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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310225479.4 (22)申请日 2013.06.07 A61K 47/40(2006.01) A61K 47/20(2006.01) A61K 47/02(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 南开大学 地址 300071 天津市南开区卫津路 94 号 (72)发明人 刘育 李楠 陈湧 (74)专利代理机构 天津佳盟知识产权代理有限 公司 12002 代理人 侯力 (54) 发明名称 一种多糖金纳米粒子超分子。
2、组装体及其制 备方法和应用 (57) 摘要 一种多糖金纳米粒子超分子组装体， 以环 糊精与金刚烷间强的非共价相互作用， 形成了以 亲水的透明质酸为外壳， 疏水的 N- 金刚烷基硫 辛酰胺修饰的金纳米粒子为内核的超分子纳米粒 子， 通过其三维的孔穴结构和静电作用可以负载 并靶向传递多种抗癌药物。本发明的优点是 ： 该 靶向药物传递体系合成路线简单、 生产成本低且 产率较高， 适于放大合成和实际生产应用 ； 通过 恶性肿瘤细胞表面透明质酸受体为媒介的内吞作 用将抗癌药物超分子组装体靶向地带入到癌细胞 当中， 然后缓慢释放抗癌药物， 实现了对癌细胞的 靶向选择性杀伤， 同时对正常细胞毒副作用明显 降。
3、低。 (51)Int.Cl. 审查员 赵九永 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书4页 附图4页 (10)授权公告号 CN 103263673 B (45)授权公告日 2015.02.25 CN 103263673 B 1/2 页 2 1. 一种多糖金纳米粒子超分子组装体的制备方法， 所述多糖金纳米粒子超分子组 装体为基于 N- 金刚烷基硫辛酰胺修饰的金纳米粒子和环糊精修饰透明质酸合成的二元超 分子纳米组装体， 其中 N- 金刚烷基硫辛酰胺修饰的金纳米粒子的粒径大小为 2.2 nm， 每个 金纳米粒子表面修饰有 19 个金刚烷胺并且每个金刚烷胺在金纳米。
4、粒子的表面的占有率为 3.20 nm2， 环糊精修饰透明质酸平均一条高分子链上修饰 11 个环糊精单元， 该二元超分子 纳米组装体以环糊精与金刚烷胺强的非共价相互作用， 形成以亲水的透明质酸为外壳， 疏 水的 N- 金刚烷基硫辛酰胺修饰的金纳米粒子为内核的超分子纳米粒子， 其粒径大小为 200 nm， 这种纳米超分子组装体表面带负电并且具有三维的多孔结构， 可以负载多种抗癌药物， 其特征在于包括以下步骤 ： 1） N- 金刚烷基硫辛酰胺的合成 在氮气氛围下， 将硫辛酸溶于干燥的 N, N- 二甲基甲酰胺中， 再加入 1- 羟基苯并三 唑于 0 下搅拌活化半小时， 然后将溶有 1- 金刚烷胺及 。
5、N, N- 二环己基碳酰二亚胺的 N, N- 二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到上述溶液中， 保持 0 ， 继续在氮气保护下搅拌反应 24 h 后， 再在 18-25下反应 24 h， 将反应溶液中不溶物过滤除去后， 将滤液在真空度为 0.1Pa 下减压蒸馏去除溶剂得到固体 a， 将所得固体 a 溶于三氯甲烷中， 再用水萃取三次， 收集有 机相并用无水硫酸钠干燥后， 通过在真空度为 0.1Pa 下减压蒸馏进行浓缩， 然后以体积比 为 100:1 的石油醚与三氯甲烷的混合液为展开剂， 用 200-300 目硅胶柱分离即可制得 N- 金 刚烷基硫辛酰胺 ； 2） N- 金刚烷基硫辛酰胺修饰的金纳米粒子的合。
6、成 在氮气氛围下， 将四水合氯金酸溶于干燥的N, N-二甲基甲酰胺中， 再快速加入溶有硼 氢化钠和N-金刚烷基硫辛酰胺的干燥的N, N-二甲基甲酰胺溶液， 反应液由浅黄色变成黑 棕色， 继续在 18-25下氮气保护搅拌反应 24 h， 然后加入乙腈沉淀产物， 离心收集得到的 黑色固体b， 先用体积比为1:1的乙腈和N, N-二甲基甲酰胺混合溶液洗涤， 再用乙醇洗涤， 离心收集固体 b 并在真空度为 0.1Pa 下干燥后， 得到 N- 金刚烷基硫辛酰胺修饰的金纳米粒 子 ； 3） 多糖金纳米粒子超分子组装体的制备 将环糊精修饰透明质酸溶于水中得到溶液， 环糊精修饰透明质酸与水的用量比为 0.05。
7、 mmol/L， 将 N- 金刚烷基硫辛酰胺修饰的金纳米粒子加入上述溶液中超溶， 即可制得靶向传 递多种抗癌药物的多糖金纳米粒子超分子组装体。 2. 根据权利要求 1 所述多糖金纳米粒子超分子组装体的制备方法， 其特征在于 ： 所 述硫辛酸与 N, N- 二甲基甲酰胺的用量比为 0.1 mol/L， 1- 金刚烷胺和 N, N- 二环己基碳 酰二亚胺与 N, N- 二甲基甲酰胺的用量比分别为 0.12 mol/L 和 0.1 mol/L， 固体 a 与三氯 甲烷的用量比为 3mg/mL。 3. 根据权利要求 1 所述多糖金纳米粒子超分子组装体的制备方法， 其特征在于 ： 所 述四水合氯金酸与N。
8、, N-二甲基甲酰胺的用量比为7.4 mmol/L， 硼氢化钠和N-金刚烷基硫 辛酰胺与N, N-二甲基甲酰胺的用量比分别为10 mmol/L和0.81 mmol/L， 乙腈与反应液的 用量体积比为 1:1。 4. 一种如权利要求 1 所制备的多糖金纳米粒子超分子组装体的应用， 其特征在于 ： 用于负载抗癌药物， 负载了抗癌药物的金纳米粒子超分子组装体的水溶液的制备方法如 权 利 要 求 书 CN 103263673 B 2 2/2 页 3 下 ： 在制得的多糖金纳米粒子超分子组装体中， 缓慢滴加抗癌药物的水溶液， 18-25下 避光搅拌24 h后离心收集固体， 得到的固体用水洗涤3-5次， 。
9、离心收集固体， 并在真空度为 0.1Pa 下干燥后得到负载了抗癌药物的金纳米粒子超分子组装体的水溶液。 5. 根据权利要求 4 所述负载了抗癌药物的金纳米粒子超分子组装体的水溶液的制备 方法， 其特征在于 ： 所述抗癌药物的溶液为盐酸阿霉素水溶液、 盐酸伊立替康水溶液、 盐酸 拓扑替康水溶液、 喜树碱N, N-二甲基甲酰胺溶液或紫杉醇N, N-二甲基甲酰胺溶液 ； 抗癌 药物的溶液的浓度均为 3mg/mL。 6. 根据权利要求 4 所述负载了抗癌药物的金纳米粒子超分子组装体的水溶液的制备 方法， 其特征在于 ： 所述多糖金纳米粒子超分子组装体与抗癌药物的质量比为 9.26:1。 权 利 要 求。
10、 书 CN 103263673 B 3 1/4 页 4 一种多糖金纳米粒子超分子组装体及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及抗癌药物靶向传递技术领域， 特别是一种多糖金纳米粒子超分子组 装体及其制备方法和应用。 背景技术 0002 纳米材料由于其独特的物理、 化学性质在药物传递和医学治疗中有着重要的作 用。在纳米材料中， 金纳米粒子具有低毒性和良好的生物相容性， 其制备简单， 尺寸易于控 制， 且表面还易修饰多种功能性分子， 因此作为生物活性分子尤其是抗癌药物的载体在癌 症治疗中有着潜在的应用。临床癌症治疗的药物存在明显的剂量与疗效的关系， 加大剂量 会对正常组织和细胞产生显著的毒。
11、副作用， 因此增强药物对癌变部位的选择性， 降低其在 正常组织和细胞中分布积累是提高抗癌药物疗效的关键。 目前最有效的方法之一就是利用 靶向原理设计特异性的纳米药物输送体系， 使靶向组织和细胞中药物浓度升高的同时降低 其毒副作用。近年来， 一种亲水的多聚糖高分子透明质酸 （HA） 作为药物传递的靶向剂受 到越来越广泛的关注。 它可以正常地被人体吸收和代谢， 具有良好的生物兼容性， 而且表面 具有羟基和羧基等可修饰的基团便于之后的化学修饰。更重要的是， 在肿瘤表面透明质酸 的受体CD44和RHAMM有过量的表达， 所以透明质酸与受体之间强的特异性结合使其在纳米 药物输送体系中具有靶向功能， 能够。
12、提高抗癌药物的利用率。 因此， 将金纳米粒子和透明质 酸相结合运用到抗癌药物的输送体系中可以同时发挥两者的优点， 具有很好的应用前景。 发明内容 0003 本发明的目的是针对上述技术分析， 提供一种多糖金纳米粒子超分子组装体及 其制备方法和应用， 该超分子组装体可以靶向传递多类抗癌药物如盐酸阿霉素、 盐酸伊立 替康、 盐酸拓扑替康、 喜树碱和紫杉醇等多类亲水和疏水抗癌药物， 且毒副作用低、 制备方 法简单、 产率较高， 适于放大合成和实际生产应用。 0004 本发明的技术方案 ： 0005 一种多糖金纳米粒子超分子组装体， 为基于 N- 金刚烷基硫辛酰胺修饰的金纳 米粒子和环糊精修饰透明质酸合。
13、成的二元超分子纳米组装体， 其中 N- 金刚烷基硫辛酰胺 修饰的金纳米粒子的粒径大小为 2.2 nm， 每个金纳米粒子表面修饰有 19 个金刚烷胺并且 每个金刚烷胺在金纳米粒子的表面的占有率为 3.20 nm2， 环糊精修饰透明质酸平均一条高 分子链上修饰 11 个环糊精单元， 该二元超分子组装体以环糊精与金刚烷胺强的非共价相 互作用， 形成以亲水的透明质酸为外壳， 疏水的 N- 金刚烷基硫辛酰胺修饰的金纳米粒子为 内核的超分子纳米粒子， 其粒径大小为 200 nm， 这种纳米超分子组装体表面带负电并且具 有三维的多孔结构， 可以负载多种抗癌药物。 0006 一种所述多糖金纳米粒子超分子组装体。
14、的制备方法， 包括以下步骤 ： 0007 1） N- 金刚烷基硫辛酰胺的合成 0008 在氮气氛围下， 将硫辛酸溶于干燥的 N, N- 二甲基甲酰胺中， 再加入 1- 羟基苯并 说 明 书 CN 103263673 B 4 2/4 页 5 三唑于 0 下搅拌活化半小时， 然后将溶有 1- 金刚烷胺及 N, N- 二环己基碳酰二亚胺的 N, N-二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到上述溶液中， 保持0 ， 继续在氮气保护下搅拌反应24 h后， 再在18-25下反应24 h， 将反应溶液中不溶物过滤除去后， 将滤液在真空度为0.1Pa 下减压蒸馏去除溶剂得到固体 a， 将所得固体 a 溶于三氯甲烷中， 再用。
15、水萃取三次， 收集有 机相并用无水硫酸钠干燥后， 通过在真空度为 0.1Pa 下减压蒸馏进行浓缩， 然后以体积比 为 100:1 的石油醚与三氯甲烷的混合液为展开剂， 用 200-300 目硅胶柱分离即可制得 N- 金 刚烷基硫辛酰胺 ； 0009 2） N- 金刚烷基硫辛酰胺修饰的金纳米粒子 （AuNPs） 的合成 0010 在氮气氛围下， 将四水合氯金酸溶于干燥的N, N-二甲基甲酰胺中， 再快速加入溶 有硼氢化钠和N-金刚烷基硫辛酰胺的干燥的N, N-二甲基甲酰胺溶液， 反应液由浅黄色变 成黑棕色， 继续在 18-25下氮气保护搅拌反应 24 h， 然后加入乙腈沉淀产物， 离心收集得 到。
16、的黑色固体 b， 先用体积比为 1:1 的乙腈和 N, N- 二甲基甲酰胺混合溶液洗涤， 再用乙醇 洗涤， 离心收集固体 b 并在真空度为 0.1Pa 下干燥后， 得到 N- 金刚烷基硫辛酰胺修饰的金 纳米粒子 （AuNPs） ； 0011 3） 多糖金纳米粒子超分子组装体 (HACD-AuNPs) 的制备 0012 将环糊精修饰透明质酸 （HACD） 溶于水中得到溶液， 环糊精修饰透明质酸与水的用 量比为 0.05 mmol/L， 将 N- 金刚烷基硫辛酰胺修饰的金纳米粒子 （AuNPs） 加入上述溶液中 超溶， 即可制得靶向传递多种抗癌药物的多糖金纳米粒子超分子组装体 （HACD-AuNP。
17、s） 。 0013 所述硫辛酸与N, N-二甲基甲酰胺的用量比为0.1 mol/L， 1-金刚烷胺和N, N-二 环己基碳酰二亚胺与 N, N- 二甲基甲酰胺的用量比分别为 0.12 mol/L 和 0.1 mol/L， 固体 a 与三氯甲烷的用量比为 3mg/mL。 0014 所述氯金酸与N, N-二甲基甲酰胺的用量比为7.4 mmol/L， 硼氢化钠和N-金刚烷 基硫辛酰胺与N, N-二甲基甲酰胺的用量比分别为10 mmol/L和0.81 mmol/L， 乙腈与反应 液的用量体积比为 1:1。 0015 一种所制备的多糖金纳米粒子超分子组装体的应用， 用于负载抗癌药物， 负载 了抗癌药物的。
18、金纳米粒子超分子组装体 （Anticancer DrugHACD-AuNPs） 的水溶液的制备 方法如下 ： 0016 在制得的多糖金纳米粒子超分子组装体 （HACD-AuNPs） 中， 缓慢滴加抗癌药物 的水溶液， 18-25下避光搅拌 24 h 后离心收集固体， 得到的固体用水洗涤 3-5 次， 离心收 集固体， 并在真空度为 0.1Pa 下干燥后得到负载了抗癌药物的金纳米粒子超分子组装体 （Anticancer DrugHACD-AuNPs） 的水溶液。 0017 所述抗癌药物的溶液为盐酸阿霉素水溶液、 盐酸伊立替康水溶液、 盐酸拓扑替康 水溶液、 喜树碱N, N-二甲基甲酰胺溶液和紫杉。
19、醇N, N-二甲基甲酰胺溶液 ； 抗癌药物的溶 液的浓度均为 3mg/mL。 0018 所述多糖金纳米粒子超分子组装体 （HACD-AuNPs）与抗癌药物的质量比为 9.26:1。 0019 本发明的优点是 ： 该靶向传递抗癌药物的金纳米粒子超分子组装体通过其三维孔 洞和静电作用可以有效负载多种抗癌药物， 并利用透明质酸与癌细胞表面过量表达的透明 质酸受体间强的抗原 - 抗体作用， 将载有抗癌药物的超分子组装体通过细胞的内吞作用特 说 明 书 CN 103263673 B 5 3/4 页 6 异性地带入到癌细胞当中并根据 pH 响应缓慢释放药物， 从而实现对癌细胞的选择性杀伤 ； 该药物传递体。
20、系与直接使用抗癌药物相比有相当的抗癌活性， 但是毒副作用明显降低 ； 该 药物传递体系的制备工艺简单、 易于实施且材料成本低， 在癌症的靶向治疗领域有较大的 应用前景。 0020 【附图说明】 0021 图 1 为 N- 金刚烷基硫辛酰胺和 N- 金刚烷基硫辛酰胺修饰的金纳米粒子 （AuNPs） 的合成路线图。 0022 图 2 为 AuNPs 的透射电子显微镜图。 0023 图3为该纳米超分子组装体HACD-AuNPs及其吸附抗癌药物的的合成路线示意图。 0024 图 4 为金纳米粒子超分子组装体 HACD-AuNPs 的透射电子显微镜图。 0025 图 5 为不同时间间隔 MCF-7 细胞。
21、和 NIH3T3 细胞摄入的金含量对比图。 0026 图 6 为 MCF-7 细胞的细胞毒性实验结果。 0027 图 7 为 NIH3T3 细胞的细胞毒性实验结果。 0028 【具体实施方式】 0029 下面通过实例对本发明做进一步的说明 ： 0030 实施例 ： 0031 一种所述靶向传递多种抗癌药物的多糖金纳米粒子超分子组装体的制备方法， 步骤如下 ： 0032 1） N- 金刚烷基硫辛酰胺的合成 0033 在氮气保护下， 将 206.3 mg （1 mmol） 硫辛酸溶于 10 mL 干燥的 N, N- 二甲基甲酰 胺中， 加入 162.5 mg（1.2 mmol） 1- 羟基苯并三唑于。
22、 0 C 搅拌活化半小时。将溶有 165.3 mg（1 mmol） 1- 金刚烷胺及 247.6 mg（1.2 mmol） N, N- 二环己基碳酰二亚胺的 10 mL N, N- 二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到上述溶液中。保持 0 C， 继续在氮气保护下搅拌反应 24 h 后， 再在室温下反应 24 h。将反应溶液中不溶物过滤除去后， 将滤液经减压蒸馏去除溶剂 得到固体 a， 将所得固体 a 溶于三氯甲烷中， 固体 a 与三氯甲烷的用量比为 3mg/mL， 再用 50 mL 水萃取三次， 收集有机相并用无水硫酸钠干燥后， 通过在真空度为 0.1Pa 下减压蒸馏进 行浓缩， 然后以石油醚与三氯甲烷。
23、的体积比为100:1的混合液为展开剂， 用200-300目硅胶 柱分离即可制得 N- 金刚烷基硫辛酰胺。 0034 检测显示本发明制备的 N- 金刚烷基硫辛酰胺的核磁、 元素分析及质谱表征如下 ： 1H NMR (400 MHz, CDCl 3, TMS, ppm): 5.08 (s, 1H), 3.63 3.52 (m, 1H), 3.23 3.06 (m, 2H), 2.46 (td, 1H), 2.10 (dd, 5H), 2.02 1.87 (m, 6H), 1.76 1.56 (m, 12H), 1.51 1.39 (m, 2H).。C18H29NOS2： 实 测 值 ： C， 63。
24、.51% ； H， 8.66% ； N， 4.13%。理论值 ： C， 63.67% ； H， 8.61% ； N， 4.12%。ESI-MS ： 340.17 M+H+。 0035 2） N- 金刚烷基硫辛酰胺修饰的金纳米粒子 （AuNPs） 的合成 0036 在氮气氛围下， 将 50 mg 四水合氯金酸溶于 20 mL 干燥的 N, N- 二甲基甲酰胺中， 快速加入溶有 75.5 mg 硼氢化钠和 5.5 mg N- 金刚烷基硫辛酰胺的 20 mL 干燥的 N, N- 二 甲基甲酰胺溶液。 反应液很快由浅黄色变成黑棕色， 继续在氮气保护下室温搅拌反应24 h。 然后加入乙腈沉淀产物， 乙腈。
25、与反应液的用量体积比为 1:1， 离心收集固体 b， 得到的黑色 固体 b 先用 60 mL 体积比为 1:1 的乙腈和 N, N- 二甲基甲酰胺混合溶液洗涤再用 60 mL 乙 说 明 书 CN 103263673 B 6 4/4 页 7 醇洗涤。离心收集固体 b 在真空度为 0.1Pa 下干燥， 得到 N- 金刚烷基硫辛酰胺修饰的金纳 米粒子 （AuNPs） 。图 1 为该金纳米粒子 （AuNPs） 的合成路线图， 图 2 为 AuNPs 的透射电子显 微镜图。 0037 检测显示本发明制备的 N- 金刚烷基硫辛酰胺修饰的金纳米粒子的红外、 元素分 析及电感耦合等离子体发射光谱表征如下 ：。
26、 FT-IR (KBr) v 3325,2906,2852,1662,1537,1 448,1343,1242,1156,1038,811 cm-1。元素分析数据 : C， 12.00% ； H， 1.49%, N， 0.24%。ICP (%): Au， 44.88。 0038 3） 多糖金纳米粒子超分子组装体 (HACD-AuNPs) 的制备 0039 将 24.78 的环糊精修饰透明质酸 （HACD） 溶于 8 mL 水中得到水溶液， 然后把 3 mg N- 金刚烷基硫辛酰胺修饰的金纳米粒子 （AuNPs） 溶于该水溶液中即可制得靶向传递多种 抗癌药物的超分子组装体 （HACD-AuNPs。
27、） 。 0040 所制备的多糖金纳米粒子超分子组装体的应用， 用于负载抗癌药物， 负载了抗 癌药物的金纳米粒子超分子组装体 （Anticancer DrugHACD-AuNPs） 的水溶液的制备方法 如下 0041 将 24.78 mg 环糊精修饰透明质酸 （HACD） 溶于 8 mL 水中， 加入 3 mg N- 金刚烷基 硫辛酰胺修饰的金纳米粒子 （AuNPs） 制成 HACD-AuNPs 水溶液。然后分别缓慢滴加浓度均 为 3mg/mL 的抗癌药物的溶液， 抗癌药物的溶液为 ： 盐酸阿霉素水溶液 、 盐酸伊立替康水溶 液、 盐酸拓扑替康水溶液、 喜树碱 N, N- 二甲基甲酰胺溶液和紫杉。
28、醇 N, N- 二甲基甲酰胺 溶液。22 C 下避光搅拌 24 h 后离心收集固体， 得到的固体用水洗涤四次。离心收集固体 再在真空度为 0.1 Pa 下干燥即可制得负载了抗癌药物的多糖金纳米粒子超分子组装体 （Anticancer DrugHACD-AuNPs） 。图 3 为该纳米超分子组装体及其吸附抗癌药物的的合成 路线示意图。图 4 为该金纳米粒子超分子组装体的透射电子显微镜图。 0042 检测显示本发明制备的多糖金纳米粒子超分子组装体对各种抗癌药物的负载 量如下表所示 ： 0043 盐酸阿霉素盐酸伊立替康盐酸拓扑替康喜树碱 紫杉醇 负载率 (%)11.027.514.985.0419.。
29、29 0044 本发明的具体应用效果如下 ： 0045 以抗癌药物盐酸阿霉素 （DOX） 为例， 将 MCF-7 细胞 （人类乳腺癌细胞） 和 NIH3T3 细 胞 （小鼠成纤维细胞） 在铺有含有 10 % 胎牛血清的 DMEM 培养基的 24 孔板中培养 24 小时后 加入HACD-AuNPs， 在不同的时间间隔测量进入细胞的金含量。 如图5所示， 在不同的时间间 隔进入 MCF-7 细胞的金含量都要高于进入 NIH3T3 细胞的金含量， 表明 HACD-AuNPs 利用透 明质酸与癌细胞表面过量表达的透明质酸受体间强的相互作用可以靶向的进入癌细胞当 中。 之后将MCF-7细胞和NIH3T3。
30、细胞在铺有含有10 %胎牛血清的DMEM培养基的96孔板中 培养24小时。 分别加入DOX， HACD-AuNPs， DOX-HACD-AuNPs， 连续培养48小时， 用MTT法测量 各个实验条件下的细胞生存率。结果表明， 如图 6 所示， 在 48 小时范围内， DOX-HACD-AuNPs 对 MCF-7 细胞的抑制作用相当于 DOX ； 而对于 NIH3T3 细胞， 如图 7 所示， DOX 对其杀伤性很 大， 然而由于正常细胞表面透明质酸受体的表达远远小于癌细胞， 因此 DOX-HACD-AuNPs 对 于正常细胞的毒副作用很小。以上结果表明 DOX-HACD-AuNPs 实现了对正常细胞的保护和 对癌细胞的靶向选择性杀伤。 说 明 书 CN 103263673 B 7 1/4 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103263673 B 8 2/4 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 103263673 B 9 3/4 页 10 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103263673 B 10 4/4 页 11 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103263673 B 11 。