBLACMVEGFP，回收5600BP左右的片段；以XBA和XHO双酶切PBSV40RA，。
29、回收1700BP左右的片段。双酶切体系均为（50UL）NEBUFFER45UL,BSA05UL,XHO1UL,XBA1UL,DNA2UG,加DDH2O至50UL。置于37，过夜。0075将5600BP左右的片段和1700BP左右的片段用T4DNA连接酶连接并转化大肠杆菌DH5感受态，经过质粒提取、PCR鉴定和测序分析筛选出阳性重组质粒，将阳性重组质粒用SAC和NHE,NHE和XBA,XBA和XHO分别进行双酶切，结果均与预期相符。阳性重组质粒能被SAC和NHE,切割成54KB和2KB的两条带，能被NHE和XBA,切割成66KB和750BP的两条带，能被XBA和XHO,切割成56KB和18KB的。
30、两条带（见图4）。将该阳性重组质粒命名为PBIEGFP，即为PRVJS2012GI/GE基因缺失转移载体。在图4中，左侧“M”指DNAMARKERDL2000，“14”指PBIEGFP克隆14用SAC和NHE酶切，“58”指PBIEGFP克隆14用NHE和XBA酶切，“1012”指PBIEGFP克隆14用XBA和XHO酶切，右侧“M”指DNAMARKERDL15000。成功构建的PRVJS2012GI/GE基因缺失转移载体中，“左重组臂CMVEGFPSV40右重组臂”的序列如SEQIDNO6所示。007617PBIEGFP标记基因的活性验证0077参照FUGENEHD转染试剂说明书，以FUGE。
31、NEHD将PBIEGFP转染生长于6孔板中的BHK21细胞。转染后24至48小时，在荧光显微镜下观察，结果如图5所示，转染细胞高水平表达GFP。0078实施例2PRVJS2012GI/GEEGFP毒株的构建0079以PRVJS2012感染细胞并提取总DNA，将总DNA与PBIEGFP共转染细胞，获得了重组病毒。经过6轮空斑纯化，获得了GI和GE基因缺失且含EGFP标记的重组病毒JS2012GI/GEEGFP。008021引物设计说明书CN104152416A7/10页90081根据PRVJS2012株的全基因组序列，用OLIGO60软件设计了2对引物GIU/GID与GEU/GED，用于来扩增P。
32、RVJS2012的GI与GE的全长序列。PRV的常用检测引物GBUP/GBDOWN，以及用于区分野毒与疫苗毒的鉴定引物GEUP/GEDOWN由本实验室保存。各引物序列见表2。0082表2PRV检测引物0083008422PRVJS2012基因组的提取0085将PRVJS2012株接种融合单层的BHK21细胞，待7080的细胞都产生病变，弃掉四分之三培养液，用细胞刮将细胞刮下，并将细胞液移入50ML离心管，1500RMP离心5MIN,弃上清，以TNE溶液将沉淀细胞重悬。以酚氯仿法从感染细胞中提取总DNA，并溶于TE中，于30保存备用。008623共转染0087生长于35MM培养皿中的BHK21细。
33、胞，其密度达到7085时，参照说明书，用FUGENEHD转染试剂将22提取的DNA和PBIEGFP共转染至BHK21细胞中。转染后的细胞置于37CO2培养箱中培养，36小时后出现细胞病变，收获上清。008824PRVJS2012GI/GEEGFP的纯化0089将收的病毒经稀释后，接种融合单层的VERO细胞。感染后1H，吸去感染液，在细胞上铺加含1琼脂糖和2FBS的MEM培养基。室温凝固后，将接种细胞移入CO2培养箱中培养。60H后，将接种细胞置于荧光显微镜下观察，标记并挑取旁边有细胞表达绿色荧光的空斑，置于DMEM中。将经冻融的空斑液接种VERO细胞，进行空斑纯化，并挑取有绿色荧光表达的空斑进。
34、行下一轮纯化。经过6轮空斑纯化，获得的病毒接种VERO细胞，产生的空斑均表达EGFP（见图6，图7）。这表明，获得了纯的重组病毒PRVJS2012GI/GEEGFP。009025PRVJS2012GI/GEEGFP的PCR鉴定0091用DNA提取试剂盒提取PRVJS2012GI/GEEGFP的DNA，用GIU/GID，GEU/GED，GBUP/GBDOWN，GEUP/GEDOWN及GIU/GED五对引物分别进行PCR鉴定。PCR反应体系均为20L2GCBUFFER10UL；DNTPMIX25MMOL/LEACH2UL；上游引物05UL10PMOL/UL；下游引物05UL10PMOL/UL；LA。
35、TAQ05UL；DDH2O45UL；PRVJS2012GI/GEEGFP毒的DNA2UL。引物GIU/GID，GEU/GED及GIU/GED反应条件为94预变性5MIN；94变性说明书CN104152416A8/10页1030S，69退火30S，72延伸25MIN，循环35次；最后于72延伸10MIN。引物GBUP/GBDOWN反应条件为94预变性5MIN；94变性30S，68退火30S，72延伸45S，循环35次；最后于72延伸10MIN。引物GEUP/GEDOWN反应条件为94/5MIN,94/30S，64/30S，72/30S，循环35次；最后于72延伸10MIN。PCR产物以1的琼脂糖。
36、电泳，凝胶成像仪中观察。PCR结果显示，PRVJS2012GI/GEEGFP的GBUP/GBDOWN扩增呈阳性（图8）；GEUP/GEDOWN、GIU/GID、GEU/GED的扩增均呈阴性（图9，图10，图11）；GIU/GED虽从PRVJS2012GI/GEEGFP扩增出条带，但小于亲本毒PRVJS2012的（图12）。这些结果表明，重组病毒PRVJS2012GI/GEEGFP扩增不出GI和GE基因片段，成功实现了GI/GE基因的缺失。在图812中“M”指DNAMARKERDL2000，“1”指PRVJS2012GI/GEEGFP蚀斑克隆1，“2”指PRVJS2012GI/GEEGFP蚀斑克。
37、隆2，“3”指PRVJS2012，“4”指阴性对照，图12中后面的“M”指DNAMARKERDL15000。0092实施例3PRVJS2012GI/GEEGFP病毒标记基因的删除0093参照实施例1的思路，将左重组臂的末端ASE酶切位点换成XBA。通过用SAC和XBA酶切连接将左重组臂装至15中构建好的PBRA质粒中形成新的同源重组转移载体PBIE（见图13）。以PRVJS2012GI/GEEGFP感染细胞并提取总DNA，将总DNA与PBIE共转染细胞，获得了重组病毒。经过3轮空斑纯化，获得了不含EGFP标记的重组病毒PRVJS2012GI/GE。009431引物0095由于实验需要将实施例1。
38、中的左重组臂的末端ASE酶切位点换成XBA，因此需重新设计一条下游引物，将ASE酶切位点换成XBA。引物PRELRX序列为5TTCTAGAAACTAGGGTCCACGACGCGCAGGCTG3SEQIDNO20。左重组臂（PRELF/PRELRX）的序列如SEQIDNO7所示。009632转移载体PBIE的构建0097用引物PRELF/PRELRX扩增出新的重组左臂。将该左臂和15中构建好的PBRA质粒分别用SAC和XBA进行双酶切，分别回收各自的大片段，将两片段以T4DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌DH5感受态，经过质粒提取、PCR鉴定和测序分析筛选出阳性重组质粒，并将其命名为PBIE。00。
39、9833PRVJS2012GI/GEEGFP病毒标记基因的删除0099参照22中的方法提取PRVJS2012GI/GEEGFP病毒的全基因组，再参照23的方法将PRVJS2012GI/GEEGFP的全基因组与PBIE共转染至细胞中，通过蚀斑纯化得到不含EGFP绿色荧光标记的重组病毒，如图14所示，在图14中A是在荧光下的照片，B是同一视野在自然光下的照片，通过荧光结果显示PRVJS2012GI/GEEGFP病毒的EGFP标记基因删除成功。并将该重组病毒命名为PRVJS2012GI/GE。010034PRVJS2012GI/GE的PCR鉴定0101由于PRVJS2012GI/GE病毒在PRVJS。
40、2012GI/GEEGFP病毒的基础上删除了CMVEGFPSV40序列（大小约为1500BP），参照25的方法用GIU/GED进行PCR鉴定，PCR结果显示PRVJS2012GI/GE病毒所扩增的片段为1000BP左右，明显小于PRVJS2012GI/GEEGFP病毒所扩增的片段（2500BP左右），与预期结果相符（图15），故PRVJS2012GI/GE毒构建成功。图15中“M”指DNAMARKERDL2000，“1”指PRV说明书CN104152416A109/10页11JS2012GI/GE毒，“2”指PRVJS2012GI/GEEGFP毒，“3”指PRVJS2012毒，“4”指阴性对照。
41、，后面的“M”指DNAMARKERDL15000。010235PRVJS2012GI/GE的滴度测定0103将PRVJS2012GI/GE接种VERO细胞，待80细胞出现CPE时，收获病毒。参照文献（殷震等，动物病毒学，科学出版社，1997）,用96孔组织培养板方法测定PRVJS2012GI/GE的滴度。将PRVJS2012GI/GE用含2FBS的DMEM作10倍系列稀释后，将稀释的病毒接种96孔细胞培养板上的VERO单层细胞。每稀释度接种8孔，设8孔对照以含2FBS的DMEM接种,置375的二氧化碳培养箱中培养，每天观察至接种后第4天，记录出现CPE的孔数，根据REEDMUENCH法计算TC。
42、ID50。结果显示，PRVJS2012GI/GE毒在VERO细胞上的滴度为1055TCID50/ML。0104实施例4PRVJS2012GI/GE对11日龄仔猪的安全性试验0105将重组缺失病毒JS2012GI/GE接种11日龄仔猪，不引致仔猪发病，具有较好的安全性。接种JS2012GI/GE的仔猪只产生PRVGB抗体，而不产生PRVGE抗体，能作为免疫标记疫苗候选株。010641实验仔猪0107实验仔猪购买于浙江省绍兴市嵊州市某规模化养猪场，11日龄健康仔猪，伪狂犬病毒GB和GE抗体均为阴性，且伪狂犬病毒（PRV），蓝耳病病毒PRRSV，猪瘟病毒CSFV以及猪圆环病毒2型PCV2的病原检测均。
43、为阴性。010842动物实验分组与攻毒0109购买的12头仔猪，将其随机分成3组J组、E组和D组。J组5只，编号J1、J2、J3、J4、J5，均滴鼻接种PRVJS2012强毒2毫升（含2105个TCID50）。E组5只，编号E1、E2、E3、E4和E5，均滴鼻接种PRVJS2012GI/GE2毫升毒含2105个TCID50。D组2只，编号D1和D2，均滴鼻接种DMEM2毫升。011043临床症状观察及体温测定0111接种后，每天上午9点左右，去动物房观察实验猪的临床症状，攻毒后前7天每天察临床症状时均对每一头实验猪进行体温测定，每头猪一只固定的体温计。攻毒后第二天开始，J组体温全部升高且都在4。
44、1度以上（图16）。攻毒后第四天，J2、J4和J5猪死亡；J1与J3濒死四肢呈划水状。攻毒后第五天，J1与J3猪死亡。E组与D组猪的体温及临床症状均正常（图17）。攻毒后第十七天，将E组与D组的实验猪剖杀，目检各头猪的脏器。屠宰猪的心、肝、脾、肺、肾和淋巴结均正常，未出现病灶。这表明，JS2012株有较强的毒力，能致11日龄仔猪100死亡，而本发明构建的基因缺失株JS2012GI/GE则呈弱毒特征，失去对11日龄仔猪的致病力。011244采血检测抗体0113采集攻毒前及攻毒后1D、3D、5D、7D以及17D的实验猪血液，并分离血清。用IDEXX的伪狂犬病毒GB、GE抗体检测试剂盒分别对所有血清。
45、进行检测。结果见下表3和表4，由于J组PRVJS2012接种组攻毒后5D内全死亡，未检测到抗PRVGB和GE的抗体。而E组PRVJS2012GI/GE接种组攻毒后7D开始产生抗PRVGB抗体，17D后均存在GB抗体，但抗PRVGE抗体始终未检出。对照组D组则PRVGB和GE抗体均为阴性。这表明，重组缺失株PRVJS2012GI/GE能诱导接种猪产生抗GB抗体，但由于PRVJS2012GI/说明书CN104152416A1110/10页12GE的GE基因缺失，不能诱导产生抗GE的抗体。这可将JS2012GI/GE研制成一种PRV基因缺失的免疫标记疫苗，用于猪场PRV的防控与根除。0114表3PR。
46、VJS2012GI/GE疫苗毒及其亲本毒接种仔猪后用ELISA检测GB抗体水平变化01150116注表3中，数值06为抗体阳性，06数值07为抗体可疑，数值07抗体为阴性。0117表4PRVJS2012GI/GE疫苗毒及其亲本毒接种仔猪后用ELISA检测GE抗体水平变化01180119注表4中，数值06为抗体阳性，06数值07为抗体可疑，数值07抗体为阴性。0120以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。。
47、因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。说明书CN104152416A121/10页1300010002序列表CN104152416A132/10页140003序列表CN104152416A143/10页150004序列表CN104152416A154/10页160005序列表CN104152416A165/10页170006序列表CN104152416A176/10页180007序列表CN104152416A187/10页190008序列表CN104152416A198/10页200009序列表CN104152416A209/10页210010序列表CN104152416A2110/10页22序列表CN104152416A221/6页23图1图2图3说明书附图CN104152416A232/6页24图4图5说明书附图CN104152416A243/6页25图6图7说明书附图CN104152416A254/6页26图8图9图10图11图12说明书附图CN104152416A265/6页27图13图14说明书附图CN104152416A276/6页28图15图16图17说明书附图CN104152416A28。