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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610578359.6 (22)申请日 2016.07.18 (71)申请人 江苏省中医药研究院 地址 210028 江苏省南京市红山路十字街 100号 (72)发明人 朱粉霞 叶霁青 陈家全 翟小婷 贾晓斌 (51)Int.Cl. A61K 31/706(2006.01) A61P 29/00(2006.01) (54)发明名称 异长春花苷内酰胺在制备抗炎药物中的应 用 (57)摘要 本发明属于医药技术领域， 具体为异长春花 苷内酰胺在制备抗炎药物中的用途。 所述的异长 。
2、春花苷内酰胺是从胆木药材中提取分离得到的。 异长春花苷内酰胺能够显著地抑制LPS刺激的 RAW 264.7细胞中炎症因子IL-1和TNF-的生 成， 同时也能抑制IL-1和TNF- mRNA的表达； 抗炎机制研究表明， 异长春花苷内酰胺能够抑制 RAW 264.7细胞中LPS刺激的NF-B和MAPK信号 通路。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 106176794 A 2016.12.07 CN 106176794 A 1.异长春花苷内酰胺在制备抗炎药物中的应用。 . 2.根据权利要求1所述的在制备抗炎药物中的应用， 是通过抑制RAW 264.7细胞中炎症 因子IL-1 和TNF- 。
3、及其mRNA的水平而发挥治疗炎症的作用。 3.根据权利要求2所述治疗炎症的作用， 其作用机制是通过抑制NF- B信号通路中的 p65、 I B 和IKK 的磷酸化以及MAPK信号通路中的ERK、 JNK和p38的磷酸化而治疗炎症的。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106176794 A 2 异长春花苷内酰胺在制备抗炎药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 具体涉及异长春花苷内酰胺在制备抗炎药物中的应 用。 背景技术 0002 胆木(Nauclea officinalis Pierre ex Pitard)， 又名乌檀， 是茜草科植物胆木 的干燥根茎， 主要分布于。
4、我国海南、 广东、 广西等省。 其性味苦、 寒， 具有清热解毒、 消肿止痛 之功效， 民间常用于感冒发热、 肺炎、 肠炎、 痢疾、 湿疹、 皮疹、 脓疡等病的治疗。 文献报道胆 木中主要含有生物碱类成分， 而异长春花苷内酰胺(Strictosamide)是含量最高的生物碱 成分(Fenxia Zhu*， Jiaquan Chen， Hui Wang， et al Journal of Chromatography B， 2015， 1007： 54-66； 胡欣.乌檀化学成分分离分析与相关成分活性、 药动学研究.沈阳药科大 学， 2007； 陈家全， 徐光富， 王慧， 等.UPLC法同时测定胆。
5、木中6种成分的含量.中国药科大学 学报， 2014， 45(4)： 434-437)。 0003 发明人前期利用柱色谱技术结合自动纯化系统制备了异长春花苷内酰胺单体化 合物(朱粉霞， 王静静， 宋捷， 等.胆木的化学成分研究.药学学报， 2013， 48(2)： 276-280)。 异 长春花苷内酰胺在胆木中含量丰富， 易于分离， 其的分子式为C26H30N2O8， 分子量为498.52， CAS登录号为23141-25-5。 0004 目前的专利报道中， 异长春花苷内酰胺主要有以下应用： (1)异长春花苷内酰胺在 制备抗皮肤色素沉着药物中的应用(CN103585167A)， (2)异长春花苷。
6、内酰胺制备治疗咳嗽 和哮喘药物中的用途(CN102600197A)， (3)含有异长春花苷内酰胺等成分的组合制剂在制 备清热解毒、 消肿止痛药物方面的用途(CN102600269A)等； 但目前尚无异长春花苷内酰胺 在抗炎方面应用的报道。 0005 抗炎药物一般是通过调节对炎症具有重要作用的促炎症因子(TNF- 、 IL-1 、 IL-6 等)和炎症介质的水平， 从而发挥其抗炎作用。 关于抗炎机制方面的研究， 文献对很多信号 通路在炎症方面的作用进行了描述(Guha M， Mackman N .LPS induction of gene expression in human monocyte。
7、s.Cell Signal.2001， 13： 85-94)， 其中， 核因子- B(NF- B)与丝裂原激活的蛋白激酶 (MAPK)通路是与炎症相关的两条重要通路。 研究表明， NF- B 主要是通过I B激酶(IKK)介导的I B- 的磷酸化与降解而激活的； 在MAPK信号通路中， ERK、 JNK和p38被认为是抗炎药物作用的重要靶点。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供异长春花苷内酰胺在制备抗炎药物中的医药用途。 0007 本发明的第一方面， 发明人研究了异长春花苷内酰胺对LPS刺激的RAW 264.7细胞 中炎症因子IL-1 和TNF- 的水平以及IL-1 和TNF- mRNA。
8、表达的影响， 从而研究了异长春花 苷内酰胺的抗炎活性。 0008 本发明的第二方面， 发明人研究了异长春花苷内酰胺在LPS刺激的RAW 264.7细胞 说 明 书 1/5 页 3 CN 106176794 A 3 中发挥抗炎作用的分子机制。 异长春花苷内酰胺经LPS刺激的RAW 264.7细胞体外实验， 发 现该化合物可以抑制NF- B信号通路中IKK 、 I B- 和p65的磷酸化； 同时， 也能够抑制MAPK 信号通路中ERK、 JNK和p38的磷酸化。 0009 实验结果表明， 本发明中的化合物异长春花苷内酰胺能够显著地抑制IL-1 和 TNF- 水平及其mRNA的表达， 对炎症有明显的。
9、抑制作用， 因此可以用于制备抗炎药物。 此外， 抗炎机制研究表明， 异长春花苷内酰胺能够抑制LPS刺激的RAW 264.7细胞中的NF- B和 MAPK信号通路。 附图说明 0010 图1是异长春花苷内酰胺的化学结构式； 0011 图2是异长春花苷内酰胺对LPS刺激的RAW 264.7细胞活力的影响； 0012 图3是异长春花苷内酰胺对LPS刺激的RAW 264.7细胞中炎症因子水平的影响， 其 中A是异长春花苷内酰胺对IL-1 水平的影响， B是异长春花苷内酰胺对TNF- 水平的影响； 0013 图4是异长春花苷内酰胺对IL-1 和TNF- mRNA表达的影响， 其中A是异长春花苷内 酰胺对。
10、IL-1 mRNA水平的影响， B是异长春花苷内酰胺对TNF- mRNA水平的影响； 0014 图5是异长春花苷内酰胺对LPS刺激的RAW 264.7细胞中NF- B信号通路的抑制作 用。 其中A是异长春花苷内酰胺对I B磷酸化的的影响， B是异长春花苷内酰胺对p65磷酸化 的影响， C是异长春花苷内酰胺对IKK 磷酸化的影响； 0015 图6是异长春花苷内酰胺对LPS刺激的RAW 264.7细胞中MAPK信号通路的抑制作 用。 其中A是异长春花苷内酰对ERK磷酸化的影响， B是异长春花苷内酰胺对JNK磷酸化的影 响， C是异长春花苷内酰胺对p38磷酸化的影响。 具体实施方式 0015 现结合。
11、实施例和附图， 对本发明作详细描述， 但本发明的实施不仅限于此。 本发明 所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。 0016 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 或按照制造厂商 所建议的条件。 0017 实施例： 异长春花苷内酰胺对LPS刺激的RAW 264.7细胞中炎症具有良好的抑制作 用。 0018 (一)细胞培养 0019 小鼠RAW 264.7巨噬细胞， 购自中科院上海细胞库。 在37， 5CO2条件下， 用含 10HyClone胎牛血清、 100U/mL青霉素及100mg/mL链霉素的DMEM不完全培养基培养， 0.5 胰酶消化传代。 所有操作均为无菌操作。
12、。 0020 (二)细胞活力实验 0021 RAW 264.7细胞接种于96孔板中(4106个/mL)， 每组六个复孔， 每孔含200 L不完 全高糖DMEM培养基。 细胞贴壁后， 用PBS洗涤细胞一遍， 对照组加入不完全高糖培养基， 诱导 组加入含1 g/mL LPS的不完全高糖培养基， 给药组加入25、 50、 100和200 M的异长春花苷内 酰胺溶液和含1 g/mL LPS的不完全高糖培养基， 于37， 5CO2孵育箱中培养24h后， 加20 L 5mg/mL MTT培养4h， 弃去培养液， 用PBS洗涤细胞一遍， 加150 L DMSO， 微波震荡15min， 用 说 明 书 2/5。
13、 页 4 CN 106176794 A 4 酶标仪检测570nm和490nm处的OD值。 细胞活力(OD570-OD490)sanple/(OD570-OD490)control 100。 0022 结果如图1所示， 25、 50、 100和200 M浓度的异长春花苷内酰胺对细胞活性的影响 与对照组和诱导组相比无明显差异(P0.05)； 表明浓度为25200 M异长春花苷内酰胺对 LPS刺激的RAW 264.7细胞没有显著的细胞毒性。 0023 (三)异长春花苷内酰胺对LPS刺激的RAW 264.7细胞中IL-1 产生的影响 0024 本实验通过ELISA试剂盒检测异长春花苷内酰胺对LPS刺激。
14、的RAW 264.7细胞产生 IL-1 的影响。 将RAW 264.7细胞接种于96孔板中(4106个/mL)， 每组六个复孔， 每孔含200 L不完全高糖DMEM培养基。 细胞贴壁后， 用PBS洗涤细胞一遍， 对照组加入不完全高糖培养 基， 诱导组加入含1 g/mL LPS的不完全高糖培养基， 给药组加入25、 50、 100和200 M的异长 春花苷内酰胺溶液和含1 g/mLLPS的不完全高糖培养基， 于37， 5CO2孵育箱中培养24h 后， 吸50 L上清液， 根据ELISA试剂盒(杭州联科生物技术有限公司)的操作说明书进行操 作， 检测IL-1 含量。 0025 结果如图2A所示， 。
15、LPS诱导组的IL-1 水平显著高于空白对照组(P0.001)； 25、 50、 100和200 M异长春花苷内酰胺组的IL-1 水平与诱导组相比， 有显著差异(P0.01)， 25 M水平的异长春花苷内酰胺能够将IL-1 的产量降至15.002.86pg/mL(P0.01)。 上述结 果表明异长春花苷内酰胺显著地且呈剂量依赖性的抑制LPS刺激的RAW 264.7小鼠巨噬细 胞产生IL-1 。 0026 (四)异长春花苷内酰胺对LPS刺激的RAW 264.7细胞中TNF- 产生的影响 0027 本实验通过ELISA试剂盒检测异长春花苷内酰胺对LPS刺激的RAW 264.7细胞产生 TNF- 的。
16、影响。 RAW 264.7细胞接种于96孔板中(4106个/mL)， 每组六个复孔， 每孔含200 L 不完全高糖DMEM培养基。 细胞贴壁后， 用PBS洗涤细胞一遍， 对照组加入不完全高糖培养基， 诱导组加入含1 g/mL LPS的不完全高糖培养基， 给药组加入25、 50、 100和200 M的异长春花 苷内酰胺溶液和含1 g/mL LPS的不完全高糖培养基， 于37， 5CO2孵育箱中培养24h后， 吸50 L上清液， 根据ELISA试剂盒(杭州联科生物技术有限公司)的操作说明书进行操作， 检 测TNF- 含量。 0028 实验结果如图2B所示， LPS诱导组的TNF- 水平显著高于空白。
17、对照组(P0.001)； 25、 50、 100和200 M异长春花苷内酰胺给药组的TNF- 水平与诱导组相比， 有显著差异(P 0.001)， 且该化合物对LPS刺激的RAW264.7细胞中TNF- 生成的抑制作用呈剂量依 赖性， 25 M水平的异长春花苷内酰胺能够将TNF- 的水平降至2370.3422.28pg/mL(P0.001)。 上 述结果表明异长春花苷内酰胺能显著抑制LPS刺激的RAW264.7细胞产生TNF- 。 0029 (五)异长春花苷内酰胺对IL-1 mRNA表达的影响 0030 本实验使用Trizol试剂提取对照组、 诱导组和异长春花苷内酰胺给药组的RAW 264.7细。
18、胞产生的IL-1 mRNA， 利用RT-PCR确定mRNA的相对含量。 RAW 264.7细胞接种于96孔 板中(4106个/mL)， 每组六个复孔， 每孔含200 L不完全高糖DMEM培养基。 细胞贴壁后， 用 PBS洗涤细胞一遍， 对照组加入不完全高糖培养基， 诱导组加入含1 g/mL LPS的不完全高糖 培养基， 给药组加入25、 50、 100和200 M的异长春花苷内酰胺溶液和含1 g/mL LPS的不完全 高糖培养基， 于37， 5CO2孵育箱中培养24h后， 根据Trizol试剂供应商(美国Invitrogen 公司)提供的方法提取RNA， 并测定在260nm和280nm的吸收值。
19、， 确定RNA的浓度和纯度； 随后， 说 明 书 3/5 页 5 CN 106176794 A 5 利用RT-PCR扩增RNA， 以GAPDH为内参， 采用2- Ct法计算IL-1 mRNA的相对表达量。 0031 实验结果如图3A所示， 结果表明， 25200 M水平的异长春花苷内酰胺能够显著抑 制IL-1 mRNA的表达(P0.001)， 并且抑制作用呈剂量依赖性； 当异长春花苷内酰胺的浓度 达到200 M时， 与LPS诱导组相比， IL-1 mRNA的表达被抑制了80.59。 0032 (六)异长春花苷内酰胺对TNF- mRNA表达的影响 0033 本实验使用Trizol试剂提取对照组、。
20、 诱导组和异长春花苷内酰胺给药组的RAW 264.7细胞产生的TNF- mRNA， 利用RT-PCR确定mRNA的相对含量。 RAW 264.7细胞接种于96孔 板中(4106个/mL)， 每组六个复孔， 每孔含200 L不完全高糖DMEM培养基。 细胞贴壁后， 用 PBS洗涤细胞一遍， 对照组加入不完全高糖培养基， 诱导组加入含1 g/mL LPS的不完全高糖 培养基， 给药组加入25、 50、 100和200 M的异长春花苷内酰胺溶液和含1 g/mL LPS的不完全 高糖培养基， 于37， 5CO2孵育箱中培养24h后， 根据Trizol试剂供应商(美国Invitrogen 公司)提供的方。
21、法提取RNA， 并测定在260nm和280nm的吸收值， 确定RNA的浓度和纯度； 随后， 利用RT-PCR扩增RNA， 以GAPDH为内参， 采用2- Ct法计算TNF- mRNA的相对表达量。 0034 实验结果如图3B所示， 结果表明， 25200 M水平的异长春花苷内酰胺能够显著抑 制TNF- mRNA的表达(P0.001)， 并且抑制作用呈剂量依赖性； 当异长春花苷内酰胺 的浓 度达到200 M时， 与LPS诱导组相比， TNF- mRNA的表达也被抑制了80.59。 0035 (七)异长春花苷内酰胺对NF- B通路的抑制作用 0036 RAW 264.7细胞接种于96孔板中(410。
22、6个/mL)， 每组六个复孔， 每孔含200 L不完 全高糖DMEM培养基。 细胞贴壁后， 用PBS洗涤细胞一遍， 对照组加入不完全高糖培养基， 诱导 组加入含1 g/mL LPS的不完全高糖培养基， 给药组加入25、 50、 100和200 M的异长春花苷内 酰胺溶液和含1 g/mL LPS的不完全高糖培养基， 于37， 5CO2孵育箱中培养24h后， 胰酶 消化， 于冷PBS中洗涤2遍， 各加入200ul冰预冷裂解缓冲液， 混匀后冰浴30min， 每隔5min涡 旋震荡10s， 充分裂解， 4离心10min， 上清液分装， 存于-70保存， 待检测。 利用Western blot法， 以G。
23、APDH为内参， 计算I B 、 p-I B 、 IKK 、 p-IKK 、 p65、 p-p65的相对表达量。 0037 实验结果如图4所示， 结果表明， 异长春花苷内酰胺能够显著地降低LPS-刺激的 RAW264.7细胞中p-I B 、 p-IKK 和p-p65的表达， 并且抑制作用呈剂量依赖性； 当异长春花 苷内酰胺的浓度达到200 M时， p-p65/p65比值下降至0.430.05， 与空白对照组接近。 0038 (八)异长春花苷内酰胺对MAPK通路的抑制作用 0039 RAW 264.7细胞接种于96孔板中(4106个/mL)， 每组六个复孔， 每孔含200 L不完 全高糖DMEM。
24、培养基。 细胞贴壁后， 用PBS洗涤细胞一遍， 对照组加入不完全高糖培养基， 诱导 组加入含1 g/mL LPS的不完全高糖培养基， 给药组加入25、 50、 100和200 M的异长春花苷内 酰胺溶液和含1 g/mL LPS的不完全高糖培养基， 于37， 5CO2孵育箱中培养24h后， 胰酶 消化， 于冷PBS中洗涤2遍， 各加入200uL冰预冷裂解缓冲液， 混匀后冰浴30min， 每隔5min涡 旋震荡10s， 充分裂解， 4离心10min， 上清液分装， 存于-70保存， 待检测。 利用Western blot法， 以GAPDH为内参， 计算ERK、 p-ERK、 JNK、 p-JNK、。
25、 p38、 p-p38的相对表达量。 0040 实验结果如图5所示， 结果表明， 异长春花苷内酰胺能够显著地降低LPS-刺激的 RAW 264.7细胞中p-ERK、 p-JNK和p-p38的表达， 并且抑制作用呈剂量依赖性； 当异长春花苷 内酰胺的浓度达到200M水平时， 对ERK、 JNK和p-38磷酸化的抑制率分别为90.00、 71.69和75.49。 说 明 书 4/5 页 6 CN 106176794 A 6 0041 上述实验结果表明， 异长春花苷内酰胺可显著抑制LPS刺激的RAW 264.7细胞中 IL-1 和TNF- 的生成， 同时也抑制了IL-1 和TNF- mRNA的表达，。
26、 这些结果说明异长春花苷 内酰胺具有良好的抗炎活性， 且无细胞毒性， 因此可用于制备抗炎药物。 抗炎机制方面的研 究结果显示， 异长春花苷内酰胺能够抑制RAW 264.7细胞中LPS刺激的NF- B和MAPK通路的 激活。 0042 以上已对本发明创造的较佳实例进行了具体说明， 但本发明创造不限于所述实施 例， 熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出其他的等同的变型 或替换， 这些等同的变型或替换均包含在本申请权力要求所限定的范围。 说 明 书 5/5 页 7 CN 106176794 A 7 图1 图2 图3 图4 说 明 书 附 图 1/3 页 8 CN 106176794 A 8 图5 说 明 书 附 图 2/3 页 9 CN 106176794 A 9 图6 说 明 书 附 图 3/3 页 10 CN 106176794 A 10 。