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1、10申请公布号CN104127509A43申请公布日20141105CN104127509A21申请号201410350771322申请日20140722A61K36/704200601A61K47/42200601A61K47/1220060171申请人西安交通大学地址710049陕西省西安市咸宁西路28号72发明人张卉郭增军覃源芮李梦怡席可薛璇玑74专利代理机构西安通大专利代理有限责任公司61200代理人陆万寿54发明名称一种水酶法半仿生法提取虎杖中总蒽醌的方法57摘要本发明公开了一种水酶法半仿生法提取虎杖中总蒽醌的方法，包括以下步骤1称虎杖药材粉末，加入水解酶反应液，并调节至适宜PH值，。
2、搅拌均匀，酶解48H后高温灭活酶，过滤；2酶解后的虎杖药材中加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液调节PH值为1530，提取后过滤；3滤渣加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液调节PH值为6575，提取后过滤；4滤渣加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液调节PH值为8085，提取后过滤；5合并14滤液，浓缩并真空干燥，得到含有虎杖蒽醌的提取物。本方法避免使用有机溶剂，与其他辅助提取方法，如微波提取、超声提取相比，提取率高，提取设备简单，提取条件温和，是一种环境友好，适宜工业化生产的提取方法。51INTCL权利要求书1页说明书6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页10申请公布号CN104127。
3、509ACN104127509A1/1页21一种水酶法半仿生法提取虎杖中总蒽醌的方法，其特征在于，包括以下步骤1首先，取虎杖粉末，按1G520ML的料液比向虎杖粉末中加入水解酶反应液，充分混匀，调节PH值至4055，然后在4555的搅拌条件下，酶解48小时，再经高温灭活酶处理，最后进行过滤；其中，每100ML水解酶反应液是按照每100ML蒸馏水中加入125MG纤维素酶的比例将纤维素酶溶解于蒸馏水中制成；2向步骤1过滤后的滤渣中加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液，充分混匀，调节PH值至1530，水浴提取后过滤；3向步骤2过滤后的滤渣中加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液，充分混匀，调节PH值至6575，水浴提取后。
4、过滤；4向步骤3过滤后的滤渣中加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液，充分混匀，调节PH值至8085，水浴提取后过滤；5将步骤14过滤得到的滤液合并，回收溶剂后干燥处理，得到的得到包含虎杖总蒽醌的干浸膏。2根据权利要求1所述的一种水酶法半仿生法提取虎杖中总蒽醌的方法，其特征在于，步骤1所述的高温灭活酶处理是将酶解处理后的反应体系的水浴温度升高至80，加热10MIN。3根据权利要求1所述的一种水酶法半仿生法提取虎杖中总蒽醌的方法，其特征在于，步骤2、3、4中滤渣与柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液的反应料液比为1G1022ML。4根据权利要求1所述的一种水酶法半仿生法提取虎杖中总蒽醌的方法，其特征在于，步骤2、3、4所。
5、述的水浴提取温度为5080。5根据权利要求1所述的一种水酶法半仿生法提取虎杖中总蒽醌的方法，其特征在于，步骤2、3、4所述的水浴提取时间为13H。6根据权利要求1所述的一种水酶法半仿生法提取虎杖中总蒽醌的方法，其特征在于，步骤5所述的回收溶剂后干燥处理是将合并后的滤液减压浓缩后在6080下进行真空干燥处理。7根据权利要求16中任意一项所述的一种水酶法半仿生法提取虎杖中总蒽醌的方法，其特征在于，所述虎杖粉末是将虎杖药材清洗干净后，经粉碎过筛、烘干至恒重后制得。权利要求书CN104127509A1/6页3一种水酶法半仿生法提取虎杖中总蒽醌的方法技术领域0001本发明属于天然产物提取技术领域，涉及一。
6、种蒽醌的提取方法，具体涉及一种水酶法半仿生法提取虎杖中总蒽醌的方法。背景技术0002虎杖为蓼科廖属植物虎杖的根和根茎，是我国传统中药，味苦性寒，有活血定痛、清热利湿、化痰止咳等功效。临床用于湿热黄疸、肺热咳嗽、疮痈肿痛、跌打损伤等症。虎杖中主要含有蒽醌类、芪类、黄酮、酚酸类成分，这些成分具有抗菌、抗血栓、降脂等重要生理活性。虎杖蒽醌是其重要抗菌成分，其提取多采用有机溶剂提取，成本高、环境污染大，还有用微波提取、超声提取，对设备要求高。因此，开发以水为溶媒的环境友好的提取方式具有重要意义。0003水酶法是一种较为高效环保的提取方法，但是提取效率不高，一定程度上造成了药材资源的浪费。半仿生提取法是。
7、模拟药物进入胃肠道环境，从生物药剂学的角度设计的一种新的提取工艺。发明内容0004本发明的目的在于提供一种水酶法半仿生法提取虎杖中总蒽醌的方法，该方法将水酶法与半仿生法相结合用于虎杖中总蒽醌的提取，能够显著提高提取效率，操作简单，对设备要求低，适合工业化大规模生产的需求。0005本发明是通过以下技术方案来实现0006一种水酶法半仿生法提取虎杖中总蒽醌的方法，包括以下步骤00071首先，取虎杖粉末，按1G520ML的料液比向虎杖粉末中加入水解酶反应液，充分混匀，调节PH值至4055，然后在4555的搅拌条件下，酶解48小时，再经高温灭活酶处理，最后进行过滤；0008其中，每100ML水解酶反应液。
8、是按照每100ML蒸馏水中加入125MG纤维素酶的比例将纤维素酶溶解于蒸馏水中制成；00092向步骤1过滤后的滤渣中加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液，充分混匀，调节PH值至1530，水浴提取后过滤；00103向步骤2过滤后的滤渣中加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液，充分混匀，调节PH值至6575，水浴提取后过滤；00114向步骤3过滤后的滤渣中加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液，充分混匀，调节PH值至8085，水浴提取后过滤；00125将步骤14过滤得到的滤液合并，回收溶剂后干燥处理，得到的得到包含虎杖总蒽醌的干浸膏。0013步骤1所述的高温灭活酶处理是将酶解处理后的反应体系的水浴温度升高至80，加热10MIN。说。
9、明书CN104127509A2/6页40014步骤2、3、4中滤渣与柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液的反应料液比为1G1022ML。0015步骤2、3、4所述的水浴提取温度为5080。0016步骤2、3、4所述的水浴提取时间为13H。0017步骤5所述的回收溶剂后干燥处理是将合并后的滤液减压浓缩后在6080下进行真空干燥处理。0018所述虎杖粉末是将虎杖药材清洗干净后，经粉碎过筛、烘干至恒重后制得。0019与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果0020本发明采用水酶法结合半仿生法的方法从虎杖中提取总蒽醌，所采用的提取方法均不使用有机溶剂，避免了环境污染问题并降低了操作成本。在提取过程中首先加入水酶。
10、解反应液进行酶解处理，该水酶解反应液是将能够消解植物细胞壁的纤维素酶溶液蒸馏水中制成，在的搅拌条件下进行酶解，能够对虎杖药材的细胞壁进行最大限度的分解破坏，从而降低了传质阻力，更有利于有效成分的溶出。且在酶解时调节溶液PH值至酶的最适PH值4055，并采用最适反应温度4555，以利于酶发挥效用。酶解后更利于总蒽醌的提取，提高了提取效率。在半仿生法在提取过程中符合中药临床应用的特点，模拟口服药物在胃肠道转运吸收的过程。本发明采用柠檬酸磷酸氢二钠缓冲体系作为半仿生法的提取溶剂，通过设置不同的PH值梯度，达到模拟药物在体内转运吸收过程的目的。0021本发明采用的水酶法半仿生法提取虎杖中的总蒽醌，与超。
11、声辅助提取法和微波辅助提取法相比，提取率有明显提高，且对设备的要求低。本发明的提取条件温和、成本低廉、环境友好、适合大规模工业化生产，具有良好的应用前景。具体实施方式0022下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。0023实施例10024一种水酶法半仿生法提取虎杖中总蒽醌的方法，包括以下步骤00251虎杖药材的处理虎杖药材清洗干燥，粉粹过筛，烘干至恒重，得虎杖药材粉末；00262水酶法提取准确称取10G虎杖药材粉末，按1G16ML的料液比向虎杖粉末中加入水解酶反应液，混匀后，调节PH值至45，在搅拌条件下，于50水浴中酶解6小时，升高水浴温度至80，加热。
12、10分钟，冷却过滤；其中，所述水解酶反应液是按照每100ML蒸馏水中加入125MG纤维素酶的比例将纤维素酶溶解于蒸馏水中制成；00273半仿生法提取按照料液比1G18ML的料液比，向步骤1过滤的滤渣中加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液，调节PH值为20，搅拌均匀，在70水浴中提取2H后，过滤；滤渣按照以上料液比加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液调节PH值为75，70水浴提取2H后过滤；滤渣再次按照以上料液比加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液调节PH值为80，70水浴提取2H后过滤；00284将步骤2、3中过滤得到的所有滤液合并，在旋转蒸发仪上浓缩至流浸膏，而后在真空干燥箱中以60真空干燥，获得含有虎杖蒽醌的干浸膏70。
13、8G。说明书CN104127509A3/6页50029对虎杖蒽醌干浸膏中的大黄素含量进行测定00301、大黄素标准曲线的建立0031精密称取10MG大黄素标准品至100ML容量瓶中，加入甲醇0015MOL/L磷酸水溶液8020作溶剂定容至刻度，摇匀。分别精密量取上述标准溶液02ML、04ML、06ML、08ML、10ML、12ML至六个10ML容量瓶中，加入溶剂定容至刻度，摇匀，得到大黄素溶液浓度分别为0002MG/ML、0004MG/ML、0006MG/ML、0008MG/ML、0010MG/ML、0012MG/ML。用025M微孔滤膜过滤，分别进样20L，每个浓度进样3次。流动相为甲醇00。
14、15MOL/L磷酸水溶液8020，等度洗脱，紫外检测波长为284NM，色谱柱为DIAMONSILC185M,25046MM，流速为10ML/MIN。以平均峰面积值为纵坐标，大黄素浓度为横坐标，绘制标准曲线，获得线性方程为Y25415529X517393R209997，浓度范围为00020012MG/ML。00322、提取物中大黄素含量测定0033精密称取10MG上述干浸膏，至于10ML容量瓶中，加入流动相做溶剂定容至刻度，摇匀，过滤，进样20L，进样3次，求取平均值。测得干浸膏中大黄素含量为695MG/10G药材。00343、方法学考察00351精密度精密量取01MG/ML大黄素标准溶液1ML。
15、，置于10ML容量瓶中，加流动相溶液作为溶剂定容至刻度，摇匀，过滤，进样20L，重复进样6次。测得相对标准偏差RSD为127。00362重复性取上述提取浸膏10032MG，置于25ML容量瓶中，加流动相溶液定容至刻度，摇匀。再精密量取2ML上述溶液至10ML容量瓶中，加流动相溶液定容至刻度，摇匀，过滤，进样20L，重复进样5次。测得相对标准偏差为173。00373加标回收率精密称取上述提取浸膏19978MG，分别加入其中大黄素含量80，100及120的大黄素标准品，置于25ML容量瓶中，加流动相溶液定容至刻度，摇匀。再分别精密量取5ML该溶液置于50ML容量瓶中，加流动相溶液定容至刻度，摇匀，。
16、过滤。进样20L。按照如下公式计算加标回收率加标回收率加标试样测定值试样测定值/加标量100。最终计算获得加标回收率为10138，相对标准偏差为297。0038实施例20039一种水酶法半仿生法提取虎杖中总蒽醌的方法，包括以下步骤00401虎杖药材的处理虎杖药材清洗干燥，粉粹过筛，烘干至恒重，得虎杖药材粉末；00412水酶法提取准确称取10G虎杖药材粉末，按1G10ML的料液比向虎杖粉末中加入水解酶反应液，混匀后，调节PH值至45，在搅拌条件下，于50水浴中酶解7小时，升高水浴温度至80，加热10分钟，冷却过滤；其中，所述水解酶反应液是按照每100ML蒸馏水中加入125MG纤维素酶的比例将纤维。
17、素酶溶解于蒸馏水中制成；00423半仿生法提取按照料液比1G14ML的料液比，向步骤1过滤的滤渣中加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液，调节PH值为20，搅拌均匀，在80水浴中提取2H后，过滤；滤渣按照以上料液比加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液调节PH值为75，80水浴提取2H后过滤；滤渣再次按照以上料液比加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液调节PH值为80，80水浴说明书CN104127509A4/6页6提取2H后过滤；00434将步骤2、3中过滤得到的所有滤液合并，在旋转蒸发仪上浓缩至流浸膏，而后在真空干燥箱中以60真空干燥，获得含有虎杖蒽醌的干浸膏702G。0044对提取物中大黄素含量测定精密称取10MG上述干浸。
18、膏，至于10ML容量瓶中，加入流动相做溶剂定容至刻度，摇匀，过滤，进样20L，进样3次，求取平均值。测得干浸膏中大黄素含量为387MG/10G药材。0045实施例30046一种水酶法半仿生法提取虎杖中总蒽醌的方法，包括以下步骤00471虎杖药材的处理虎杖药材清洗干燥，粉粹过筛，烘干至恒重，得虎杖药材粉末；00482水酶法提取准确称取10G虎杖药材粉末，按1G15ML的料液比向虎杖粉末中加入水解酶反应液，混匀后，调节PH值至40，在搅拌条件下，于55水浴中酶解6小时，升高水浴温度至80，加热10分钟，冷却过滤；其中，每100ML水解酶反应液是按照每100ML蒸馏水中加入125MG纤维素酶的比例将。
19、纤维素酶溶解于蒸馏水中制成；00493半仿生法提取按照料液比1G22ML的料液比，向步骤1过滤的滤渣中加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液，调节PH值为20，搅拌均匀，在70水浴中提取15H后，过滤；滤渣按照以上料液比加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液调节PH值为75，70水浴提取15H后过滤；滤渣再次按照以上料液比加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液调节PH值为80，70水浴提取15H后过滤；00504将步骤2、3中过滤得到的所有滤液合并，在旋转蒸发仪上浓缩至流浸膏，而后在真空干燥箱中以60真空干燥，获得含有虎杖蒽醌的干浸膏783G。0051对提取物中大黄素含量测定精密称取10MG上述干浸膏，至于10ML容量瓶中，加入。
20、流动相做溶剂定容至刻度，摇匀，过滤，进样20L，进样3次，求取平均值。测得干浸膏中大黄素含量为334MG/10G药材。0052实施例40053一种水酶法半仿生法提取虎杖中总蒽醌的方法，包括以下步骤00541虎杖药材的处理虎杖药材清洗干燥，粉粹过筛，烘干至恒重，得虎杖药材粉末；00552水酶法提取准确称取10G虎杖药材粉末，按1G5ML的料液比向虎杖粉末中加入水解酶反应液，混匀后，调节PH值至50，在搅拌条件下，于45水浴中酶解8小时，升高水浴温度至80，加热10分钟，冷却过滤；其中，每100ML水解酶反应液是按照每100ML蒸馏水中加入125MG纤维素酶的比例将纤维素酶溶解于蒸馏水中制成；00。
21、563半仿生法提取按照料液比1G10ML的料液比，向步骤1过滤的滤渣中加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液，调节PH值为15，搅拌均匀，在50水浴中提取3H后，过滤；滤渣按照以上料液比加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液调节PH值为65，50水浴提取3H后过滤；滤渣再次按照以上料液比加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液调节PH值为83，50水浴提取3H后过滤；00574将步骤2、3中过滤得到的所有滤液合并，在旋转蒸发仪上浓缩至流浸膏，而后在真空干燥箱中以70真空干燥，获得含有虎杖蒽醌的干浸膏757G。说明书CN104127509A5/6页70058实施例50059一种水酶法半仿生法提取虎杖中总蒽醌的方法，包括以下步骤006。
22、01虎杖药材的处理虎杖药材清洗干燥，粉粹过筛，烘干至恒重，得虎杖药材粉末；00612水酶法提取准确称取10G虎杖药材粉末，按1G20ML的料液比向虎杖粉末中加入水解酶反应液，混匀后，调节PH值至55，在搅拌条件下，于55水浴中酶解4小时，升高水浴温度至80，加热10分钟，冷却过滤；其中，每100ML水解酶反应液是按照每100ML蒸馏水中加入125MG纤维素酶的比例将纤维素酶溶解于蒸馏水中制成；00623半仿生法提取按照料液比1G15ML的料液比，向步骤1过滤的滤渣中加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液，调节PH值为30，搅拌均匀，在80水浴中提取1H后，过滤；滤渣按照以上料液比加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液。
23、调节PH值为72，80水浴提取1H后过滤；滤渣再次按照以上料液比加入柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液调节PH值为85，80水浴提取1H后过滤；00634将步骤2、3中过滤得到的所有滤液合并，在旋转蒸发仪上浓缩至流浸膏，而后在真空干燥箱中以80真空干燥，获得含有虎杖蒽醌的干浸膏724G。0064对比例10065超声辅助提取法提取虎杖中总蒽醌的方法，包括以下步骤00661虎杖药材的处理虎杖药材清洗干燥，粉粹过筛，烘干至恒重，得虎杖药材粉末。00672超声辅助提取准确称取三份虎杖药材粉末各10G，按照料液比140加入蒸馏水，50预热20分钟后，采用超声辅助萃取，超声功率为10KW/M3，占空比为21，超声时间。
24、为1小时。重复提取3次，合并滤液。00683制作浸膏3次提取的滤液分别合并，在旋转蒸发仪上浓缩至流浸膏，而后在真空干燥箱中以60真空干燥，获得含有虎杖蒽醌的干浸膏的平均质量为331G。00694提取物中大黄素含量测定分别精密称取10MG上述干浸膏，至于10ML容量瓶中，加入流动相做溶剂定容至刻度，摇匀，过滤，进样20L，进样3次，求取平均值。测得干浸膏中大黄素含量为143MG/10G药材。0070对比例20071微波辅助提取法提取虎杖中总蒽醌的方法，包括以下步骤00721虎杖药材的处理虎杖药材清洗干燥，粉粹过筛，烘干至恒重，得虎杖药材粉末。00732微波辅助提取准确称取三份虎杖药材粉末各10G。
25、，按照料液比140加入蒸馏水，70预热20分钟后，采用微波辅助萃取，微波功率为480W，占空比为23，超声时间为20分钟。重复提取3次，合并滤液。00743制作浸膏3次提取的滤液分别合并，在旋转蒸发仪上浓缩至流浸膏，而后在真空干燥箱中以60真空干燥，获得含有虎杖蒽醌的干浸膏的平均质量为504G。00754提取物中大黄素含量测定分别精密称取10MG上述干浸膏，至于10ML容量瓶中，加入流动相做溶剂定容至刻度，摇匀，过滤，进样20L，进样3次，求取平均值。测得干浸膏中大黄素含量为197MG/10G药材。说明书CN104127509A6/6页80076从本发明的实施例和对比例相比，可以看出水酶法半仿生法提取虎杖药材粉末获得的浸膏得率最高，而且浸膏中大黄素的含量也最高。酶的应用和提取过程中PH值的梯度升高均可以促进有效物质的溶出，因而，本发明所提供的虎杖药材的提取新方法具有一定的优越性。说明书CN104127509A。