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1、10申请公布号CN104152354A43申请公布日20141119CN104152354A21申请号201310178880722申请日20130514C12N1/00200601C12N1/20200601A23L1/218200601A23K1/00200601C12R1/25200601C12R1/245200601C12R1/22520060171申请人仙农生物科技上海有限公司地址201501上海市金山区枫泾镇环东一路65弄13号1406室72发明人陈瑞张继学蔡桐54发明名称一种复合益生菌及其生产工艺和在发酵剂上的应用57摘要本发明提供了一种复合益生菌及其生产工艺和在发酵剂上的应用，。
2、采用耐受力强发酵性能优良的菌种组合并配比，经菌种活化和培养、发酵、分离、真空低温干燥制备益生菌干粉，再经复配包装而成，采用连续真空低温干燥工艺，缩短周期，提高产出率，复合益生菌包括植物乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌，按含量计配比为28161413；应用时每吨蔬菜使用本发酵剂021公斤，发酵温度2030度，35天成熟，比传统做法时间缩短50，腌制菜的得率75以上；本发明制备的多用途益生菌发酵剂可以用于蔬菜发酵和饲料发酵行业，解决农业生产和食品加工过程的中现实问题，同时提高产品质量和生产效率。51INTCL权利要求书2页说明书6页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申。
3、请权利要求书2页说明书6页附图1页10申请公布号CN104152354ACN104152354A1/2页21一种复合益生菌，其特征在于，其采用耐受力强发酵性能优良的菌种组合并配比，经过菌种活化和培养、发酵、分离、真空低温干燥制备益生菌干粉，经过复配包装而成。2根据权利要求1所述的一种复合益生菌，其特征在于，所述的菌种为植物乳杆菌LACTOBACILLUSPLANTARUM发酵乳杆菌LACTOBACILLUSFERMENTUM干酪乳杆菌LACTOBACILLUSCASEI鼠李糖乳杆菌LACTOBACILLUSRHAMNOSUS上述菌种按含量计配比为28161413。3如权利要求1所述的复合益生菌。
4、的生产工艺，其特征在于，具体制备方法如下1活化菌种植物乳杆菌LACTOBACILLUSPLANTARUM、发酵乳杆菌LACTOBACILLUSFERMENTUM、干酪乳杆菌LACTOBACILLUSCASEI、鼠李糖乳杆菌LACTOBACILLUSRHAMNOSUS，菌种按含量计配比为28161413，并冷藏保存；按下述方法分别制备活化菌种将冷冻保藏的菌种接入灭菌的MRS培养基，37恒温培养24小时，确认菌落无杂菌后，重复操作三次即得到活化菌种；2种子培养将步骤1中所得到的活化菌种，接种于培养基中，各菌种按步骤1中所述比例范围配比，在37进行复合培养20小时，得到发酵种子；3发酵培养将培养好的。
5、发酵种子以38的接种量接到培养基中，在3638厌氧环境下培养1828小时，并在发酵后期以流加的方式补充510的培养液和6NAOH中和液，得到发酵液；4离心分离将发酵液利用高速离心机分离，离心转速6000R/MIN，离心时间1015分钟，得到乳酸菌的发酵浓缩物；5乳化和保护剂调配收集上述发酵浓缩物，加入菌种保护剂和乳化剂，其配方为脱脂奶粉10，甘油5，海藻糖5，VC01，氯化钠03，明胶01，吐温801，调节此混合液的固形物含量为3050；6真空低温干燥将步骤5中得到的菌体在连续低温真空机中干燥，干燥温度1535，真空度1001000PA，14小时开始连续出料，得到菌粉其乳酸菌活性0521011。
6、CFU/G；7益生菌发酵剂的复配将步骤6中的菌粉与酶制剂、辅料充分混合；其中菌粉与酶制剂添加质量比为10010。其中使用的酶制剂为蛋白酶，纤维素酶，淀粉酶中的一种或多种混合；辅料配方麦芽糊精、葡萄糖、可溶性淀粉膳食纤维、低聚糖益菌因子、酵母培养物中的一种或是多种；权利要求书CN104152354A2/2页38包装将上述复配后的菌粉，在30万级别净化等级包装车间内，封装环境温度控制在25度以下，相对湿度在20以下，控制水分在5以下，利用四层铝塑复合袋封装，包装铝材为纯金属铝，厚度大于007MM。4根据权利要求2或3所述的复合益生菌的生产工艺，其特征在于，上述步骤2和步骤3中液体培养基为葡萄糖1乳。
7、清粉2牛肉膏1蛋白胨1硫酸镁0025硫酸锰005酵母培养物增菌因子08玉米浆粉3乙酸钠022磷酸氢二钾02；PH68，120灭菌20分钟。5如权利要求1所述的一种复合益生菌，其特征在于，其用于发酵蔬菜和饲料微生态饲料、发酵泡菜或是酸菜，其发酵菜可以为大白菜，芥菜，萝卜，豇豆等。6如权利要求5所述的一种复合益生菌的应用方法，其特征在于，其应用方法为每吨蔬菜使用本发酵剂021公斤，发酵温度2030度，35天成熟；比传统做法时间缩短50，腌制菜的得率75以上，发酵菜口感鲜美，不添加其他任何防腐剂，最终乳酸菌熟达到108次方有很好的长期食用有很好的保健效果，泡菜的保质期延长。7如权利要求5所述的一种复。
8、合益生菌的应用方法，其特征在于，其应用方法为用本发酵剂发酵饲料每吨饲料投入本品021公斤，饲料原料为豆粕、麸皮、玉米蛋白，稻糠等中的一种或多种，含水量5070，发酵周期1015天成熟，发酵饲料具有良好的风味。权利要求书CN104152354A1/6页4一种复合益生菌及其生产工艺和在发酵剂上的应用技术领域0001本发明涉及一种生物制品，尤其涉及一种多用益生菌发酵剂，具体地本发明还提供了此合益生菌的的生产工艺，特别地，本发明还提供了此复合益生菌在发酵剂上的应用，属于生物技术领域。背景技术0002益生菌PROBIOTICS是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体或动物体肠道、生殖系统内，能产生确切。
9、健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称，其中乳酸菌是一类比较常见的，其广泛应用于生物工程、养殖、保健食品以及生物医药领域。益生菌微生态制剂具有巨大的发展潜力和价值。0003近年来由于食品安全事件频发，食品添加剂滥用，抗生素滥用，给食品产业和人民健康都有负面的影响。00042004年WTO、联合国粮农组织FAO和世界动物卫生组织OIE联合召开专题讨论会，讨论了非人用抗生素的使用和抗生素的耐药性问题，欧盟自2006年1月起全面禁止在畜禽饲料中添加抗生素，在生猪等饲养中不得添加抗生素目前已经是国际公认的食品安全标准。人们开始纷纷寻求其它的替代品和替代技术，以保证畜牧业生产。
10、的效率效益不受影响。益生菌发酵饲料技术是新近成长起来的具有许多优点的新型饲料技术，饲料经益生菌发酵后含有更多的活性益生菌菌体、各种酶、各级代谢产物、多种维生素、蛋白质分解产物、活性小肽、氨基酸、抑菌物质、免疫增强因子、促生长因子等，起到促进生长，维持动物肠道的菌群平衡作用；由于不添加抗生素等药物，不会造成抗生素药物残留，益生菌发酵饲料技术是一种生态健康型饲料生产技术。0005益生菌作为一种无公害绿色的产品替代抗生素和一部分添加剂，符合国家发展微生态科技之路。0006然而，虽然益生菌发酵的研究很多，但是商业化的产品较少，多半停留在实验室阶段，如公开号为CN101218964的发明专利提供仅仅为两。
11、种乳酸菌组成的泡菜发酵剂，益生菌可以应用到发酵蔬菜和饲料的发酵剂中。0007目前益生菌发酵工艺都比较复杂，应用于发酵的菌种也比较单一，在应用上也有较大的限制，现有的市场产品及技术主要有以下不足之处00081产品单一含有益生菌种类较少，同时没有加入酶制剂；00092大多为液体，运输保存十分不便，同时容易失去活性而导致发酵失败；00103功能单一有些仅是用于泡菜发酵，而有些只是单纯用到饲料发酵；00114发酵工艺相对复杂，对工艺要求高；00125现有冻干工艺能耗高，导致成本很高，同时采用喷雾干燥菌种活性低，得率低；00136安全性差，尤其在饲料发酵方面大多使用芽孢和酵母类，单纯使用乳酸菌的发酵剂较。
12、少，而芽孢类和酵母类安全性不及乳酸菌，在动物体的定植性能差，益生效果差。0014另外，目前乳酸菌在市场上一般是液体和固体粉末形式，但作为液体形式由于运说明书CN104152354A2/6页5输不方便，同时成活时间短，很容易失去活力，因此功能上也难于保证。粉体菌粉具有保存运输方便，活性也得到保证，目前制备粉末的益生菌工艺分为冻干和喷雾干燥形式。冻干工艺产品得率高，单需要真空下超低温，设备昂贵，同时能耗非常高，导致菌粉的生产成本很高。而喷雾干燥具有工艺简单，设备投资低的优点，但是由于喷雾干燥是在较高温度下进行，而益生菌的最高耐温只有50，因此喷雾干燥工艺得到的产品活性极低，大部分是死菌体。0015。
13、本发明人利用真空连续低温干燥的工艺进行干燥，在保证菌种活力的情况下，能耗大大降低，同时设备投资也下降，这一新工艺对于解决益生菌生产过程的难题提供了良好的解决方案。发明内容0016为了解决现有技术中存在的问题及不足，本发明提供了一种复合益生菌及其生产工艺和在发酵剂上的应用，制备的多用途益生菌发酵剂可以用于蔬菜发酵和饲料发酵行业，解决农业生产和食品加工过程的中现实问题，同时提高产品质量和生产效率。0017本发明采用耐受力强发酵性能优良的菌种组合并配比，经菌种活化和培养、发酵、分离、真空低温干燥制备益生菌干粉，再经复配包装而成，采用复合发酵工艺和连续真空低温干燥，大大节约了能耗，简化了工艺，缩短了周。
14、期，提高了产出率，解决了现有技术中存在的问题。0018本发明的目的之一在于提供一种复合益生菌，成分包括0019植物乳杆菌LACTOBACILLUSPLANTARUM0020发酵乳杆菌LACTOBACILLUSFERMENTUM0021干酪乳杆菌LACTOBACILLUSCASEI0022鼠李糖乳杆菌LACTOBACILLUSRHAMNOSUS0023上述菌种按含量计配比为28161413；0024本发明的目的之二在于提供上述复合益生菌的生产工艺，其具体制备方法如下00251活化菌种0026本发明采用的菌种为0027植物乳杆菌LACTOBACILLUSPLANTARUM0028发酵乳杆菌LACT。
15、OBACILLUSFERMENTUM0029干酪乳杆菌LACTOBACILLUSCASEI0030鼠李糖乳杆菌LACTOBACILLUSRHAMNOSUS0031上述菌种按含量计配比为28161413；0032所述菌种的配比为6211；0033上述菌种冷藏保存；0034按下述方法分别制备活化菌种0035将冷冻保藏的菌种接入灭菌的MRS培养基，37恒温培养24小时，确认菌落无杂菌后，重复操作三次即得到活化菌种。0036上述植物乳杆菌LACTOBACILLUSPLANTARUM，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC1557。说明书CN104152354A3/6页60037上述发。
16、酵乳杆菌LACTOBACILLUSFERMENTUM，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC12133。0038上述干酪乳杆菌LACTOBACILLUSCASEI，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC20983。0039上述鼠李糖乳杆菌LACTOBACILLUSRHAMNOSUS，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC20300。00402种子培养0041将步骤1中所得到的活化菌种，接种于培养基中，各菌种按步骤1中所述比例范围配比，在37进行复合培养20小时，得到发酵种子。00423发酵培养0043将培养好的发酵种子以38的接种量接到培养基中。
17、，在3638厌氧环境下培养1828小时，并在发酵后期以流加的方式补充510的培养液和6NAOH中和液，得到发酵液。0044上述步骤2和步骤3中液体培养基为种子培养基和发酵培养基相同其配比如下0045葡萄糖10046乳清粉20047牛肉膏10048蛋白胨10049硫酸镁00250050硫酸锰0050051酵母培养物增菌因子080052玉米浆粉30053乙酸钠0220054磷酸氢二钾02；PH68，120灭菌20分钟。00554离心分离0056将发酵液利用高速离心机分离，离心转速6000R/MIN，离心时间1015分钟，得到乳酸菌的发酵浓缩物。00575乳化和保护剂调配0058收集上述发酵浓缩物，。
18、加入菌种保护剂和乳化剂，其配方为脱脂奶粉10，甘油5，海藻糖5，VC01，氯化钠03，明胶01，吐温801，调节此混合液的固形物含量为3050。00596真空低温干燥0060将步骤5中得到的菌体在连续低温真空机中干燥，干燥温度1535，真空度1001000PA，14小时开始连续出料，得到菌粉其乳酸菌活性0521011CFU/G。00617益生菌发酵剂的复配0062将步骤6中的菌粉与酶制剂、辅料充分混合。0063其中菌粉与酶制剂添加质量比为10010。0064其中使用的酶制剂为蛋白酶，纤维素酶，淀粉酶中的一种或多种混合。说明书CN104152354A4/6页70065辅料配方麦芽糊精、葡萄糖、可。
19、溶性淀粉膳食纤维、低聚糖益菌因子、酵母培养物中的一种或是多种。00668包装0067将上述复配后的菌粉，在30万级别净化等级包装车间内，封装环境温度控制在25度以下，相对湿度在20以下，控制水分在5以下，利用四层铝塑复合袋封装，包装铝材为纯金属铝，厚度大于007MM。0068本发明的目的之三在于提供制备的复合益生菌在发酵剂上的应用。0069本发明制备的复合益生菌粉作为发酵剂产品可以用于发酵蔬菜和饲料微生态饲料、发酵泡菜或是酸菜，其发酵菜可以为大白菜，芥菜，萝卜，豇豆等等，工艺简单。0070应用方法为每吨蔬菜使用本发酵剂021公斤，发酵温度2030度，35天成熟；比传统做法时间缩短50，腌制菜的。
20、得率75以上，发酵菜口感鲜美，不添加其他任何防腐剂，最终乳酸菌熟达到108次方有很好的长期食用有很好的保健效果，泡菜的保质期延长。0071用本发酵剂发酵饲料每吨饲料投入本品021公斤，饲料原料为豆粕、麸皮、玉米蛋白，稻糠等中的一种或多种，含水量5070，发酵周期1015天成熟，发酵饲料具有良好的风味。0072本发明对制备的复合益生菌进行了应用研究，主要应用于发酵蔬菜、饲料微生态饲料、发酵泡菜或酸菜，大大提高了产品质量和生产效率，解决农业生产和食品加工过程的中安全问题，做到饲养绿色安全，大大提高了食品的源头安全。附图说明0073图1为本发明制备工艺流程图。具体实施方式0074下面结合附图及实施例。
21、对本发明进一步进行说明0075实例一复合益生菌粉的生产00761活化菌种本发明采用的菌种为0077植物乳杆菌LACTOBACILLUSPLANTARUM，保藏编号为CGMCC15570078发酵乳杆菌LACTOBACILLUSFERMENTUM，保藏编号为CGMCC121330079干酪乳杆菌LACTOBACILLUSCASEI，保藏编号为CICC209830080鼠李糖乳杆菌LACTOBACIUUSRHAMNOSUS，保藏编号为CICC203000081上述菌种为采购原料，其所含菌种比例为6211；0082按如下方法分别制备活化菌种0083将冷冻保藏的菌种接入灭菌的MRS培养基，37恒温培养。
22、24小时，确认菌落无杂菌后，重复操作三次即得到活化菌种。0084上述使用的MRS培养基为酪蛋白胨100，牛肉提取物100，酵母提取物50，葡萄糖50，乙酸钠50，柠檬酸二胺20，TWEEN8010，K2HPO420，MGSO47H2O02，MNSO4H2O005，CACO3200，琼脂150，蒸馏水10L，PH68、121下灭菌20分钟。00852种子培养说明书CN104152354A5/6页80086将步骤1中所得到的活化菌种，接种于培养基中，各菌种按步骤1中所述比例范围配比，在37进行复合培养20小时，得到发酵种子。00873发酵液培养0088将培养好的发酵种子以38的接种量接到发酵培养基。
23、中，在3638厌氧环境下培养1828小时，并在发酵后期以流加的方式补充510的培养液和6NAOH中和液，得到发酵液。0089上述步骤2和步骤3中液体培养基为上述步骤2和步骤3中液体培养基为种子培养基和发酵培养基相同其配比如下0090葡萄糖10091乳清粉20092牛肉膏10093蛋白胨10094硫酸镁00250095硫酸锰0050096酵母培养物增菌因子080097玉米浆粉30098乙酸钠0220099磷酸氢二钾02；PH68，120灭菌20分钟。01004离心分离0101将发酵液利用高速离心机分离，离心转速6000R/MIN，离心时间1015分钟，得到乳酸菌的发酵浓缩物。01025乳化和保护。
24、剂调配0103收集上述发酵浓缩物，加入菌种保护剂和乳化剂，其配方为脱脂奶粉10，甘油5，海藻糖5，VC01，氯化钠03，明胶01，吐温801，调节此混合液的固形物含量为3050。01046真空低温干燥0105将步骤5中得到的菌体在连续低温真空机中干燥，干燥温度1535，真空度1001000PA，14小时开始连续出料，得到菌粉其乳酸菌活性121011CFU/G。01067益生菌发酵剂的复配0107将步骤6中的菌粉与酶制剂、辅料充分混合。0108其中菌粉与酶制剂添加质量比为10010。0109其中使用的酶制剂为蛋白酶，纤维素酶，淀粉酶中的一种或多种混合。0110辅料配方麦芽糊精、葡萄糖、可溶性淀粉。
25、膳食纤维、低聚糖益菌因子、酵母培养物中的一种或是多种。01118包装将上述复配后的菌粉，在30万级别净化等级包装车间内，封装环境温度控制在25度以下，相对湿度在20以下，控制水分在5以下，利用四层铝塑复合袋封装，包装铝材为纯金属铝，厚度大于007MM。0112实施例二发酵泡菜0113材料萝卜、豇豆、食盐、蔗糖、辛香料。说明书CN104152354A6/6页901141将1公斤萝卜清洗干净，切块。01152在凉开水中配置4盐水，添加1的蔗糖，搅拌充分溶解。01163将1克益生菌发酵剂加入上述盐水中，充分溶解；01174将萝卜码放到腌制容器，作料一起加入；01185将配制好的菌的盐水注入到腌制容器。
26、中，并使得萝卜完全浸入盐水中；01196密封，在30度条件下发酵3天即可成熟。0120使用本工艺制作泡菜风味香浓、香脆可口，营养丰富。最终PH值为38，经过检测烟硝酸盐含量均在05MG/KG以下，符合食品安全要求。0121上述萝卜也可采用其他蔬菜代替，如包菜、白菜等。0122实施例三发酵东北酸菜01231将收获的蔬菜整理去烂叶，洗净，分切两半或四半，整齐码放到发酵池；01242配制4盐水，搅拌充分溶解；01253将按益生菌发酵剂加入上述盐水中，充分溶解，发酵剂投放量按021公斤/吨比例投放；01264将配制好的菌的盐水注入到腌制容器中，并使得蔬菜完全浸入盐水中；01275启动输送泵，把盐水打回。
27、流，使得腌制池中盐水充分混合；01286盖住发酵池口，在常温下发酵。0129用上述工艺发酵东北酸菜，冬季发酵时间15天成熟，夏季78天成熟，口感酸爽，风味较佳，腌制成功率高，最终PH445，检验其亚硝酸盐均符合国家要求。0130实验四发酵鱼肉多宝鱼及其边角料01311配料罗飞鱼，鱼类下脚料，葡萄糖，食盐；01322将罗非鱼和下脚料放肉绞肉机中搅成肉泥；01333将葡萄糖1和食盐2用少许水溶解，加入上述肉泥中再次搅拌均匀；01344取益生菌发酵剂配置成液体，加入上述肉泥中，充分搅拌混合均匀，其菌种添加量按021KG/吨；01355上述鱼肉泥转入密封容器中，在30发酵23天即可，经过检测益生菌活性在108CFU/G以上。0136上述发酵鱼泥可以与麸皮，玉米粉，豆粕复配并添加水，使得整个水分控制在5060，直接喂养或是再密封发酵23天，经过发酵的饲料改善了适口性，有很好的营养作用，用来代替鱼粉减低了养殖成本。0137实验五发酵蛋白饲料01381配料豆粕玉米粉麸皮其重量比为122；01392将益生菌发酵剂配成液体，按每吨添加05KG/吨，添加到饲料中。01403调整饲料的含水量5060。0141将饲料装入密闭的容器中在2030发酵68天即可成熟。说明书CN104152354A1/1页10图1说明书附图CN104152354A10。