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1、(10)申请公布号 CN 103462967 A (43)申请公布日 2013.12.25 CN 103462967 A *CN103462967A* (21)申请号 201310432672.5 (22)申请日 2013.09.22 A61K 31/352(2006.01) A61P 31/22(2006.01) (71)申请人 南京广康协生物医药技术有限公司 地址 210019 江苏省南京市建邺区奥体大街 69 号新城科技大厦 01 幢 5 层 (72)发明人 江春平 黄蓉 (74)专利代理机构 江苏银创律师事务所 32242 代理人 何震花 (54) 发明名称 Incarviatone 。
2、A在抗疱疹病毒的药物中的应 用 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 Incarviatone A 在 制 备抗疱疹病毒的药物中的应用。经实验证 明， Incarviatone A 对 抗 单 纯 疱 疹 病 毒 1 型 （Herpessimplexvirus， HSV-1）和单纯疱疹病毒 2 型 （Herpessimplexvirus， HSV-2）有显著的抑 制作用， 这提示 Incarviatone A 在治疗疱疹病毒 感染性疾病领域存在潜在的应用价值， 本发明为 Incarviatone A临床用于治疗疱疹病毒感染性疾 病提供实验依据， 对研制抗HSV-1和HSV-2病毒的 药物提供。
3、了一定的指导意义， 具有重要的参考价 值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 103462967 A CN 103462967 A *CN103462967A* 1/1 页 2 1.Incarviatone A在抗疱疹病毒的药物中的应用， 所述化合物Incarviatone A结构如 式 （） 所示 ： 式 （） 。 权 利 要 求 书 CN 103462967 A 2 1/3 页 3 Incarviatone A 在抗疱疹病毒的药物中的应用 技术领域 0。
4、001 本发明涉及 Incarviatone A 在制备抗单纯疱疹病毒 1 型 （Herpes simplex virus， HSV-1） 和单纯疱疹病毒 2 型 （Herpes simplex virus， HSV-2） 药物中的应用。 背景技术 0002 HSV-1、 HSV-2 属于疱疹科病毒， HSV-1 和 HSV-2 不仅引起口唇或生殖粘膜疱疹， 同 时也是引起脑炎、 肝炎、 全身严重感染甚至宫内感染的重要病原 ； 0003 本发明涉及的化合物Incarviatone A是一个2012年发表 （Shen, Y. H. et al., 2012. Incarviatone A, a 。
5、structurally unique natural product hybrid with a new carbon skeleton from Incarvillea delavayi, and its absolute configuration via calculated electronic circular dichroic spectra. RSC Advances 2, 41754180.） 的新骨架化合物， 该化合物拥有全新的骨架类型， 目前没有关于该化合物活性方面的报道， 对于本发明涉及的Incarviatone A在制备治疗疱疹病毒感染药物中的用途属于首次公开， 由于。
6、骨架类型属于全新的骨架类型， 而且其对于疱疹病毒抑制活性强得意想不到， 不存在 由其他化合物给出任何启示的可能， 具备突出的实质性特点， 同时用于疱疹病毒感染的防 治显然具有显著的进步。 发明内容 0004 针对上述现有技术， 本发明提供了 Incarviatone A 在制药中的新用途 ： 0005 Incarviatone A 在制备抗 HSV-1 的药物中的应用。 0006 Incarviatone A 在制备抗 HSV-2 的药物中的应用。 0007 经实验证明， Incarviatone A 对 HSV-1、 HSV-2 有显著的抑制作用 ： 抑制 HSV-1、 HSV-2 在 HE。
7、K293 细胞出现 CPE 效应 （Cytopathic Effect， CPE） ， IC50分别为 2-11.23、 2-11.19， TI 分别为 1031.1、 1002.9。 0008 所述化合物 Incarviatone A 结构如式 （） 所示 ： 0009 说 明 书 CN 103462967 A 3 2/3 页 4 0010 本发明为Incarviatone A临床用于治疗疱疹病毒感染性疾病提供实验依据， 对研 制抗 HSV-1、 HSV-2 病毒的药物提供了一定的指导意义， 具有重要的参考价值。 0011 本发明涉及的 Incarviatone A 在制备治疗疱疹病毒感染药。
8、物中的用途属于首次 公开， 由于骨架类型属于全新的骨架类型， 而且其对于疱疹病毒抑制活性强得意想不到， 不 存在由其他化合物给出任何启示的可能， 具备突出的实质性特点， 同时用于黄疱疹病毒感 染的防治显然具有显著的进步。 0012 为了更好地理解本发明的实质， 下面将结合实施例对本发明作进一步的说明。 具体实施方式 0013 本发明所涉及化合物 Incarviatone A 的制备方法参见文献 （Shen, Y. H. et al., 2012. Incarviatone A, a structurally unique natural product hybrid with a new ca。
9、rbon skeleton from Incarvillea delavayi, and its absolute configuration via calculated electronic circular dichroic spectra. RSC Advances 2, 4175 4180.） 。 0014 以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明， 但本发明的保护范围不受具体实 施例的任何限制， 而是由权利要求加以限定。 0015 实施例 1 ： 本发明所涉及化合物 Incarviatone A 片剂的制备 ： 0016 取20克化合物Incarviatone A， 加入制备片剂的。
10、常规辅料180克， 混匀， 常规压片 机制成 1000 片。 0017 实施例 2 ： 本发明所涉及化合物 Incarviatone A 胶囊剂的制备 ： 0018 取20克化合物Incarviatone A， 加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉180克， 混匀， 装胶囊制成 1000 片。 0019 下面通过药效学实验来进一步说明其药物活性。 0020 实验例 ： Incarviatone A 对疱疹病毒的作用研究 ： 0021 （1） 细胞株与病毒株 ： 0022 人胚肾细胞 （HEK293， 为 HSV-1、 HSV-2 病毒敏感细胞） 购自美国 Clontech 公司 ； 单 纯疱疹病毒 。
11、1 型 （HSV-1） Sm44 株、 单纯疱症病毒 2 型 （HSV-2） 333 株引自中国 CDC 病毒病研 究所。 说 明 书 CN 103462967 A 4 3/3 页 5 0023 （2） 细胞毒性测定 ： 0024 参照文献 （汪受传， 王霖， 陈超等， 清肺口服液含药血清对病毒抑制作用的实验研 究， 南京中医药大学学报， 2008 ； 24（1） ： 2527）的方法， 将各样品以 2 倍比做系列稀释 （20-5） ， 然后按稀释顺序横向接种于 96 板孔中的 HEK293 上， 每孔 100uL， 每稀释度纵向重复 3 孔 （A、 B、 C 行） ， 平行设微孔板 D 的 。
12、16 孔为细胞对照， 712 孔不接种细胞为空白对照， 显 微镜下每日观察 CPE， 连续观察 7d， 中性红染色， 在 540nm 波长测定 OD 值， 将实验组与细胞 对照组OD值相比计算细胞存活率， 用Reed-Muench方法计算药物半数细胞中毒浓度 （TD50） 。 0025 （4） 抑毒试验 ： 0026 参照文献 （汪受传， 王霖， 陈超等， 清肺口服液含药血清对病毒抑制作用的实验研 究， 南京中医药大学学报， 2008 ； 24（1） ： 2527） 的方法， 将样品按稀释顺序 （2-3-14） 横向接 种于 96 板孔中的单层细胞上， 每孔 100 uL， 每稀释度纵向重复 。
13、4 孔， 微孔板的 A、 B、 C 行加 含 100 个 TCID50的病毒 100 uL 作为试验组， D 行补充等容量细胞维持液为不同浓度药物对 照， 平行设 F 行作为病毒对照， E 行的 112 作为细胞对照。37、 5%CO2培养， 每日观察 CPE， 连续观察 4d。病毒对照出现 90% 以上 CPE 时， 加 1% 中性红染色， 用酶标仪在波长 540nm 波 长读取 A 值， 各组 A 值去除病毒对照组 A 值， 将各试验组与细胞对照组 A 值相比， 获得细胞 存活率， 用 Reed-Muench 方法计算半数抑毒浓度 （IC50） ， 最终将 TD50和 IC50相比获得抑毒。
14、指 数 （TI） 。 0027 （5） 结果 ： 0028 样品 TD50的测定 ： 对照组细胞显微镜下观察贴壁生长致密、 形态良好。 Incarviatone A 的 TD50在 HEK293 分别为 2-1.22。 0029 抑毒实验 ： 对照组细胞贴壁致密、 形态良好。镜下观察发现， HSV-1、 HSV-2 病毒 对照组分别在第 3d、 3d 出现 90% 以上的 CPE， HSV 1 和 HSV 2 在 HEK293CPE 则以肿胀、 多细 胞融合 （HSV 1 致多个细胞融和成大泡， 而 HSV 2 致融合为小泡） 、 变圆、 脱落为主要特征。 0030 而抑毒试验各组细胞， 按照。
15、 Incarviatone A 样品稀释梯度， 梯度规律出现 CPE ： HSV 1-HEK293 在第 10 稀释度之前、 HSV 2-HEK293 组在第 9 稀释度之前细胞完全被保护， 之 后出现 CPE， CPE 随样品浓度减少逐渐加重。 0031 将上述实验板用 1% 中性红染色、 用酶标仪测 450nmA 值， 各组 A 值减掉病毒对照组 A 值后， 各实验组 A 值与细胞对照组 A 值相比获得 IC50， IC50与 TD50相比获得 Incarviatone A 的 TI ： 抑制 HSV-1、 HSV-2 在 HEK293 细胞发生 CPE， IC50分别为 2-11.23、 2-11.19， TI 分别为 1031.1、 1002.9。 0032 结论 ： Incarviatone A 具有显著的抗疱疹科病毒 （包括 HSV-1、 HEV-2） 的作用， 而 且安全性高， 因此 Incarviatone A 在治疗疱疹病毒感染疾病中具有广泛的应用背景。 说 明 书 CN 103462967 A 5 。