技术领域
本发明涉及三七总皂苷的制备方法。
背景技术
三七具有滋补强壮、止血、活血化瘀和消肿止痛的功效，临床上被广泛应用。三七含有 皂苷、黄酮、氨基酸、多糖、脂肪酸、肽类化合物等成分，其中，达玛烷型四环三萜类皂苷 被认为是三七的主要生理活性成分。对三七中皂苷成分的提取有多种方法，例如冷浸法，渗 漉法，水煎醇沉法等。传统上多用正丁醇萃取的方法，该方法所用正丁醇等有机溶剂，毒性 大、操作繁琐、得率较低、成本高。现今人们多应用大孔树脂法提取三七总皂苷，认为用大 孔树脂法所提取的三七总皂苷与三七中所含皂苷差别较小，且提取率高，同时能除去糖类等 水溶性杂质及大部分脂溶性杂质，降低了提取物的吸潮性等。虽然大孔树脂法提取三七总皂 苷有诸多优点，但仍需进行改进，进一步减少杂质，提高纯度。
发明内容
本发明的目的是为了提供杂质少、纯度高的三七总皂苷的制备方法。
本发明通过下述技术方案予以实施。
三七总皂苷的制备步骤为：
(1)提取：取粉碎的三七，加水浸泡，用酸调pH3～5.5，以每克生药加入5～15U的量 加入纤维素酶，充分搅拌，置30～60℃水浴2～4h，提取液备用；提取后残渣再加水或者加 10％～90％乙醇加热回流提取或超声提取1～3次，合并前后提取液；提取液减压浓缩至药材1～ 3倍量体积，离心或滤过，取澄清液或滤液；
(2)上阴离子交换树脂柱：澄清液或滤液上阴离子交换树脂柱，用40％～70％乙醇洗脱， 收集洗脱液；
(3)上大孔树脂柱：洗脱液上大孔树脂柱，先用水冲洗，再用40～70％乙醇洗脱，收集 乙醇洗脱液；洗脱液减压浓缩成浸膏，干燥，得三七总皂苷。
上述三七总皂苷中三七皂苷R1含量为2％～10％，人参皂苷Re含量为2％～6％，人参皂苷 Rg1含量为15％～40％，人参皂苷Rb1含量为15％～40％，人参皂苷Rd含量为5％～12％，其总皂 苷含量在80％以上。
上述三七总皂苷的制备步骤中的上柱顺序可以调换，即三七总皂苷也可用下述方法获得：
(1)提取：取粉碎的三七，加水浸泡，用酸调pH3～5.5，以每克生药加入5～15U的量 加入纤维素酶，充分搅拌，置30～60℃水浴2～4h，提取液备用；提取后残渣再加水或者加 10％～90％乙醇加热回流提取或超声提取1～3次，合并前后提取液；提取液减压浓缩至药材1～ 3倍量体积，离心或滤过，取澄清液或滤液；
(2)上大孔树脂柱：澄清液或滤液上大孔树脂柱，先用水冲洗，再用40～70％乙醇洗脱， 收集乙醇洗脱液；
(3)上阴离子交换树脂柱：乙醇洗脱液上阴离子交换树脂柱，用40％～70％乙醇洗脱， 收集洗脱液；洗脱液减压浓缩成浸膏，干燥，得三七总皂苷。
上述制备步骤(1)中，提取温度最佳在90℃下，提取液最佳在80℃以下和真空度 0.06Mpa-0.07Mpa条件下减压浓缩。
上述制备步骤(2)、(3)中，阴离子交换树脂最佳为D-941离子交换树脂；上述大孔树 脂为D101、AB-8或ZTC型大孔树脂，最佳为AB-8型大孔树脂。
上述制备步骤(2)、(3)中，上柱速度为上样量每小时0.5～1倍柱体积，洗脱液乙醇的 浓度最佳为45％～60％，离子交换树脂柱的洗脱液用量为药材2～4倍量体积，洗脱流速为每 小时1.5～2.5倍柱体积；大孔树脂柱的水冲洗液用量为药材3～5倍量体积，洗脱流速为每 小时1.5～2.5倍柱体积；大孔树脂柱的乙醇洗脱用量为药材3～5倍量体积，洗脱流速为每 小时0.5～1.5倍柱体积；最后的洗脱液在80℃以下和真空度0.06Mpa-0.07Mpa条件下减压 浓缩至比重为1.13～1.16的浸膏，干燥即得。
由上述方法制得的三七总皂苷可以单独或者与其他活性成分一起，与任何一种或一种以 上药剂学上辅料如淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙二醇、硬脂酸镁、 微粉硅胶、木糖醇、乳糖醇、葡萄糖、甘氨酸、甘露醇、甘氨酸等混合制成的各种剂型，例 如，可制成水针剂、片剂、缓释片、滴丸、颗粒剂、粉针剂、胶囊剂、微粒剂。优选剂型为 片剂、胶囊、注射剂、滴丸等。
上述三七总皂苷含量(以人参皂苷Re计)测定方法如下：
1.仪器与试剂
1.1仪器
紫外可见分光光度计。层析柱。
1.2标准品、供试品及试剂
标准品：人参皂苷Re：中国药品生物制品检定所
供试品：三七总皂苷提取物
试剂：AB-8大孔树脂或G..D.X-101大孔树脂(60～80目，天津化学试剂二厂)
乙醇 分析纯
香草醛溶液 称取5g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100ml。
高氯酸 分析纯
冰乙酸 分析纯
人参皂苷Re标准溶液：精密称取人参皂苷Re标准品0.0100g，用甲醇溶解并定容至10ml， 即每毫升含人参皂苷Re1.0mg。
2.实验
2.1样品处理：取2mg三七总皂苷，用一定量水稀释(稀释至50ml左右)。
2.2柱层析：用10mL注射器作层析管，内装4cm AB-8大孔树脂，先用20mL95％乙醇洗柱，弃 去洗脱液，再用25mL水洗柱，弃去洗脱液。精密加入已处理好的样品溶液(见2.1)，流速 控制在1mL/min左右。先用15mL水洗柱，弃去洗脱液，再用20mL95％乙醇洗脱三七皂苷，收 集洗脱液于蒸发皿中，置于75℃水浴挥干。以此作显色用。
2.3空白样品的制备：在洁净蒸发皿中准确加入0.2mL5％香草醛冰乙酸溶液，转动蒸发皿，使 残渣都溶解，再加0.8mL高氯酸，混匀后移入10mL带塞刻度离心管中；蒸发皿中再加入0.2mL 冰乙酸，转动蒸发皿，使残液溶解，再移入上述离心管中，60℃水浴上加热10min，取出，冰 浴冷却后，准确加入冰乙酸5.0mL，摇匀后，即得空白样品。
2.4显色：在上述已挥干的蒸发皿中准确加入0.2mL5％香草醛冰乙酸溶液，转动蒸发皿，使残 渣都溶解，再加0.8mL高氯酸，混匀后移入10mL带塞刻度离心管中；蒸发皿中再加入0.2mL 冰乙酸，转动蒸发皿，使残液溶解，再移入上述离心管中，60℃水浴上加热10min，取出，冰 浴冷却后，准确加入冰乙酸5.0mL，摇匀后，以1cm比色池于560nm波长处与标准管一起进行 比色测定(以空白样品对紫外可见分光光度计进行回零后，再进行测定)。
2.5标准管：吸取人参皂苷Re标准溶液(1.0mg/mL)0.1mL，用一定量水稀释(10ml左右)，以下 操作从“A2.2柱层析…”起，与样品相同，测定吸光度值。
3计算：
C样＝(A1×C标×100)/(A2×6)
式中：
C样：提取物中三七总苷的量(以人参皂苷Re计)，mg/100mL
A1：被测液的吸光度值，
A2：标准液的吸光度值，
C标：标准液的浓度，mg/mL。
上述三七总皂苷中人参皂苷Re、人参皂苷Rd、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷 Rb1的含量测定方法见中国专利CN1600318A。
本发明采用阴离子交换树脂和大孔树脂进行去杂、纯化，能除去糖类、色素等绝大部分 水溶性杂质及脂溶性杂质，与现有技术相比，杂质更少，纯度更高，质量更加稳定。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述各实施例仅用于说明本发明而并非对本发 明的限制。
实施例一
取三七饮片，粉碎，加生药重量3倍量的水浸泡，用酸调pH4.0，以每克生药加入10U 的量加入纤维素酶，充分搅拌，置40℃水浴3h，提取液备用；提取后残渣再加水在90℃下 回流提取两次，第一次为生药重量7倍量水，第二次为6倍量生药重量水，每次2小时，合 并前后提取液，弃去残渣；提取液在70℃和真空度0.06Mpa-0.07Mpa条件下减压浓缩至药材 1倍量体积，滤过；滤液加水稀释至药材2倍量体积，离心，取澄清液；澄清液以每小时1 倍柱体积的流速上D-941离子交换树脂(山东鲁抗树脂分厂)柱，用药材2.5倍量体积50％ 乙醇洗脱，洗脱流速为每小时2倍柱体积，收集洗脱液；洗脱液以每小时0.5倍柱体积的流 速上AB-8型大孔树脂(天津南开大学树脂厂生产)柱，先用药材4倍量体积的水冲洗，冲洗 流速为每小时2倍柱体积，弃去，再用药材4倍量体积的50％乙醇洗脱，洗脱流速为每小时1 倍柱体积，收集乙醇洗脱液；洗脱液于70℃减压浓缩至比重为1.14的浸膏，减压干燥，得 三七总皂苷。该三七总皂苷含量为83.7％，三七皂苷R1含量为6.8％，人参皂苷Re含量为3.8％， 人参皂苷Rg1含量为34.3％，人参皂苷Rb1含量为30.1％，人参皂苷Rd含量为8.8％。
实施例二
取三七饮片，粉碎，加生药重量3倍量的水浸泡，用酸调pH4.0，以每克生药加入10U 的量加入纤维素酶，充分搅拌，置40℃水浴3h，提取液备用；提取后残渣再加水在90℃下 回流提取两次，第一次为生药重量7倍量水，第二次为6倍量生药重量水，每次2小时，合 并前后提取液，弃去残渣；提取液在70℃和真空度0.06Mpa-0.07Mpa条件下减压浓缩至药材 1.5倍量体积，滤过；滤液加水稀释至药材2倍量体积，离心，取澄清液；澄清液以每小时 0.8倍柱体积的流速上D-941离子交换树脂(山东鲁抗树脂分厂)柱，用药材3倍量体积50％ 乙醇洗脱，洗脱流速为每小时2倍柱体积，收集洗脱液；洗脱液以每小时0.5倍柱体积的流 速上AB-8型大孔树脂(天津南开大学树脂厂生产)柱，先用药材4倍量体积的水冲洗，冲洗 流速为每小时2倍柱体积，弃去，再用药材4倍量体积的50％乙醇洗脱，洗脱流速为每小时1 倍柱体积，收集乙醇洗脱液；洗脱液于70℃减压浓缩至比重为1.15的浸膏，冷冻干燥，得 三七总皂苷。该三七总皂苷含量为85.2％，三七皂苷R1含量为6.9％，人参皂苷Re含量为4.0％， 人参皂苷Rg1含量为34.1％，人参皂苷Rb1含量为31.2％，人参皂苷Rd含量为8.6％。
实施例三
取三七饮片，粉碎，加生药重量3.5倍量的水浸泡，用酸调pH4.5，以每克生药加入12U 的量加入纤维素酶，充分搅拌，置40℃水浴3h，提取液备用；提取后残渣再加75％乙醇在90 ℃下回流提取两次，第一次为生药重量7倍量的75％乙醇，第二次为6倍量75％乙醇，每次2 小时，合并前后提取液，弃去残渣；提取液在70℃和真空度0.06Mpa-0.07Mpa条件下减压浓 缩至药材至药材2倍量体积，滤过；滤液以每小时1倍柱体积的流速上D-941离子交换树脂 (山东鲁抗树脂分厂)柱，用药材3倍量体积60％乙醇洗脱，洗脱流速为每小时2倍柱体积， 收集洗脱液；洗脱液以每小时0.5倍柱体积的流速上D101型大孔树脂(天津南开大学树脂厂 生产)柱，先用药材4倍量体积的水冲洗，冲洗流速为每小时2倍柱体积，弃去，再用药材 4倍量体积的60％乙醇洗脱，洗脱流速为每小时1倍柱体积，收集乙醇洗脱液；洗脱液于70 ℃减压浓缩至比重为1.13的浸膏，喷雾干燥，得三七总皂苷。该三七总皂苷含量为81.5％， 三七皂苷R1含量为6.9％，人参皂苷Re含量为3.4％，人参皂苷Rg1含量为32.2％，人参皂苷 Rb1含量为30.2％，人参皂苷Rd含量为8.7％。
实施例四
取三七饮片，粉碎，加生药重量3.5倍量的水浸泡，用酸调pH4.5，以每克生药加入10U 的量加入纤维素酶，充分搅拌，置40℃水浴3.5h，提取液备用；提取后残渣再加水在90℃ 下超声提取两次，第一次为生药重量7倍量水，第二次为6倍量水，每次30分钟，合并前后 提取液，弃去残渣；提取液在70℃和真空度0.06Mpa-0.07Mpa条件下减压浓缩至药材2倍量 体积，滤过；滤液以每小时1倍柱体积的流速上D-941离子交换树脂(山东鲁抗树脂分厂) 柱，用药材2.5倍量体积55％乙醇洗脱，洗脱流速为每小时2倍柱体积，收集洗脱液；洗脱 液以每小时0.5倍柱体积的流速上ZTC型大孔树脂(天津南开大学树脂厂生产)柱，先用药 材4倍量体积的水冲洗，冲洗流速为每小时2倍柱体积，弃去，再用药材4倍量体积的55％ 乙醇洗脱，洗脱流速为每小时1倍柱体积，收集乙醇洗脱液；洗脱液于70℃减压浓缩至比重 为1.14的浸膏，减压干燥，得三七总皂苷，其三七总皂苷含量为82.9％，三七皂苷R1含量 为6.2％，人参皂苷Re含量为3.1％，人参皂苷Rg1含量为33.4％，人参皂苷Rb1含量为31.2％， 人参皂苷Rd含量为8.9％。
实施例五
取三七饮片，粉碎，加生药重量3.5倍量的水浸泡，用酸调pH4.5，以每克生药加入12U 的量加入纤维素酶，充分搅拌，置40℃水浴3h，提取液备用；提取后残渣再加80％乙醇在90 ℃下回流提取两次，第一次为生药重量7倍量的80％乙醇，第二次为6倍量80％乙醇，每次2 小时，合并前后提取液，弃去残渣；提取液在70℃和真空度0.06Mpa-0.07Mpa条件下减压浓 缩至药材1倍量体积，滤过；滤液加水稀释至药材2倍量体积，离心，取澄清液；澄清液以 每小时0.5倍柱体积的流速上AB-8型大孔树脂(天津南开大学树脂厂生产)柱，先用药材4 倍量体积的水冲洗，冲洗流速为每小时2倍柱体积，弃去，再用药材4倍量体积的50％乙醇 洗脱，洗脱流速为每小时1倍柱体积，收集乙醇洗脱液；洗脱液以每小时1倍柱体积的流速 上D-941离子交换树脂(山东鲁抗树脂分厂)柱，用药材2.5倍量体积50％乙醇洗脱，洗脱 流速为每小时2倍柱体积，收集洗脱液；洗脱液于70℃减压浓缩至比重为1.14的浸膏，减 压干燥，得三七总皂苷。该三七总皂苷含量为82.2％，三七皂苷R1含量为6.4％，人参皂苷 Re含量为3.5％，人参皂苷Rg1含量为35.3％，人参皂苷Rb1含量为30.2％，人参皂苷Rd含量 为8.4％。
实施例六
取三七饮片，粉碎，加生药重量3.5倍量的水浸泡，用酸调pH4.5，以每克生药加入10U 的量加入纤维素酶，充分搅拌，置40℃水浴3.5h，提取液备用；提取后残渣再加水在90℃ 下超声提取两次，第一次为生药重量7倍量水，第二次为6倍量水，每次30分钟，合并前后 提取液，弃去残渣；提取液在70℃和真空度0.06Mpa-0.07Mpa条件下减压浓缩至药材至药材 2倍量体积，滤过；滤液以每小时0.5倍柱体积的流速上D101型大孔树脂(天津南开大学树 脂厂生产)柱，先用药材4倍量体积的水冲洗，冲洗流速为每小时2倍柱体积，弃去，再用 药材4倍量体积的55％乙醇洗脱，洗脱流速为每小时1倍柱体积，收集乙醇洗脱液；洗脱液 以每小时1倍柱体积的流速上D-941离子交换树脂(山东鲁抗树脂分厂)柱，用药材3倍量 体积55％乙醇洗脱，洗脱流速为每小时2倍柱体积，收集洗脱液；洗脱液于70℃减压浓缩至 比重为1.14的浸膏，喷雾干燥，得三七总皂苷。该三七总皂苷含量为81.3％，三七皂苷R1 含量为6.4％，人参皂苷Re含量为3.6％，人参皂苷Rg1含量为31.4％，人参皂苷Rb1含量为 30.5％，人参皂苷Rd含量为8.3％。
实施例七
取实施例一的三七总皂苷20g、低分子右旋糖酐5.5g、依地酸钙钠0.9g和蒸馏水1ml， 上述组分混匀后，冷冻干燥，分装1000支，即得三七总皂苷粉针剂。
实施例八
取实施例二的三七总皂苷20g、与210g微晶纤维素混合均匀，加3％聚维酮乙醇溶液制软 材，过18目筛制颗粒，60℃干燥30～45分钟，整粒，加入24g滑石粉，混匀，充于1000粒 胶囊中，即得三七总皂苷胶囊剂。
实施例九
取实施例三的三七总皂苷20g、预胶化淀粉150g、羧甲基纤维素钠130g、硬脂酸镁20g， 混合均匀，压制成1000片，即得三七总皂苷片剂。