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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810426066.5 (22)申请日 2018.05.07 (71)申请人 广东海洋大学 地址 524088 广东省湛江市麻章区湖光岩 东海大路1号 (72)发明人 千忠吉 梁鹏 李承勇 周春霞 洪鹏志 孙省利 (74)专利代理机构 北京锺维联合知识产权代理 有限公司 11579 代理人 罗银燕 (51)Int.Cl. A61K 38/08(2019.01) A61P 39/06(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A23L 33/18(2016.01。
2、) (54)发明名称 等鞭金藻多肽IZP-1在制备预防和治疗酒精 性肝损伤的药物、 保健品中的用途 (57)摘要 本发明涉及一种等鞭金藻多肽IZP-1在制备 预防和治疗酒精性肝损伤的药物、 保健品或饮食 补充剂中的用途， 所述等鞭金藻多肽IZP-1的氨 基酸序列为Asn-Asp-Ala-Glu-Tyr-Gly-Ile- Cys-Gly-Phe。 所述来源于湛江等鞭金藻的多肽 IZP-1能够清除自由基， 对细胞无毒性， 具有抗氧 化作用， 可以治疗和预防酒精性肝损伤， 具有显 著的保肝功效。 权利要求书1页 说明书9页 附图4页 CN 109157647 A 2019.01.08 CN 1091。
3、57647 A 1.一种等鞭金藻多肽IZP-1在制备预防和治疗酒精性肝损伤的药物、 保健品或饮食补 充剂中的用途， 其中等鞭金藻多肽IZP-1的氨基酸序列为Asn-Asp-Ala-Glu-Tyr-Gly-Ile- Cys-Gly-Phe。 2.根据权利要求1的所述等鞭金藻多肽IZP-1在制备预防和治疗酒精性肝损伤的药物、 保健品或饮食补充剂中的用途， 其中所述等鞭金藻多肽IZP-1源自湛江等鞭金藻 (Isochrysiszhangjiangensis)。 3.根据权利要求1的所述等鞭金藻多肽IZP-1在制备预防和治疗酒精性肝损伤的药物、 保健品或饮食补充剂中的用途， 其中所述等鞭金藻多肽IZP。
4、-1能够抑制酒精诱导的HepG2细 胞损伤。 4.根据权利要求4的所述等鞭金藻多肽IZP-1在制备预防和治疗酒精性肝损伤的药物、 保健品或饮食补充剂中的用途， 其中所述等鞭金藻多肽IZP-1的浓度大于等于20 M。 5.根据权利要求1的所述等鞭金藻多肽IZP-1在制备预防和治疗酒精性肝损伤的药物、 保健品或饮食补充剂中的用途， 其中所述等鞭金藻多肽IZP-1能够抑制DNA在氧化反应中的 断裂。 6.根据权利要求1的所述等鞭金藻多肽IZP-1在制备预防和治疗酒精性肝损伤的药物、 保健品或饮食补充剂中的用途， 其中所述等鞭金藻多肽IZP-1能够降低细胞内ROS含量。 7.一种等鞭金藻多肽IZP-1。
5、在体内或体外清除自由基的用途， 其中所述等鞭金藻多肽 IZP-1的氨基酸序列为Asn-Asp-Ala-Glu-Tyr-Gly-Ile-Cys-Gly-Phe。 8.一种等鞭金藻多肽IZP-1在体内或体外抑制酒精诱导的HepG2细胞损伤的用途， 其中 所述等鞭金藻多肽IZP-1的氨基酸序列为Asn-Asp-Ala-Glu-Tyr-Gly-Ile-Cys-Gly-Phe。 9.一种等鞭金藻多肽IZP-1在体内或体外抑制DNA在氧化反应中的断裂的用途， 其中所 述等鞭金藻多肽IZP-1的氨基酸序列为Asn-Asp-Ala-Glu-Tyr-Gly-Ile-Cys-Gly-Phe。 10.一种等鞭金藻多。
6、肽IZP-1在体内或体外清除细胞内ROS的用途， 其中所述等鞭金藻 多肽IZP-1的氨基酸序列为Asn-Asp-Ala-Glu-Tyr-Gly-Ile-Cys-Gly-Phe。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 109157647 A 2 等鞭金藻多肽IZP-1在制备预防和治疗酒精性肝损伤的药物、 保健品中的用途 技术领域 0001 本发明涉及多肽领域， 尤其涉及等鞭金藻多肽IZP-1在制备预防和治疗酒精性肝 损伤的药物、 保健品或饮食补充剂中的用途。 背景技术 0002 湛江等鞭金藻(lsochrysiszhangjiangensisHu1992)， 属于金藻门 Chrysophyt。
7、a， 金藻纲Chrysophyceae， 等鞭金藻目lsochrysidales， 等鞭金藻科lsochrysidaceae， 生长在 广东省湛江市南三岛海域。 湛江等鞭金藻具有营养价值高、 繁殖快的特点， 富含多不饱和脂 肪酸， 细胞的代谢产物有色素、 多糖和蛋白质等。 有研究发现湛江等鞭金藻在重金属镉的环 境胁迫下， 藻内超氧化物自由基的产生和清除是平衡的， 当湛江等鞭金藻受到氧化损伤时， 可以通过抗氧化酶系统与非酶物质来减缓活性氧带来的损伤(田丹， 赵文， 王媛， 等； 镉胁迫 对两种海洋微藻生长和抗氧化系统的影响， J.大连水产学院学报， 2010， 25(5)： 417- 421)；。
8、 也有研究发现在塑化剂DIBP的环境胁迫下， 湛江等鞭金藻的超氧化物歧化酶(SOD)含 量下降， 还原型谷胱甘肽(GSH)含量上升， 来降解过氧化物质， 证明湛江等鞭金藻具有抗氧 化活性(姜莉， 耿庆华， 李成镛， 等.DIBP对2种海洋微藻生长和抗氧化系统的影响， J.环境 科学与技术， 2015， 38(12Q)： 7-10)。 0003 饮酒导致各种相关疾病， 如： 肝细胞坏死、 肝癌、 酒精性肝病等。 酒精性肝病 (alcoholicliverdisease， ALD)为长期大量饮酒所致肝脏损伤性疾病， 在人群中具有较高 的发生率， 其导致脂肪性肝变及肝癌是一种常见的肝损伤变性， 酒精。
9、氧化应激损伤HepG2的 机制如图1所示， 酒精引起的氧化应激损伤过程中， 最重要的是乙醇代谢的途径， 影响着机 体抗氧化系统中活性氧(ROS)和自由基的平衡， 这个途径是乙醇脱氢酶催化乙醇生成乙醛， 同时产生活性氧和自由基。 酒精性肝损伤初期有氧化应激损伤的特征， 具体表现为活性氧、 自由基的增加， 大量的酒精作用于机体后会导致细胞内抗氧化物质的耗竭并降低抗氧化物 质的生物活性， 大量的自由基进而对DNA、 蛋白质等造成损伤。 因此， 可以通过改善体内的活 性氧和自由基的不平衡， 达到治疗目前严重的酒精性肝损伤问题。 0004 肝癌细胞株(HepG2)是研究酒精性肝损伤的良好模型， 其生命力。
10、强， 容易培养繁 殖， 并广泛应用于肝细胞毒性和代谢类研究。 0005 然而， 目前对湛江等鞭金藻的生物活性方面的开发及研究都仍然较少， 还没有关 于湛江等鞭金藻多肽IZP-1对抗酒精诱导的细胞毒性作用及其机制的研究。 发明内容 0006 为了解决上述现有技术中的问题， 本发明提供了以下技术方案： 0007 在一个方面， 本发明提供一种等鞭金藻多肽IZP-1在制备预防和治疗酒精性肝损 伤的药物、 保健品或饮食补充剂中的用途， 其中等鞭金藻多肽IZP-1的氨基酸序列为Asn- Asp-Ala-Glu-Tyr-Gly-lle-Cys-Gly-Phe。 说 明 书 1/9 页 3 CN 109157。
11、647 A 3 0008 进一步地 ， 所述等鞭金藻多肽IZP-1源自湛江等鞭金藻 (Isochrysis zhangjiangensis)。 0009 进一步地， 所述等鞭金藻多肽IZP-1能够抑制酒精诱导的HepG2细胞损伤。 0010 进一步地， 所述等鞭金藻多肽IZP-1的浓度大于等于20 M。 0011 进一步地， 所述等鞭金藻多肽IZP-1能够抑制DNA在氧化反应中的断裂。 0012 进一步地， 所述等鞭金藻多肽IZP-1能够降低细胞内ROS含量。 0013 在另一方面， 本发明提供一种等鞭金藻多肽IZP-1在体内或体外清除自由基的用 途， 其中所述等鞭金藻多肽IZP-1的氨基酸序。
12、列为Asn-Asp-Ala-Glu-Tyr- Gly-lle-Cys- Gly-Phe。 0014 在另一方面， 本发明提供一种等鞭金藻多肽IZP-1在体内或体外抑制酒精诱导的 HepG2细胞损伤的用途， 其中所述等鞭金藻多肽IZP-1的氨基酸序列为Asn- Asp-Ala-Glu- Tyr-Gly-lle-Cys-Gly-Phe。 0015 在另一方面， 本发明提供一种等鞭金藻多肽IZP-1在体内或体外抑制DNA在氧化反 应中的断裂的用途， 其中所述等鞭金藻多肽IZP-1的氨基酸序列为Asn- Asp-Ala-Glu-Tyr- Gly-lle-Cys-Gly-Phe。 0016 在另一方面，。
13、 本发明提供一种等鞭金藻多肽IZP-1在体内或体外清除细胞内 ROS 的用途， 其中所述等鞭金藻多肽IZP-1的氨基酸序列为Asn-Asp-Ala-Glu- Tyr-Gly-lle- Cys-Gly-Phe。 0017 在本发明中， 通过不同浓度梯度的酒精处理， 建立酒精损伤HepG2细胞的模型； 从 湛江等鞭金藻中提取多肽IZP-1， 检测IZP-1对HepG2细胞的相对活力、 活性氧水平、 DNA的影 响。 研究结果表明： 浓度为10、 20、 50、 100 mol/LIZP- 1的DPPH自由基清除率达到69以上， 且对HepG2细胞均无毒性作用； 当用 0.75mol/L的酒精处理2。
14、4h时， HepG2细胞的相对活力接 近30， 大部分细胞缩小变圆、 贴壁性降低、 发亮； 随着IZP-1浓度升高， HepG2细胞的相对活 力、 对 DNA的保护作用与对照组相比明显升高， 同时细胞内活性氧的生成量逐渐降低， 亮绿 色荧光强度减弱。 因此， 湛江等鞭金藻多肽IZP-1在一定程度上对酒精诱导 HepG2细胞的氧 化应激损伤具有保护作用。 0018 在本发明中， 术语 “基本” 或 “基本上” 并不排除 “完全” 的意思。 如一个成分 “基本上 不含” Y， 也可以是完全不含有Y。 在限定具体数值的情况下， 是指该具体数值具有以该具体 数值为基础的上下浮动的范围， 浮动范围可以是。
15、该具体数值的+/-5， +/-4， +/-3， +/- 2， +/-1， +/-0.5， +/-0.2， +/-0.1， +/- 0.05， +/-0.01等。 如果需要，“基本” 或 “基本上” 可以以上浮动范围代替或从本发明定义中删除。 0019 “含有” 既包括提到的因素， 也允许包括附加的、 不确定的因素。 0020 “大约” 、“约” 、“左右” 在限定具体数值的情况下， 是指该具体数值具有以该具体数 值为基础的上下浮动的范围， 浮动范围可以是该具体数值的+/-5， +/- 4， +/-3， +/- 2， +/-1， +/-0.5， +/-0.2， +/-0.1， +/-0.05， 。
16、+/-0.01等。 0021 “和/或” 表示由其连接的多个术语可以各自单独地使用， 也可以相互任意地组合。 0022 本发明中， 为简明起见而使用的数值范围不仅包括其端点值， 也包括其所有的子 范围和此范围内所有的单独的数值。 例如， 数值范围1-6不仅包括子范围， 例如1-3、 1-4、 1- 5、 2-4、 2-6、 3-6等， 也包括此范围内单独的数值， 例如1、 2、 3、 4、 5、 6。 说 明 书 2/9 页 4 CN 109157647 A 4 附图说明 0023 图1示出了酒精氧化应激损伤HepG2的机制； 0024 图2示出了不同浓度梯度的IZP-1对HepG2细胞的活力。
17、影响； 0025 图3示出了不同浓度梯度的酒精对HepG2细胞的相对活力影响， 其中与对照组比较 (0mol/L)， *P0.05， *P0.01； 0026 图4示出了不同浓度梯度的酒精氧化损伤HepG2细胞的形态， 其中虚线箭头为正常 的HepG2细胞； 实线箭头为凋亡的HepG2细胞； 0027 图5示出了不同浓度梯度的IZP-1对0.75mol/L酒精氧化损伤HepG2细胞的活力影 响， 其中与空白组比较， *P0.05， *P0.01； 与对照组比较， #P0.05， #P0.01； 0028 图6示出了不同浓度梯度的IZP-1对0.75mol/L酒精损伤HepG2细胞的形态， 其中。
18、虚 线箭头为正常的HepG2细胞； 实线箭头为凋亡的HepG2细胞； 0029 图7示出了IZP-1对0.75mol/L酒精氧化损伤HepG2细胞内活性氧的水平的影响； 0030 图8示出了不同浓度梯度的IZP-1对氧化损伤HepG2细胞的DNA的保护。 具体实施方式 0031 在下面描述和图解本发明的示例性实施方案。 为了清楚和准确， 下面讨论的所述 示例性实施方案可以包括优选的步骤、 方法和特征， 本领域普通技术人员将可以认识到， 这 些优选的步骤、 方法和特征不是落在本发明范围内的必要条件。 0032 在下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 在下述实施例 中所用的材。
19、料、 试剂等如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0033 在下述实施例中， 实验数据用XSD(n4)表示， 用IBM SPSS Statistics 22.0统 计软件对数据进行方差分析及多重比较； 采用Graph Pad Prim6作图。 0034 在下述实施例中， 所用的等鞭金藻多肽IZP-1由杭州丹港生物科技公司提供， 氨基 酸序列为Asn-Asp-Ala-Glu-Tyr-Gly-lle-Cys-Gly-Phe， 分子量为 807.95， 纯度为98， 保存温度-20， 使用时用超纯水配成所需浓度使用。 HepG2细胞由复旦IBS细胞资源中 心(FDCC)提供。 实施例中所用其他试剂见。
20、表 1。 0035 表1： 实验试剂 说 明 书 3/9 页 5 CN 109157647 A 5 0036 0037 0038 实施例1： 湛江等鞭金藻多肽IZP-1的提取 0039 1、 乙醇抽提湛江等鞭金藻蛋白质 0040 称取湛江等鞭金藻粉末， 在50下乙醇抽提4小时后， 通过真空过滤分离上清液和 沉淀物， 把蛋白质与糖、 脂类等分离， 将所得残留物作为第一次萃取再次提取， 所得萃取液 合并， 并通过真空蒸发器在40浓缩至干。 0041 2、 胃蛋白酶法水解蛋白质 0042 把乙醇抽提出来的蛋白质放入水中溶解， 分子量大的蛋白质溶于水中。 用胃蛋白 酶： 基质(1： 100)浓度为4，。
21、 在一个最佳的温度和搅拌速度下， 水解可溶性蛋白8小时。 然 后， 在100沸水浴锅中加热10min灭活胃蛋白酶， 取上清液， 置于-80冷冻干燥。 0043 3、 纯化湛江等鞭金藻多肽 0044 通过快速蛋白液相色谱分析法(FPLC)， 在20mM的醋酸钠缓冲液中， 把待分离的样 品加载到阴离子柱， 在一定流速下用0-2mol/L线性梯度的氯化钠(NaCl) 清洗柱内壁， 洗脱 液收集， 在280nm处检测， 统计数据。 选择具有最大抗氧化活性的部分， 通过反相高效液相色 谱法(RP-HPLC)进一步纯化， 定量测定湛江等鞭金藻多肽的氨基酸。 用C18(250mm20mm)的 反相层析柱， 。
22、在一定流速下， 用0- 50线性梯度的乙腈(含0.1三氟乙酸)清洗50min， 在 说 明 书 4/9 页 6 CN 109157647 A 6 215nm检测到洗脱液的吸收峰， 活跃的部分进一步加载到Synchropak RPP-100层析柱 (250mm4.6mm)。 在一定流速下， 用的0-20线性梯度的乙腈(含0.1三氟乙酸)清洗 20min。 0045 4、 测定湛江等鞭金藻多肽氨基酸序列 0046 用电喷雾电离源的Q-TOF质谱仪， 对纯化的多肽进行氨基酸序列分析。 纯化的湛江 等鞭金藻多肽溶解在甲醇/水(1 1， v/v)中后， 然后注入纳米级电喷雾源， 其分子质量在质 谱中的双。
23、电荷(M+2H)2+状态下测定。 分子质量测定完成后， 自动选择肽进行断裂， 其序列信 息通过串联质谱(MS)分析获得。 湛江等鞭金藻多肽 IZP-1的分子质量为1088.16， 氨基酸的 序列为： NDAEYGICGF(Asn-Asp-Ala-Glu- Tyr-Gly-lle-Cys-Gly-Phe)。 0047 实施例2： 湛江等鞭金藻多肽IZP-1的DPPH自由基清除能力的测定 0048 通过测定不同浓度梯度的湛江等鞭金藻多肽IZP-1的DPPH自由基清除率的测定， 判断IZP-1体外抗氧化活性的能力。 0049 溶液配制： 制备100 mol/L的DPPH溶液(95的乙醇溶解)、 1m。
24、mol/L样品溶液、 95 乙醇。 0050 按下表2设置空白组(A2)、 对照组(A3)、 实验组(A1)： 0051 表2： 实验设计 0052 0053 溶液混合后， 常温下遮光处理30min， 酶标仪测各孔A517nm吸光值， 按公式(1)计算 DPPH自由基的清除率。 0054 DPPH是一种暗紫色棱柱状结晶。 DPPH的自由基有单电子， 溶于醇溶液后呈紫色， 在 517nm处有最大吸收。 当体系中有自由基的清除剂时， 会与DPPH的单电子配对， 因此吸收逐 渐消失， DPPH的紫色褪色程度与接受的电子数成正比。 所以， 吸光值越低， DPPH的紫色褪色 程度越大， 说明自由基清除率。
25、越高。 表3为不同浓度梯度IZP-1的DPPH自由基清除率， IZP-1 浓度为10、 20、 50、 100 mol/L 时， 多肽的DPPH自由基清除率达到69以上， 因此湛江等鞭金 藻多肽IZP-1具有很好的抗氧化活性。 0055 表3： 湛江等鞭金藻多肽IZP-1的DPPH自由基清除率 0056 0057 实施例3： MTT法检测湛江等鞭金藻多肽IZP-1对HepG2细胞的毒性 说 明 书 5/9 页 7 CN 109157647 A 7 0058 用MTT方法检测细胞毒性， 通过不同浓度梯度的湛江等鞭金藻多肽IZP-1作用于 HepG2细胞24h， 检测IZP-1对HepG2细胞有无。
26、毒性的作用。 取对数生长期的HepG2细胞， 用 1mLPBS清洗细胞2次， 用0.5mL 0.25的胰蛋白酶消化1min， 加入11mL培养基调配成浓度为 1x105个/mL的细胞悬液， 接种到96孔板， 边缘孔用无菌PBS充填。 置于37、 5CO2培养箱 24h， HepG2贴壁生长。 吸出原培养基， 每孔加入100 LPBS， 清洗细胞一次。 实验中设置对照 组、 实验组， 每组设4个平行组， 按下表4不同浓度梯度的IZP-1处理24h， 吸出原培养基， 每孔 加入100 L MTT(1mg/mL)， 置于培养箱4h后取出， 小心地吸出上清液， 加入100 L DMSO， 遮 光、 溶。
27、解蓝紫色结晶10min， 酶标仪测定各孔A570nm吸光值。 0059 表4： 不同浓度梯度的IZP-1 0060 0061 MTT是一种染料， 能被活细胞中线粒体的琥珀酸脱氢酶还原， 且经细胞色素C作用 后， 黄色的MTT生成蓝紫色、 不溶于水的甲瓒， 二甲基亚砜(DMSO)可以溶解反应生成的甲瓒。 相反， 死细胞中不具有琥珀酸脱氢酶， 因此不会与MTT发生反应。 甲瓒在A570nm处有最大吸 收， 在正常情况下， 甲瓒的生成量与活细胞的数量成正相关， 因此可以根据吸光值(0D)推测 出活细胞的数量， 0D值越大细胞的相对活力越高。 图2为不同浓度梯度的IZP-1(0-100 mol/L)对。
28、HepG2细胞的毒性检测， IZP-1浓度为10、 20、 50、 100 mol/L， 各组细胞的相对活力 与对照组相比均无显著性差异(P0.05)， 所以湛江等鞭金藻多肽IZP-1对HepG2细胞没有毒 性。 0062 实施例4： MTT法筛选酒精对HepG2细胞氧化损伤的合适浓度 0063 用MTT方法检测不同浓度梯度的酒精对HepG2细胞氧化损伤24h的合适浓度， 建立 HepG2细胞酒精氧化损伤的模型。 实验中设置对照组、 实验组， 每组设 4个平行组， 按下表5 不同浓度梯度的酒精处理24h， 倒置显微镜观察并拍照记录细胞形态。 吸出原培养基， 每孔 加入100 L MTT(1mg。
29、/mL)， 4h后吸出上清液， 加入100 L DMSO， 遮光、 震荡溶解结晶10min， 酶 标仪测定各孔A570nm吸光值。 0064 表5： 不同浓度梯度的酒精 0065 0066 图3为不同浓度梯度的酒精(0-1.5mol/L)对HepG2细胞的活力影响， 随着酒精浓度 的增加， 细胞活性较对照组均有所下降。 酒精浓度为0.25mol/L时， 作用 24h后细胞的相对 活力大于67， 且与对照组相比差异显著(P0.05)； 酒精浓度为0.5mol/L时， 细胞的相对 活力为37， 且与对照组相比差异极显著(P0.01)； 酒精浓度为0.75mol/L时， 细胞的相对 活力为29， 且。
30、与对照组相比差异极显著 (P0.01)； 当酒精浓度为1、 1.25、 1.5mol/L时， 细胞的相对活力均小于19， 且与对照组相比差异极显著(P0.01)。 0067 图4为不同浓度梯度的酒精氧化损伤HepG2细胞在倒置显微镜下的形态特征， 酒精 浓度为0.25mol/L， 细胞小部分细胞缩小变圆， 未见明显的细胞形态变化； 酒精浓度为0.5、 说 明 书 6/9 页 8 CN 109157647 A 8 0.75mol/L， 细胞大部分缩小变圆、 贴壁性降低、 发亮， 有小部分细胞形态正常； 酒精浓度为 1、 1.25、 1.5mol/L， 细胞基本变圆、 发亮、 并有许多碎片。 酒精。
31、作用HepG2细胞24h， 随着酒精 浓度增大， HepG2细胞存活率降低。 当酒精浓度为0.75mol/L作用24h时， 细胞存活率接近 30， 大部分细胞缩小变圆、 贴壁性降低、 发亮， 所以选择0.75mol/L的酒精浓度作为诱导浓 度。 0068 实施例5： MTT法检测IZP-1对酒精损伤HepG2细胞的保护作用 0069 用MTT方法检测不同浓度的湛江等鞭金藻多肽IZP-1对0.75mol/L酒精诱导HepG2 细胞损伤的影响。 实验中设置空白组、 对照组、 实验组， 每组设4个平行组， 按下表4不同浓度 梯度的IZP-1处理1h后， 每孔加入浓度为0.75mol/L 的酒精， 倒。
32、置显微镜观察并拍照记录细 胞形态， 吸出原培养基， 每孔加入100 LMTT(1mg/mL)， 吸出上清液， 加入100 L DMSO， 遮光、 震荡溶解结晶10min， 酶标仪测定各孔A570nm吸光值。 0070 表4： 不同浓度梯度的IZP-1 0071 0072 图5为不同浓度梯度的湛江等金鞭藻多肽IZP-1(0-100 mol/L)对 0.75mol/L酒 精浓度氧化损伤HepG2细胞的活力影响， 培养基的酒精浓度为 0.75mol/L， 作用24h后细胞 的相对活力为30.28， 且与空白组相比差异显著 (P0.01)。 在0.75mol/L酒精浓度作用 24h下， IZP-1浓度。
33、为10、 20 mol/L， 细胞的相对活力分别为30.36、 40.32， 且与空白组相 比差异显著(P0.01)， 与对照组相比无差异显著(P0.05)； IZP-1浓度为50 mol/L， 细胞的 相对活力为 47.12， 且与空白组相比差异显著(P0.05)， 与对照组相比差异显著(P 0.05)； IZP-1浓度为100 mol/L， 细胞的相对活力为99.84， 且与空白组相比无差异显著 (P0.05)， 与对照组相比差异显著(P0.01)。 0073 图6为不同浓度梯度的湛江等金鞭藻多肽IZP-1对0.75mol/L酒精浓度氧化损伤 HepG2细胞在倒置显微镜下的形态， 对照组中。
34、添加酒精浓度为0.75mol/L 的细胞基本发亮、 变圆、 并有许多碎片。 IZP-1浓度为10、 20 mol/L， 细胞仍发亮、 变圆、 并有许多碎片状； IZP-1 浓度为50 mol/L， 小部分细胞缩小变圆、 贴壁性降低、 发亮； IZP-1浓度为100 mol/L， 未见 明显的形态变化。 随着IZP- 1浓度的上升， 细胞的相对活力逐渐上升， 细胞形态逐渐恢复， 表明湛江等金鞭藻多肽对酒精氧化损伤HepG2细胞具有保护作用。 0074 实施例6： DCFH-DA荧光探针检测ROS 0075 用DCFH-DA荧光探针检测不同浓度的湛江等鞭金藻多肽IZP-1对0.75mol/L 酒精。
35、 氧化损伤HepG2细胞内活性氧的水平。 每孔200 L细胞悬液， 实验中设置空白组、 对照组、 实 验组， 如实施例6方法处理细胞加药。 0076 溶液配制： 制备10 mol/L的DCFH-DA应用液。 0077 吸出24孔板中的旧培养基， 加入PBS充分摇匀3min， 清洗细胞3次， 每孔加入200 L 10 mol/L的DCFH-DA应用液后， 用铝箔纸遮光并置于培养箱孵育 20min； 吸出24孔板中的 试剂， 加入PBS充分摇匀4min， 清洗细胞3次后， 荧光倒置显微镜观察。 0078 荧光探针DCFH-DA本身无荧光， 可自由地透过细胞膜， 当其进入细胞后， 细胞内的 说 明 。
36、书 7/9 页 9 CN 109157647 A 9 酯酶会水解DCFH-DA生成DCFH。 而DCFH不可以通过细胞膜， 使荧光探针在细胞内很简单地被 装载。 细胞内的活性氧会使无荧光的DCFH被氧化成具有荧光的DCF。 检测细胞内DCF的荧光 强度就可判断活性氧的水平， 因此， DCF的荧光强度越强， 则细胞内活性氧的生成量越多。 图 7为在绿色荧光倒置显微镜下， 不同浓度梯度的湛江等鞭金藻多肽IZP-1对0.75mol/L酒精 氧化损伤HepG2细胞内活性氧的水平。 对照组中添加酒精浓度为0.75mol/L， 活性氧的生成 量很高， 大部分出现亮绿色荧光； IZP-1浓度为10、 20 。
37、mol/L， 活性氧的生成量仍很高， 出现 亮绿色荧光； IZP-1浓度为50 mol/L， 活性氧的生成量降低， 细胞中亮绿色荧光减弱； IZP-1 浓度为100 mol/L， 活性氧的生成量大量降低， 细胞中亮绿色荧光减弱， 与空白组细胞内的 活性氧的生成量相似。 随着IZP-1浓度上升， 活性氧的生成量逐渐降低， 细胞中亮绿色荧光 减弱， 表明湛江等金鞭藻多肽能降低酒精氧化损伤HepG2细胞内的活性氧的生成量。 0079 实施例7： 琼脂糖凝胶电泳 0080 1、 DNA提取 0081 取6瓶对数生长期的HepG2细胞， 把培养基分别分装到2个50mL的离心管， 用1mL PBS清洗细胞。
38、2次， 用0.5mL 0.25的胰蛋白酶消化1min， 加入培养基制成细胞悬液， 离心 1000rpm10min； 弃上清液， 加入10mLPBS(含5mM EDTA)， 放入冷冻离心机1000rpm10min 离心； 弃上清液， 加入350 L0.2mol/L醋酸钠， 打匀， 并转移到1.5mL微量离心管中， 依次加 入25 L 10SDS， 10 L 10mg/mL 蛋白酶K， 25 L 0.5mg/mL RNAase， 37涡旋45min。 0082 在1.5mL离心管中加入410 L苯酚： 氯仿： 异戊醇(25 24 1)， 涡旋30s， 震荡、 混匀， 离心12000rpm10min。
39、； 提取上层清夜中的DNA， 加入无水乙醇(- 20， 15min)， 震荡、 混匀， 离心12000rpm5min； 弃上清液， 在37干燥箱中完全干燥， 加入50 LTE溶液， DNA提取完 成。 0083 2、 DNA琼脂糖凝胶电泳 0084 用琼脂糖凝胶电泳实验观察湛江等鞭金藻多肽IZP-1对HepG2细胞DNA氧化损伤的 保护作用。 羟基自由基(OH)会与DNA的碱基发生加成反应， 引起DNA 的损伤。 通过芬顿 (Fenton)反应： 在金属离子(Fe2+)的催化作用下， H2O2会裂解产生OH和OH-， 可以提高细胞 中羟基自由基的含量， 营造一个氧化损伤的环境， 按下表5， 设。
40、置空白组、 对照组、 实验组， 检 测IZP-1对HepG2细胞DNA氧化损伤是否具有保护作用， 反应式如下21： 0085 Fe2+H2O2Fe3+OH-+OH 0086 溶液配制： 制备1琼脂糖凝胶(6mL)、 1TAE溶液(500mL)、 130mmol/L EDTA、 0.1mmol/L H2O2、 300 mol/L FeSO4、 1mmol/L样品溶液。 0087 表5： 实验设计 说 明 书 8/9 页 10 CN 109157647 A 10 0088 0089 (注： 实验组中， 样品与DNA反应10min后加FeSO4、 H2O2， 对照和实验组中， 加FeSO4、 H2O。
41、2反应10min后加EDTA终止反应。 ) 0090 把500mL 1TAE溶液加入电泳槽中， 各组取16 L加入4 L6上样缓冲液混匀， 加 到凝胶上样孔， 100V电泳30min； 取出凝胶， Gold View溶液浸泡2h； 最后， 在凝胶成像分析仪 中观察结果。 0091 图8为DNA琼脂糖凝胶电泳实验的结果。 Gold View是一种核酸荧光染料， 会与DNA 结合， 使DNA在紫外照射下出现明亮的条带， 而且条带的亮度、 宽度与 DNA含量成正比。 对照 组中， DNA溶液中加入过氧化氢和硫酸亚铁， 与空白组相比， 可以明显看到空白组有亮带， 对 照组无亮带， 说明过氧化氢和硫酸亚。
42、铁产生羟基自由基对HepG2细胞的DNA会造成氧化损 伤； 实验组中， 当湛江等鞭金藻多肽IZP-1浓度为10 mol/L时， DNA亮带只有少量， 说明10 mol/L的IZP-1对氧化损伤HepG2细胞的DNA的保护作用很弱； 当IZP-1浓度为20、 50、 100 mol/L时， DNA亮带均逐渐加亮和加宽， 说明IZP-1对氧化损伤HepG2细胞的DNA 具有保护作 用， 而且随着IZP-1浓度增大， DNA含量均逐渐增加， 表明湛江等鞭金藻多肽IZP-1对氧化损 伤HepG2细胞的DNA具有保护作用。 0092 本发明探究了湛江等鞭金藻多肽IZP-1对酒精诱导HepG2细胞氧化应激。
43、损伤的保 护作用， 实验中建立0.75mmol/L的酒精性肝损伤模型。 在酒精作用下， 细胞出现缩小变圆、 发亮、 贴壁性降低， 细胞的相对活力下降、 细胞内活性氧增加并对细胞的DNA造成损伤； 实验 数据表明， IZP-1为10 mol/L时， 对酒精氧化应激损伤的HepG2细胞未起到明显的保护作用； 但随着多肽浓度的增加， 细胞的相对活力上升、 细胞内活性氧减少、 细胞的DNA含量增加， 表 现出多肽对细胞的保护作用， 结合IZP-1的自由基清除率和细胞的形态可以看出100 mol/L 多肽能很好保护细胞免受酒精氧化应激损伤， 与正常细胞状态相似。 以上的实验结果表明 湛江等鞭金藻多肽IZ。
44、P-1具有抗氧化作用， 可以治疗和预防酒精性肝损伤， 对保肝的功效显 著。 IZP-1是湛江等鞭金藻的深加工产品， 充分利用海洋微藻的生物活性作用。 0093 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和 原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 9/9 页 11 CN 109157647 A 11 图1 图2 说 明 书 附 图 1/4 页 12 CN 109157647 A 12 图3 图4 说 明 书 附 图 2/4 页 13 CN 109157647 A 13 图5 图6 说 明 书 附 图 3/4 页 14 CN 109157647 A 14 图7 图8 说 明 书 附 图 4/4 页 15 CN 109157647 A 15 。