使用于炎症性肠疾病治疗和预防的透明质酸混合物.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102114031 A (43)申请公布日 2011.07.06 CN 102114031 A *CN102114031A* (21)申请号 201010513136.4 (22)申请日 2010.10.15 12/651,712 2010.01.04 US 12/851,031 2010.08.05 US A61K 31/728(2006.01) A61P 1/00(2006.01) A61P 1/04(2006.01) (71)申请人 禾伸堂生技股份有限公司 地址 中国台湾台北市内湖区环山路二段 56 号 1 楼 (72)发明人 吴宗忠 (74)专利代理机构 中科。

2、专利商标代理有限责任 公司 11021 代理人 周长兴 (54) 发明名称 使用于炎症性肠疾病治疗和预防的透明质酸 混合物 (57) 摘要 一种使用于炎症性肠疾病治疗和预防的透 明质酸混合物， 其中至少包含有两种或两种以上 的透明质酸所混合， 该两种或两种以上的透明质 酸主要在于具有不同的重量平均分子量， 即两种 或两种以上的透明质酸具有不同的流变， 兼具组 织支架与隔绝功能和在溶液中的降解性， 所得的 透明质酸混合物具有较佳的疗效与时效性， 用以 针对在炎症性肠疾病， 如 ： 溃疡性结肠炎、 急性肠 炎、 慢性肠炎、 克隆氏症、 肠躁症或肠胃的伤口愈 合的治疗与预防， 达到兼顾治疗速效及缓效。

3、的作 用。 (30)优先权数据 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 11 页 附图 1 页 CN 102114032 A1/1 页 2 1. 一种使用于炎症性肠病治疗和预防的透明质酸混合物， 包括有至少两种或两种以上 具低重量平均分子量的透明质酸及具高重量平均分子量的透明质酸所形成的透明质酸混 合物， 其中， 该低重量平均分子量的透明质酸的重量平均分子量为 50 万至 150 万道尔顿， 而该高重量平均分子量的透明质酸的重量平均分子量为 150 万至 500 万道尔顿， 且低重 量平均分子量的透明质酸和高重量平均分子量。

4、的透明质酸的混合重量比例为 20 80 至 80 20。 2. 如权利要求 1 所述的使用于炎症性肠病治疗和预防的透明质酸混合物， 其中， 该高 重量平均分子量的透明质酸为 150 万至 350 万道尔顿高重量平均分子量的透明质酸。 3. 如权利要求 1 所述的使用于炎症性肠病治疗和预防的透明质酸混合物， 其中， 该高 重量平均分子量的透明质酸为 200 万道尔顿高重量平均分子量的透明质酸。 4. 如权利要求 1 所述的使用于炎症性肠病治疗和预防的透明质酸混合物， 其中， 该低 重量平均分子量的透明质酸为 100 万道尔顿低重量平均分子量的透明质酸。 5. 如权利要求 1 所述的使用于炎症性肠。

5、病治疗和预防的透明质酸混合物， 其中， 该低 重量平均分子量的透明质酸和高重量平均分子量的透明质酸的混合重量比例可为 1 1。 6. 如权利要求 1 所述的使用于炎症性肠病治疗和预防的透明质酸混合物， 其中， 该透 明质酸混合物浓度为 0.5 毫克 / 毫升至 50 毫克 / 毫升。 7. 如权利要求 6 所述的使用于炎症性肠病治疗和预防的透明质酸混合物， 其中， 该透 明质酸混合物浓度为 0.5 毫克 / 毫升至 5 毫克 / 毫升。 8. 一种如权利要求 1 所述的使用于炎症性肠病治疗和预防的透明质酸混合物， 其中， 该透明质酸混合物可配合适当的赋型剂调剂成口服锭。 9. 一种如权利要求 。

6、1 所述的使用于炎症性肠病治疗和预防的透明质酸混合物， 其中， 该透明质酸混合物可配合适当的赋型剂调剂成肛门栓剂、 直肠栓剂或灌注液。 10. 如权利要求 1 所述的使用于炎症性肠病治疗和预防的透明质酸混合物， 其中， 进一 步并用类固醇、 免疫抑制剂或抗发炎药品。 11. 一种使用如权利要求 1 所述的使用于炎症性肠病治疗和预防的透明质酸混合物于 制造供预防或治疗溃疡性结肠炎、 急性肠炎、 慢性肠炎、 肠躁症或克隆氏症的药品的用途。 12. 一种使用如权利要求 1 所述的使用于炎症性肠病治疗和预防的透明质酸混合物于 制造供肠胃的伤口愈合的药品的用途。 权 利 要 求 书 CN 1021140。

7、31 A CN 102114032 A1/11 页 3 使用于炎症性肠疾病治疗和预防的透明质酸混合物 技术领域 0001 本发明提供一种使用于炎症性肠病 (inflammatory bowel disease， 简称 IBD) 治 疗和预防的透明质酸混合物， 尤其指利用至少两种或两种以上具不同的重量平均分子量 (Mw) 及具不同的流变的透明质酸所混合， 所得的透明质酸混合物具合适的黏附力、 隔绝力、 组织支架功能和疗效时间， 用以针对炎症性肠病 ( 包括溃疡性结肠炎、 克隆氏症， Crohn s disease) 的治疗与预防， 达到兼顾治疗速效及缓效的作用。 背景技术 0002 高分子透明质。

8、酸 (hyaluronan) 又称玻尿酸， 涵盖透明质酸 (hyaluronic acid)、 其药理可接受的盐 (hyaluronate) 或泛称的为透明质酸， 并简称为 HA， 以 下统称的为透明质酸， 是一种天然葡糖胺聚醣 (glycosaminoglycan)， 包含交替的 N- 乙 酰 -D- 葡萄糖胺基 (N-acetyl-D-glucosamine) 及 D- 葡萄糖醛酸基 (glucuronic acid moiety)。 0003 通常以其钠盐形态存在的透明质酸巨分子是已知超过 50 年的化合物。首先， 据 Meyer and etalJ.Biol.Chem.107， 629。

9、(1934 年 )所载透明质酸本质上是包含交替 1-3 尿甘酸及 1-4 葡萄糖胺部份的高黏度聚葡萄糖胺， 其重量平均分子量 (Mw) 介于 50,000 道尔顿 (Dalton， 简称 Da) 与几百万道尔顿 (Da) 之间。 0004 透明质酸存在于哺乳类动物体的软结缔组织中 ； 而其中又以皮肤、 眼睛的玻璃状 体、 关节液、 脐带以及软骨组织具有较高含量的透明质酸。 0005 透明质酸水溶液为黏弹性流体， 填充于细胞与胶原纤维空间的中且覆盖在某些 表皮组织上。在动物体， 其主要功能乃保护及润滑细胞， 调节细胞在此黏弹性基质上的移 动， 稳定胶原网状结构及保护它免于受到机械性的破坏。因为透。

10、明质酸为天然性润滑以 及吸震高分子， 在肌腱、 肌腱鞘及黏滑膜表面可作为润滑剂。另外， 透明质酸也有助于组 织流体力学， 运动和细胞的增殖， ( 参照 Delpech， B.， Girard， N.， Bert rand， P.， Courel， M.-N.， Chauzy， C.， Delpech， A.， 1997 年 .Hyaluronan ： fundamental principles and applications in cancer.J.Intern.Med.242， 41-48， Rooney， P.， Kumar， S.， Ponting， J.， Wang， M.， 19。

11、95.The role of hyaluronan intumour neovascularization.Int.J.Cancer 60， 632-36， Entwistle J， Hall CL， Turley EA.Receptors ： regulatorsof signaling to the cytoskeleton.J Cell Biochem1996 年 ； 61 ： 569-77) 并参加了一些细胞表面受体相 互作用， 特别是其中包含主要受体 -CD44。CD44 的向上调控本身已被广泛接受为一种淋 巴球细胞活化的标记， ( 参照 Teder P， Vandivier RW，。

12、 JiangD， Liang J， Cohn L， Pure E， Henson PM， Noble PW.Resolution of lung inflammation by CD44.Science2002 年 ； 296 ： 155-158， Sheehan KM， DeLottLB， DaySM， DeHeer DH， Hyalgan hasa dose-dependent differential effect on macrophage proliferationand cell death.J Orthop Res2003 年 ； 21 ： 744-51)。 0006 透明质酸由。

13、细胞外基质的组织和修改而有创造和填补空间的能力， 广泛用于软组 说 明 书 CN 102114031 A CN 102114032 A2/11 页 4 织填充而能抑制与年龄有关的与光致性的皮肤老化， 而且还可用于矫正睑部脂肪代谢障 碍， 并防止再次发生增生性瘢痕或瘢痕疙瘩。 0007 此外透明质酸可用为眼科手术助剂或使骨关节炎患者减少膝盖和关节活动的疼 痛。 0008 近几年来， 透明质酸以其钠盐形态应用于临床治疗中， 主要范围于眼科、 皮肤科、 外科、 动脉治疗及化妆品中。透明质酸与碱金属离子、 碱土金属离子 ( 例如镁 )、 铝离子、 铵 离子及经取代铵离子形成的盐类可充作促进药物吸收的载。

14、体 ( 参阅比利时专利第 904,547 号 )。在透明质酸的重金属盐类中， 银盐被用为杀霉菌剂 ； 而金盐可用以治疗类风湿性关节 炎 ( 参阅世界智能财产权组织 (WIPO) 专利 WO87/05517)。 0009 特别是对股溃疡、 褥疮等具有治病作用的去质子透明质酸与周期表第 4 族金属离 子的复合体(错合物)， 诸如透明质酸锌及钴盐， 论述于匈牙利专利申请第203,372号中， 并 由外界使用已证实其疗效。 0010 加拿大 Bioniche 公司莫拉莱斯等氏美国专利第 5,888,986 号披露使用有效浓度 透明质酸治疗膀胱炎的方法及相关结构， 其中透明质酸具有重量平均分子量 (Mw。

15、) 不少于 20 万道尔顿 (Da)。在例子中， 只使用特定重量平均分子量 (Mw) 的透明质酸， 例如， 采用重 量平均分子量 (Mw)650 仟道尔顿 (kDa) 或 1,900 仟道尔顿 (kDa) 的透明质酸治疗膀胱炎， 但单一剂量的透明质酸无法兼顾治疗速效及持久效果。 0011 加拿大的彼得雷拉罗伯特约翰于美国专利申请案第 2005/0080037(A1) 披露用透 明质酸治疗急性和过度扭伤和应变， 其中透明质酸的重量平均分子量 (Mw) 仅介于 90 万道 尔顿 (Da) 120 万道尔顿 (Da)， 相同单一剂量的透明质酸无法兼顾治疗速效及持久效果。 0012 在2008年4月8。

16、日日本Seikagaku Kogyo株式会社提出的美国专利第7,354,910 号 - 发明名称 ：炎症性肠病的治疗药剂 (Agent for treating inflammatory bowel diseases)， 揭示重量平均分子量 (Mw) 在 600 仟道尔顿 (kDa) 至 1,200 仟道尔顿 (kDa) 的 透明质酸或其盐可治疗炎症性肠病。其中只用重量平均分子量 (Mw) 在 60 120 万道尔顿 (D a) 的透明质酸或其盐， 虽然拥有迅速蔓延以治疗炎症性肠病的特点， 但植入体内后其降 解速度怏， ( 参照 Thorn-ton MH， Johns DB， Campeau 。

17、JD， Hoehler F， diZerega GS.Human Reproduction 1998 年 ； 13 ： 1480-85.)， 而不能保持足够时间的疗效， 在临床上， 对于患者 的使用是很不方便。 发明内容 0013 发明人有鉴于上述的问题与缺失， 乃搜集相关数据， 经由多方评估及考虑， 并利用 从事于此行业的多年研发经验， 经由不断尝试与修改， 始设计出使用于炎症性肠病 (IBD) 治疗和预防的透明质酸的混合物。 0014 本发明的目的在于利用至少两种或两种以上具不同的重量平均分子量 (Mw) 药理 许可盐形式透明质酸的生物活性治疗消化性溃疡。由低重量平均分子量 (Mw) 的透。

18、明质酸 ( 简称 LMWHA) 和高重量平均分子量 (Mw) 的透明质酸 ( 简称为 HMWHA)， 分别具有不同的降 解率， 其中令重量平均分子量(Mw)为50万150万道尔顿(Da)为低重量平均分子量(Mw) 的透明质酸 (LMWHA) ； 而重量平均分子量 (Mw) 为 150 万 500 万道尔顿 (Da) 为高重量平 均分子量(Mw)的透明质酸(HMWHA)， 达到具低重量平均分子量(Mw)的透明质酸(LMWHA)与 说 明 书 CN 102114031 A CN 102114032 A3/11 页 5 高重量平均分子量 (Mw) 的透明质酸 (HMWHA) 的混合物， 利用低重量平。

19、均分子量 (Mw) 的透 明质酸 (LMWHA) 可迅速覆盖性以治疗炎症性肠疾病 ( 如 ： 溃疡性结肠炎、 急性肠炎、 慢性肠 炎、 克隆氏症、 肠躁症 (IBS) 或肠胃的伤口愈合 ) 的特点， 和高重量平均分子量 (Mw) 的透明 质酸 (HMWHA) 具持久的降解可保持长时间的药效， 达到兼顾治疗速效及缓效的作用。 0015 本发明所使用的高重量平均分子量 (Mw) 透明质酸较佳地为 150 万 350 万道尔 顿 (Da) 的透明质酸 (HMWHA) ； 最佳地为 200 万道尔顿 (Da) 的高重量平均分子量 (Mw) 透明 质酸 (HMWHA)。本发明所使用的低重量平均分子量 (。

20、Mw) 透明质酸较佳地为 50 万 150 万 道尔顿 (Da) 的透明质酸 (LMWHA) ； 最佳地为 100 万道尔顿 (Da) 的低重量平均分子量 (Mw) 透明质酸 (LMWHA)。 0016 本发明的再一目的在于该低重量平均分子量 (Mw) 的透明质酸 (LMWHA) 与高重量 平均分子量(Mw)的透明质酸(HMWHA)的透明质酸混合物可并用类固醇、 免疫抑制剂或抗发 炎药品以增加疗效。 0017 本发明的另一目的在于以低重量平均分子量 (Mw) 的透明质酸 (LMWHA) 与高重量 平均分子量 (Mw) 的透明质酸 (HMWHA) 的透明质酸混合物为主成分， 依一般制药流程制作，。

21、 并配合适当的赋型剂制剂成口服锭(如肠溶锭)、 肛门栓剂(直肠栓剂)或灌注液(如直肠 或结肠灌注液 )。前述药品制剂是使用一般制剂技术予以完成。 0018 本发明的又一目的在于该低重量平均分子量 (Mw) 的透明质酸 (LMWHA) 与高重量 平均分子量 (Mw) 的透明质酸 (HMWHA) 的透明质酸混合物或其药理可接受的盐的浓度可为 0.5 毫克 / 毫升至 50 毫克 / 毫升， 较佳浓度可为 0.5 毫克 / 毫升至 5 毫克 / 毫升。但液剂 形式浓度为从 0.05 至 5 ( 重量 / 体积 )， 较佳浓度为从 0.05 至 0.5 ( 重量 / 体积 )。 0019 本发明治疗或。

22、预防制药的口服用量较佳为每次至少101,000毫克， 尤其最佳地 为每次至少约 10 至 500 毫克。 附图说明 0020 图 1 为治疗组大鼠结肠道临床病变与对照组临床病变平均值比较的相对恢复比 率程度 ( )。 具体实施方式 0021 本发明所采用的技术手段及其功效， 就本发明的最佳实施例详加说明其步骤与功 能如下， 以利完全了解。 0022 本发明的使用于炎症性肠疾病 (IBD) 治疗和预防的透明质酸混合物， 为包括有至 少两种或两种以上具低重量平均分子量 (Mw) 的透明质酸 (LMWHA) 和具高重量平均分子量 (Mw) 的透明质酸 (HMWHA) 的透明质酸所混合， 该高重量平均。

23、分子量及低重量平均分子量的 透明质酸可形成线状 (linear HA)、 交链状 (cross linked HA)、 上述至少其中之一或其组 合， 且该两种或两种以上具低重量平均分子量(Mw)及高重量平均分子量(Mw)的透明质酸， 主要在于利用不同的重量平均分子量 (Mw) 及于是有不同的流变， 组织支架与隔绝功能和 在溶液中的降解性， 所得的透明质酸混合物具较佳的的粘附力、 隔绝力， 组织支架功能及针 对在炎症性肠疾病 ( 如 ： 溃疡性结肠炎、 急性肠炎、 慢性肠炎、 肠躁症、 克隆氏症或肠胃的伤 口愈合 ) 的治疗与预防， 于是兼顾治疗速効及持久的药效时间。 说 明 书 CN 1021。

24、14031 A CN 102114032 A4/11 页 6 0023 且重量平均分子量(Mw)低于150万道尔顿(Da)为低重量平均分子量(Mw)的透明 质酸 (LMWHA)， 而较佳低重量平均分子量 (Mw) 范围可为 50 万至 150 万道尔顿 (Da) ； 另重量 平均分子量 (Mw) 高于 150 万道尔顿 (Da) 为高重量平均分子量 (Mw) 的透明质酸 (HMWHA)， 而高重量平均分子量(Mw)范围可为150万至500万道尔顿(Da)， 达到利用低重量平均分子 量 (Mw) 的透明质酸与高重量平均分子量 (Mw) 的透明质酸的混合物配方， 将通过具低重量 平均分子量 (Mw。

25、) 的透明质酸， 可迅速蔓延以治疗炎症性肠病的特点， 同时通过具高重量平 均分子量 (Mw) 的透明质酸可持久的降解性， 以保持较长时间的药効， 达到兼顾治疗速效及 缓效的作用。 0024 本发明所使用的高重量平均分子量 (Mw) 透明质酸较佳地为 150 万 350 万道尔 顿 (Da) 的透明质酸 (HMWHA) ； 最佳地为 200 万道尔顿 (Da) 的高重量平均分子量 (Mw) 透明 质酸 (HMWHA)。本发明所使用的低重量平均分子量 (Mw) 透明质酸较佳地为 50 万 150 万 道尔顿 (Da) 的透明质酸 (LMWHA) ； 最佳地为 100 万道尔顿 (Da) 的低重量平。

26、均分子量 (Mw) 透明质酸 (LMWHA)。 0025 本发明一较佳实施例， 该低重量平均分子量(Mw)的透明质酸(LMWHA)和高重量平 均分子量 (Mw) 的透明质酸 (HMWHA) 其混合比例可为 1 1. 但可依实际病况， 在 20 80 至 80 20 的范围内调整低重量平均分子量 (Mw) 的透明质酸 (LMWHA) 和高重量平均分子 量 (Mw) 的透明质酸 (HMWHA) 或其盐形式混合比例 ； 达到具比例较高的低重量平均分子量 (Mw) 透明质酸的透明质酸混合物， 意谓着偏重治疗时间速効， 而具比例较高的高重量平均 分子量 (Mw) 透明质酸的透明质酸混合物， 意味着偏重降。

27、解性持久功效。 0026 本发明另一较佳实施例， 该具低重量平均分子量(Mw)的透明质酸(LMWHA)与具高 重量平均分子量(Mw)的透明质酸(HMWHA)的透明质酸混合物可并用类固醇、 免疫抑制剂或 抗发炎药品以增加疗效。 0027 本发明又一较佳实施例， 是以低重量平均分子量(Mw)的透明质酸(LMWHA)与高重 量平均分子量 (Mw) 的透明质酸 (HMWHA) 的透明质酸混合物为主成分， 再依一般制药流程 制作， 并配合适当的赋型剂调剂成口服锭 ( 如 ： 肠溶锭 )、 肛门栓剂 ( 直肠栓剂 ) 或灌注液 ( 如 ： 直肠或结肠灌注液 )。此赋型剂包括但不限于明胶 (gelatin)。

28、、 胶原蛋白 (collagen)、 软骨素(chondroitin)、 卡波树脂(carbopol)、 洋菜(Agar)、 羧甲基纤维素(CMC)、 磷酸缓冲 盐生理食盐水 (phosphate buffer solution 简称 PBS)。 0028 当本发明给药途径以口服如 ： 口服肠溶锭(enteric coating tablet)时， 通过 肠溶锭在胃中较不被强酸溶解与消化， 会到达肠的部位才会逐渐被溶解与释出上述透明质 酸混合物， 并在发炎的结肠 ( 如约在上升 ( 结肠 ) 与横结肠位置 ) 形成保护膜， 达到加速发 炎部位的愈合以及兼顾治疗缓效的作用。 0029 当本发明给。

29、药途径以肛门栓剂 (suppository) 时， 经由肛门栓塞入上述透明质酸 混合物， 使上述透明质酸混合物会在直肠位置溶解后， 扩散到其它结肠位置 ( 如约在下降 结肠位置 )， 并在发炎的结肠形成保护膜， 达到加速发炎部位的愈合以及兼顾治疗缓效的作 用。 0030 当本发明给药途径以灌注液 如 ： 结肠灌注液 (enema) 时， 以上述透明质酸混 合物为主成分， 而配合适当的赋型剂， 此赋型剂包括但不限于明胶 (gelatin)、 胶原蛋白 (collagen)、 软骨素 (chondroitin)、 卡波树脂 (carbopol)、 洋菜 (Agar)、 羧甲基纤维素 说 明 书 C。

30、N 102114031 A CN 102114032 A5/11 页 7 (CMC)、 磷酸缓冲盐生理食盐水 (phosphate buffer solution 简称 PBS)， 上述至少其中之 一， 或者是上述相互结合所形成的组合物， 或含淀粉的悬浮液， 通过直接或利用辅助软管， 将上述透明质酸混合物的组合液灌入结肠位置， 并扩散到其它结肠位置 ( 如约在下降结肠 位置 )， 并在发炎的结肠形成保护膜， 达到加速发炎部位的愈合以及兼顾治疗缓效的作用。 0031 上述该低重量平均分子量 (Mw) 的透明质酸 (LMWHA) 与高重量平均分子量 (Mw) 的 透明质酸 (HMWHA) 的透明质。

31、酸混合物或其药理可接受的盐的较佳浓度可为 0.5 毫克 / 毫升 至 5 毫克 / 毫升 ； 而液剂形式较佳地为从 0.05 至 0.5 ( 重量 / 体积 )， 其药理可接受的盐 的浓度可为 0.5 毫克 / 毫升至 50 毫克 / 毫升， 较佳浓度可为 0.5 毫克 / 毫升至 5 毫克 / 毫 升 ； 液剂形式为从 0.05 至 5 ( 重量 / 体积 ) ； 而液剂形式较佳为从 0.05 至 0.5 ( 重量 / 体积 ) ； 此外， 口服时 ( 如调配成肠溶锭 )， 本发明治疗或预防药剂的用量较佳为每次至少 10 500 毫克， 而药学许可盐形式透明质酸例如 ： 透明质酸钠及透明质酸。

32、锌等。 0032 而且， 本发明低重量平均分子量 (Mw) 的透明质酸 (LMWHA) 与高重量平均分子量 (Mw) 的透明质酸 (HMWHA) 的透明质酸混合物可并用类固醇、 免疫抑制剂或抗发炎药品以增 加疗效。 0033 为证明本发明透明质酸混合物的功効。 此动物实验委托中国台湾动物科技研究所 执行动物实验， 其实验报告结果如下。 0034 功效实施例 1 ： 0035 1-1 ： 摘要 0036 本测试利用发炎性肠炎动物模式评估样本 IBD98 在动物体的功效， 预防组大鼠先 经肛门给予 IBD98 后， 再投与三硝基苯磺酸 (TNBS) 诱发肠炎病变， 然后连续 3 日经由肛门 给予样。

33、本 IBD98， 对照组仅给与 TNBS 诱发肠炎病变， 观察 3 日， 所有大鼠于给与 TNBS 后第 4 日牺牲检视临床病变， 给药前与牺牲时采集血液检测发炎指标。 结果显示， 预防组与对照组 的结肠发炎范围平均值各为3.9公分和4.3公分， 两者间无显著差异。 预防组与对照组大鼠 于给药前与牺牲时的 TNF-(Tumor NecrosisFactor-alfa) 和 IL-1(Interleukin-1) 浓度均有显著性差异， 显示大鼠确实被诱发产生发炎现象 ； 在牺牲时的 TNF- 浓度， 预防 组大鼠明显低于对照组大鼠， 具有显著性差异， 但 IL-1 浓度则无显著性差异。本测试确 。

34、认此模式可诱发动物肠炎病变， 在临床病变无明显差异， 因此可由投与 IBD98 样本的恢复 情形评估样本功效。实验结果， TNF- 在预防组与对照组之间具有显著差异， 如此可推论 样本 IBD98 对于 IBD 的预防， 确有降低发炎反应的效果。 0037 1-2 ： 测试程序 0038 A. 测试目的 ： 0039 利用TNBS诱发大鼠发炎性肠炎， 评估IBD98是否具有治疗或预防大鼠发炎性肠炎 或降低发炎的效果。 0040 B. 测试物质 ： 0041 IBD98， 由禾伸堂生技股份有限公司提供。此 IBD98 为包括有高重量平均分子量 及低重量平均分子量的透明质酸， 其中透明质酸的高重量。

35、平均分子量为 200 万道尔顿， 而 透明质酸的低重量平均分子量为 100 万道尔顿， 其混合比例为 1 1， 并溶解于 PBS 溶液到 0.5浓度。 0042 C. 试验方法 ： 说 明 书 CN 102114031 A CN 102114032 A6/11 页 8 0043 1. 实验动物 ： 0044 选取 30 头 8 周龄 SPF 等级 Sprague-Dawley 雄性大鼠， 分成两组， 每组 15 头大鼠， 每两头一笼饲养于台湾动物科技研究所啮齿类动物房。 0045 2. 动物试验 ： 0046 预防组大鼠于试验前先禁食24小时以上， 试验第1日， 将大鼠麻醉后， 经由肛门投 与。

36、 1 毫升 IBD-98， 1 小时后， 再由肛门投与 1 毫升 TNBS(50mg/mL)， 第 2 日到第 4 日每日由肛 门投与 1 毫升 IBD98， 第 5 日牺牲所有大鼠， 取结直肠部位观察临床病变。 0047 对照组大鼠于试验前先禁食24小时以上， 试验第1日， 将大鼠麻醉后， 经由肛门投 与 1 毫升 TNBS(50mg/mL)， 第 2 日到第 4 日每日由肛门投与 1 毫升 PBS， 第 5 日牺牲所有大 鼠， 取结直肠部位观察临床病变。 0048 3. 发炎指标检测 ： 0049 预防组与对照组大鼠于第1日试验前自尾静脉采血， 第5日牺牲时自心脏采血， 离 心后收集血清，。

37、 分别以酵素连结免疫吸附法 (ELISA) 检测血清中 TNF- 及 IL-1 的变化。 0050 1-3 ： 测试数据 0051 表 1. 预防组与对照组的大鼠的结直肠临床病变 0052 说 明 书 CN 102114031 A CN 102114032 A7/11 页 9 0053 表 2. 预防组与诱发肠炎组 ( 对照组 ) 给药前 (D1) 与给药四日后 (D5) 大鼠血清 中 TNF- 及 IL-1 的变化 0054 说 明 书 CN 102114031 A CN 102114032 A8/11 页 10 0055 ： 预防组大鼠 D5 与 D1 的血清中 TNF- 浓度具有极显著差。

38、异 (P 0.01)， 诱 发肠炎组亦同 (P 0.01)。 0056 ： 预防组大鼠 D5 与 D1 的血清中 IL-1 浓度具有显著差异 (P 0.05)， 诱发肠 炎组亦同 (P 0.05)。 0057 # ： 预防组与对照组 D5 的 TNF- 浓度具有显著差异 (P 0.05)。 0058 1-4 ： 测试结果 0059 本次取 30 头大鼠进行测试， 分成预防组与对照组两组， 每组 15 头大鼠， 试验前大 鼠禁食超过 24 小时， 给药前先以浣肠剂排空粪便， 第一天 (D1) 对照组给予 1mL TNBS， 随后 连续三天 (D2-D4) 投与 PBS ； 预防组第一天 (D1)。

39、 先给与 1mL TNBS 后 1 小时， 再投与 1m L IBD98， 随后连续三天 (D2-D4) 投与 IBD98。两组进行至第五天 D5， 大鼠牺牲解剖检视肠道 病变与发炎范围。 试验中途死亡大鼠不列入计算， 试验结束时， 预防组有13头， 对照组有12 头大鼠可进行分析。预防组与对照组的发炎范围平均值分别为 3.9 公分与 4.3 公分， 但无 说 明 书 CN 102114031 A CN 102114032 A9/11 页 11 明显差异 ( 参照表 1)。 0060 发炎指针 TNF- 平均浓度 (pg/mL) 于试验前 (D1) 与牺牲时 (D5)， 预防组自 21.3 升。

40、高到 759.3， 对照组自 12.3 升高到 1349.6， 两组 TNF- 平均浓度升高情形均有极显著差 异 (P 0.01) ； IL-1 平均浓度 (pg/mL) 于试验前 (D1) 与牺牲时 (D5)， 预防组自 3.3 升 高到 275.8， 对照组自 14.1 升高到 469.4， 两组 IL-1 平均浓度升高情形也有显著差异 (P 0.05)。显示在 TNBS 诱发的下， 本试验的大鼠确实出现发炎反应。比较两组连续处理 3 日后 (D5) 的发炎指针， TNF- 平均浓度在预防组为 759.3， 对照组为 1349.6， 两组之间具 有显著差异 (P 0.05)， 即预防组大鼠。

41、血清中的 TNF- 平均浓度明显低于对照组， 亦即经 过 IBD98 处理过的大鼠， 发炎情形较未处理者为低 ( 参照表 2)。 0061 1-5. 结论 0062 对照组诱发肠道发炎后不使用药物治疗， 预防组在使用 TNBS 的前先以 IBD98 处 理， 随后连续治疗 3 日， 对照组和预防组的发炎指标 TNF- 与 IL-1 浓度均有明显上升， 确认大鼠被诱发炎症反应。预防组的 TNF- 浓度明显低于对照组， 显示使用 IBD98 处理大 鼠发炎性肠炎， 确有降低发炎反应的效果。 0063 功效实施例 2 ： 0064 2-1 ： 摘要 0065 本测试利用发炎性肠炎动物模式评估样本 I。

42、BD98 在动物体的功效， 实验用大鼠 先以三硝基苯磺酸 (TNBS) 经肛门给药诱发肠炎病变， 三日后再经由肛门分别投予样本 IBD98( 治疗组 ) 与缓冲磷酸生理食盐水 (PBS)( 对照组 )， 连续处理七天， 再牺牲大鼠检视 临床病变， 结果显示治疗组投予样本 IBD98 的大鼠结肠发炎范围平均约为 1.25 公分， 对照 组投予缓冲磷酸生理食盐水的大鼠结肠发炎范围平均约为 1.875 公分， 比对治疗组与对照 组的相对恢复程度为 33， 显示使用 IBD98 处理大鼠发炎性肠炎 (IBD) 具有促进肠道组织 恢复的趋势。 0066 2-2 ： 测试程序 0067 A. 测试目的 ：。

43、 0068 利用TNBS诱发大鼠发炎性肠炎， 评估IBD98是否具有治疗或预防大鼠发炎性肠炎 或降低发炎的效果。 0069 B. 测试物质 ： 0070 IBD98， 由禾伸堂生技股份有限公司提供。 高平均重量分子量及低平均重量分子量 的透明质酸， 其中透明质酸的高重量平均分子量为 200 万道尔顿， 而透明质酸的低重量平 均分子量为 100 万道尔顿， 其混合比例为 7 3， 并溶解于磷酸缓冲盐生理食盐水到 0.5 的浓度。 0071 C. 试验方法 0072 1. 实验动物 ： 0073 选取 36 头 8 周龄 SPF 等级 Sprague-Dawley 雄性大鼠， 分成两组， 每组 1。

44、8 头大鼠， 每两头一笼饲养于中国台湾动物科技研究所啮齿类动物房。 0074 2. 动物试验 ： 0075 大鼠于动物试验前先禁食 24 小时以上， 动物试验第 1 日， 将大鼠麻醉后经由肛门 投与 1 毫升 tri-nitrobenzene sulphonic acid(TNBS， 50mg/mL)， 观察 3 天， 选取第 3 日仍 说 明 书 CN 102114031 A CN 102114032 A10/11 页 12 然出现软便与水样便的大鼠进行后续试验。 0076 治疗组于动物试验第 4 日到第 10 日， 麻醉后投与 1 毫升 IBD98(5mg/mL) ； 对照组 于动物试验第。

45、4日到第10日， 麻醉后投与1毫升PBS， 所有大鼠于动物试验第11日牺牲， 取 结直肠部位观察临床病变。 0077 2-3 ： 测试数据 0078 表 A. 对照组大鼠肠道临床病变 0079 0080 表 B. 治疗组大鼠肠道临床病变与相对恢复比率 0081 0082 相对恢复比率 ( ) ( 治疗组大鼠肠道发炎范围 - 对照组大鼠发炎范围平均 值 )/ 对照组大鼠发炎范围平均值 0083 2-4 ： 测试结果 说 明 书 CN 102114031 A CN 102114032 A11/11 页 13 0084 本次取 36 头大鼠进行测试， 分成治疗组与对照组两组， 每组 18 头大鼠， 。

46、测试前大 鼠禁食超过 24 小时， 给药前先以浣肠剂排空粪便， 再投与 TNBS， 随后观察三天， 观察期间有 2头大鼠死亡， 解剖5头大鼠确认肠道病变， 并剔除排便正常的大鼠， 选取第4日仍出现软便 与水样便的大鼠， 治疗组 (10 头大鼠 ) 连续七天 ( 第 4 日 - 第 10 日 ) 自肛门投与 IBD98 ； 对 照组 (7 头大鼠 ) 则连续七天投与 PBS， 试验期间治疗组与对照组各死亡一头， 试验第 11 日 牺牲全部大鼠， 解剖检视肠道病变与发炎范围。 0085 对照组有 1 头大鼠无病变， 3 头大鼠出现约 0.3-1 公分局部发炎与 1 级病变， 2 头 大鼠出现 2-。

47、2.5 公分局部发炎与 2 级病变 ( 参照表 A) ； 治疗组大鼠有 7 头出现约 0.3-1.5 公分的局部发炎与 1 级病变， 2 头大鼠出现约 2 公分的发炎与 2 级病变 ( 参照表 B)。统计 后发现， 对照组大鼠肠道发炎范围平均约为 1.875 公分， 治疗组肠道发炎范围平均为 1.25 公分， 治疗组大鼠对照组大鼠的相对愈合程度为 33 ( 参照表 B、 图 1)。 0086 综上所述， 本发明为主要利用至少两种或两种以上具不同重量平均分子量 (Mw) 的药理许可盐形式透明质酸所组成透明质酸混合物， 藉由低重量平均分子量 (Mw) 的透明 质酸(LMWHA)和高重量平均分子量(Mw)的透明质(HMWHA)， 分别具有不同的降解率， 达到低 重量平均分子量 (Mw) 的透明质酸 (LMWHA) 可迅速蔓延特点和高重量平均分子量 (Mw) 的透 明质酸 (HMWHA) 具持久的降解可保持长时间的药效， 达到兼顾治疗速效及缓效的作用， 惟， 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 自不能以此而局限本发明的专利范围， 因此运用 本发明说明书及附图内容所为的简易修饰及等效结构变化， 仍应同理包含于本发明申请的 权利要求范围内。 说 明 书 CN 102114031 A CN 102114032 A1/1 页 14 图 1 说 明 书 附 图 CN 102114031 A 。