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1、10申请公布号CN104130437A43申请公布日20141105CN104130437A21申请号201410373258622申请日20140731C08J7/12200601A61L27/36200601A61L31/0020060171申请人苏州正海生物技术有限公司地址215000江苏省苏州市苏州工业园区星湖街218号生物纳米园B2楼205室72发明人孙先昌徐秀董佳桓郭松郭刚王彬74专利代理机构北京三聚阳光知识产权代理有限公司11250代理人赵敏54发明名称一种硬脑/脊膜生物补片材料及其制备方法和应用57摘要本发明提供了一种硬脑/脊膜生物补片材料及其制备方法和应用。所获得的生物补片材。
2、料特别适用于硬脑/脊膜缺损的修复，在植入人体或动物体内后，能够在体内保持6月2年时间内稳定不降解，当超过2年后会逐渐降解，保证具有一定力学性能以及防液体渗漏作用的同时还具有生物相容性，产生术后并发症以及副作用的风险大大降低，满足了对于用于修复硬脑/脊膜缺损材料的特殊要求。51INTCL权利要求书1页说明书8页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图2页10申请公布号CN104130437ACN104130437A1/1页21一种硬脑/脊膜生物补片材料的制备方法，其特征在于，包括取动物膜组织为原材料，并顺次置于表面活性剂溶液、碱液、过氧化物溶液、质量浓。
3、度为15WT的缩水甘油醚类环氧交联剂溶液以及磷酸盐缓冲液中进行浸泡的步骤，并将经上述各步骤浸泡后的所述膜组织材料冷冻干燥后经辐照灭菌，即得。2根据权利要求1所述的硬脑/脊膜生物补片材料的制备方法，其特征在于，所述缩水甘油醚类环氧交联剂溶液浸泡的步骤中，所述交联剂为丙三醇缩水甘油醚和/或乙二醇缩水甘油醚，所述浸泡时间为15H10D。3根据权利要求1或2所述的硬脑/脊膜生物补片材料的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂溶液浸泡的步骤中，所述表面活性剂的质量浓度为015WT，并控制所述溶液温度为025进行浸泡。4根据权利要求13任一所述的硬脑/脊膜生物补片材料的制备方法，其特征在于，所述碱液浸泡的步。
4、骤中，所述碱液的浓度为015MOL/L，并控制所述溶液温度为515进行浸泡。5根据权利要求14任一所述的硬脑/脊膜生物补片材料的制备方法，其特征在于，所述过氧化物溶液浸泡的步骤中，所述过氧化物溶液的质量浓度为15WT。6根据权利要求15任一所述的硬脑/脊膜生物补片材料的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液浸泡的步骤中，所述磷酸盐缓冲液的PH值为5080。7根据权利要求16任一所述的硬脑/脊膜生物补片材料的制备方法，其特征在于，所述辐照灭菌的步骤为电子束辐照灭菌，辐照计量为1030KGY。8根据权利要求17任一所述的方法制备得到的硬脑/脊膜生物补片材料。9权利要求8所述的硬脑/脊膜生物补片材料。
5、用于制备防止或减少组织粘连材料、用于修复受损的硬脑/脊膜组织的材料、治疗或预防因外伤或肿瘤造成的硬脑/脊膜损伤或缺损的材料、治疗或预防因硬脑/脊膜缺损引起的脑脊液漏、感染材料中的用途。10一种缩水甘油醚类环氧交联剂用于制备硬脑/脊膜生物补片材料的用途。权利要求书CN104130437A1/8页3一种硬脑/脊膜生物补片材料及其制备方法和应用技术领域0001本发明属于组织工程学医用生物材料技术领域，具体涉及一种硬脑/脊膜生物补片材料及其制备方法和应用。背景技术0002硬脑膜和硬脊膜分别是大脑与颅骨、脊柱与脊髓之间重要的功能膜组织，具有相同的生物学特征和功能。硬脑膜贴附颅腔内面，与颅盖连结疏松，与颅。
6、底结合紧密；硬脑膜在脑神经颅处向外延伸，移行而与神经的被膜结合，在枕骨大孔周缘向下延为硬脊膜。硬脑膜与硬脊膜的功能和结构是一致的，硬脑膜用于保护脑组织，硬脊膜用于保护脊髓组织。0003外伤、肿瘤、炎症、神经外科手术或其他脑颅脊柱疾病等均会造成硬脑/脊膜缺损。硬脑/脊膜的缺损会引起癫痫、脊液外漏、颅内感染、脑膜膨出和脑功能障碍等病症。如在颅底外科手术中，颅底硬脑膜相对薄且与颅底骨结合紧密，一旦出现缺损易造成脑脊液鼻漏和耳漏。颅底的脑膜瘤、脊索瘤等肿瘤常常侵蚀浸润到周围的颅骨和硬脑膜，在切除肿瘤手术时，切除的肿瘤通常也会附带部分脑膜和颅骨，造成术后发生脑脊液漏和颅内感染。0004为治疗硬脑/脊膜缺。
7、损，现有技术中常采用硬脑/脊膜替代材料植入缺损部分进行修复硬脑/脊膜缺损。随着医学技术的高速发展，硬脑膜替代材料越来越广泛的应用于脑凸面手术、创伤直接损伤、肿瘤的浸润、手术过程中硬脑膜切开减压以及一些先天性的因素造成的硬脑膜缺损等诸多方面，如在脑外科开颅手术患者中有1015需要硬脑/脊膜替代材料修复硬脑膜缺损，也有报道称该比例已经高达30。因此，为了满足临床需要，开展研究合适的硬脑/脊膜修复材料至关重要。0005但是，现有的硬脑/脊膜替代材料在使用的过程中往往存在诸多不足，常常引起严重的并发症问题。例如在硬脑/脊膜替代材料在植入体内后降解速度控制方面的问题，若硬脑/脊膜替代材料降解的速度过快，。
8、撕裂力下降，则导致防液体渗漏作用下降，引起硬脑/脊膜与周围组织粘连、感染、出血、脑脊液漏以及癫痫等病症；但是若硬脑/脊膜替代材料长时间不降解，则又导致其与组织再生不匹配，生物相容性差，更甚者易导致炎症反应、结缔组织增生包裹、感染及出血等问题。因此，对于硬脑/脊膜替代材料在植入人体或动物体内的降解速度方面的控制是非常重要的。0006然而，在以往以天然膜材料生产硬脑/脊膜替代材料的工艺中，当膜材料经过冻干辐照后，天然膜材料中的胶原蛋白会被大幅破坏，使膜材料撕裂力下降，以及为了能够更好脱去细胞和脂肪，使用的脱细胞、抗原和脂肪的试剂对膜的破坏相对较大，使天然膜材料的其他力学性能大幅降低，最终导致其降解。
9、速度加快，防液体渗漏作用下降。为了降低生物组织修复材料的降解速度，现有技术中通常采用交联剂处理膜材料，提高其力学性能，降低其降解速度，使其在人体或动物体内能够长时间不降解。但是对于用于修复硬脑/脊膜缺损的替代材料来说，由于其特殊的生理位置以及功能决定了现有技术中用于处理其他部位的组织修复材料或硬脑/脊膜缺损的替代材料中的交联剂并不适用于硬脑/脊膜补片材料，主要存在的问题包括1交联剂处理后，修复材料在人体或动物体内长时间不降解，说明书CN104130437A2/8页4导致其在植入人体或动物体内后，生物相容性差，易产生不利的副作用；2交联剂的稳定性低，大多数交联剂都具有比较容易反应的基团，这种基团。
10、导致交联剂不稳定，进而导致修复材料在人体或动物体内短时间内即降解，导致修复材料防液体渗漏作用下降，进而引发一系列术后并发症，带来不利的影响；3交联剂毒性高，难以控制交联剂最终在产品上的残留量，影响被植入的人或动物的身体健康。因此，现有技术中亟需开发一种更为适用于硬脑/脊膜修补降解性能要求的生物补片材料。发明内容0007为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中硬脑/脊膜替代材料植入人体后降解速度过快或过慢均不利于修复硬脑/脊膜缺损的问题，进而提供一种适用于硬脑/脊膜缺损修复降解要求的硬脑/脊膜生物补片材料，并公开其制备方法和应用。0008为解决上述技术问题，本发明提供了一种硬脑/脊膜生物补片。
11、材料的制备方法，包括取动物膜组织为原材料，并顺次置于表面活性剂溶液、碱液、过氧化物溶液、质量浓度为15WT的缩水甘油醚类环氧交联剂溶液以及磷酸盐缓冲液中进行浸泡的步骤，并将经上述各步骤浸泡后的所述膜组织材料冷冻干燥后经辐照灭菌，即得。0009所述的硬脑/脊膜生物补片材料的制备方法，所述缩水甘油醚类环氧交联剂溶液浸泡的步骤中，所述交联剂为丙三醇缩水甘油醚和/或乙二醇缩水甘油醚。0010所述的硬脑/脊膜生物补片材料的制备方法，所述缩水甘油醚类环氧交联剂溶液浸泡的步骤中，所述浸泡时间为15H10D。0011优选的，所述膜组织材料在浓度为24WT的交联剂中浸泡20H。0012更优选的，所述膜组织材料在。
12、浓度为2WT的交联剂中浸泡。0013所述的硬脑/脊膜生物补片材料的制备方法，所述含表面活性剂溶液浸泡的步骤中，所述表面活性剂的质量浓度为015WT，并控制所述溶液温度为025进行浸泡。0014所述的硬脑/脊膜生物补片材料的制备方法，所述碱液浸泡的步骤中，所述碱液的浓度为015MOL/L，并控制所述溶液温度为515进行浸泡。0015优选的，在所述碱液浸泡的步骤中，膜组织材料加入至浓度为1MOL/L的氢氧化钠溶液中浸泡2H，并控制溶液温度为8。0016所述的硬脑/脊膜生物补片材料的制备方法，所述过氧化物溶液浸泡的步骤中，所述过氧化物溶液的质量浓度为15WT。0017优选的，在所述过氧化物溶液浸泡的。
13、步骤中，浸泡后的膜组织材料加入至浓度为2WT过氧化物溶液中浸泡处理15H。0018优选的，所述过氧化物溶液为过氧化氢溶液。0019所述的硬脑/脊膜生物补片材料的制备方法，所述辐照灭菌的步骤为电子束辐照灭菌，辐照计量为1030KGY。0020优选的，所述电子束的辐照计量为25KGY。0021优选的，在所述表面活性剂溶液浸泡的步骤中，所述表面活性剂为TRITONX_100、TWEEN80或TWEEN40中的至少一种。0022优选的，所述动物膜组织原材料为出生6个月以下的猪或牛的膜组织材料。0023所述磷酸盐缓冲液浸泡的步骤中，所述磷酸盐缓冲液的PH值为5080。说明书CN104130437A3/8。
14、页50024优选的，在所述磷酸盐缓冲液浸泡的步骤中，所述浸泡后的膜组织加入PH为68的磷酸盐缓冲液中浸泡至少5H。0025本发明提供了一种由上述的方法制备得到的硬脑/脊膜生物补片材料。0026本发明还提供了一种所述的硬脑/脊膜生物补片材料在制备防止或减少组织粘连材料、用于修复受损的硬脑/脊膜组织的材料、治疗或预防因外伤或肿瘤造成的硬脑/脊膜损伤或缺损的材料、治疗或预防因硬脑/脊膜缺损引起的脑脊液漏、感染材料中的应用。0027本发明还提供了一种缩水甘油醚类环氧交联剂用于制备硬脑/脊膜生物补片材料的用途。0028本发明所述的技术方案相比现有技术具有如下优势00291本发明所述的硬脑/脊膜生物补片材。
15、料制备方法，利用质量浓度为15WT缩水甘油醚类环氧交联剂浸泡处理膜组织材料，获得的生物补片材料特别适用于硬脑/脊膜缺损的修复，在植入人体或动物体内后，能够在体内保持6月2年时间内稳定不降解，当超过2年后即降解，保证具有一定力学性能以及防液体渗漏作用的同时还具有生物相容性，产生术后并发症以及副作用的风险大大降低，满足了对于用于修复硬脑/脊膜缺损材料的特殊要求；00302本发明所述的硬脑/脊膜生物补片材料制备方法，通过选择丙三醇缩水甘油醚和/或乙二醇缩水甘油醚中为交联剂，不会增加该硬脑/脊膜生物补片本身的细胞毒性，降低其带来副作用的风险，在使用上述交联剂的补片，细胞毒性虽有略微提升，但是其提升幅度。
16、较小，可以忽略不计，并且其毒性都在0级范围内，并不会对被植入的人体或动物产生不利的影响；00313本发明所述的硬脑/脊膜生物补片材料制备方法，通过碱液以及表面活性剂配合使用获得的生物补片材料脂肪含量明显降低，大大提高了生物补片的安全性和有效性。附图说明0032为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中0033图1是未交联的膜材料的扫描电镜照片；0034图2是交联的膜材料的扫描电镜照片；0035图3为植入未交联的生物补片的对照组照片；0036图4为植入实施例1制备的硬脑/脊膜生物补片的试验组的照片；0037图5本发明实施例1制备的。
17、生物补片的HE染色图；0038图6为未使用硬脑/脊膜修复的对照组；0039图7为使用实施例1制备的硬脑/脊膜生物补片修复的试验组。具体实施方式0040实施例10041本实施所述的硬脑/脊膜生物补片的制备方法包括如下步骤00421取出生6个月以下的牛的膜组织为原材料，进行清洗，去除不适宜加工的部说明书CN104130437A4/8页6分，备用；00432取上述清洗后的膜组织加入质量浓度为01WT的TRITONX_100溶液中浸泡，震荡过夜，并控制溶液温度为0；00443取上述步骤浸泡后的膜组织加入浓度为5MOL/L的氢氧化钠溶液中浸泡2H，并控制溶液温度为15；00454取上述步骤浸泡后的膜组织。
18、加入质量浓度为1WT过氧化氢溶液中浸泡处理1H；00465取上述步骤浸泡后的膜组织加入浓度为1WT丙三醇缩水甘油醚中浸泡15H；00476随后取所述浸泡后的膜组织加入PH为50的磷酸盐缓冲液中浸泡至少5H；00487将上述步骤浸泡后的膜组织冷冻干燥，所述的冷冻干燥程序为产品预冻先降温至60以下后抽真空、升温，进入升华阶段；一次升华温度由35以下升至25，时间不少于6小时；一次升温温度由25升至15，时间为13小时；二次升温温度由15升至25，时间为13小时。随后以辐照计量为15KGY的电子束辐射灭菌，即得。0049实施例20050本实施所述的硬脑/脊膜生物补片的制备方法包括如下步骤00511取。
19、出生6个月以下的牛的膜组织为原材料，进行清洗，备用；00522取上述清洗后的膜组织加入质量浓度为5WT的TWEEN80溶液中浸泡，震荡过夜，并控制溶液温度为25；00533取上述步骤浸泡后的膜组织加入浓度为01MOL/L的氢氧化钾溶液中浸泡4H，并控制溶液温度为5；00544取上述步骤浸泡后的膜组织加入质量浓度为5WT过氧化物溶液中浸泡处理5H；00555取上述步骤浸泡后的膜组织加入质量浓度为1WT乙二醇缩水甘油醚中浸泡15H；00566随后取所述浸泡后的膜组织加入PH为80的磷酸盐缓冲液中浸泡至少5H；00577将上述步骤浸泡后的膜组织冷冻干燥，所述的冷冻干燥程序为产品预冻先降温至60以下后。
20、抽真空、升温，进入升华阶段；一次升华温度由35以下升至25，时间不少于6小时；一次升温温度由25升至15，时间在13小时；二次升温温度由15升至25，时间在13小时。随后以辐照计量为25KGY的电子束辐射灭菌，即得。0058实施例30059本实施所述的硬脑/脊膜生物补片的制备方法包括如下步骤00601取出生6个月以下的牛的膜组织为原材料，进行清洗，备用；00612取上述清洗后的膜组织加入质量浓度为2WT的含有TRITONX_100和TWEEN40溶液中浸泡，震荡过夜，并控制溶液温度为8；00623取上述步骤浸泡后的膜组织加入浓度为1MOL/L的氢氧化钠溶液中浸泡2H，并控制溶液温度为8；006。
21、34取上述步骤浸泡后的膜组织加入质量浓度为2WT过氧化物溶液中浸泡处理3H；00645取上述步骤浸泡后的膜组织加入质量浓度为2WT含有丙三醇缩水甘油醚和说明书CN104130437A5/8页7乙二醇缩水甘油醚的混合交联剂中浸泡20H；00656随后取所述浸泡后的膜组织加入PH为68的磷酸盐缓冲液中浸泡至少5H；00667将上述步骤浸泡后的膜组织冷冻干燥，所述的冷冻干燥程序为产品预冻先降温至60以下后抽真空、升温，进入升华阶段；一次升华温度由35以下升至25，时间不少于6小时；一次升温温度由25升至15，时间在13小时；二次升温温度由15升至25，时间在13小时。随后以辐照计量为30KGY的电子。
22、束辐射灭菌，即得。0067实施例40068本实施所述的硬脑/脊膜生物补片的制备方法包括如下步骤00691取出生6个月以下的牛的膜组织为原材料，进行清洗，备用；00702取上述清洗后的膜组织加入质量浓度为3WT的含有TRITONX_100和TWEEN80溶液中浸泡，震荡过夜，并控制溶液温度为0；00713取上述步骤浸泡后的膜组织加入浓度为1MOL/L的氢氧化钠溶液中浸泡4H，并控制溶液温度为8；00724取上述步骤浸泡后的膜组织加入质量浓度为4WT过氧化物溶液中浸泡处理4H；00735取上述步骤浸泡后的膜组织加入质量浓度为5WT含有丙三醇缩水甘油醚和乙二醇缩水甘油醚的混合交联剂中浸泡10D；00。
23、746随后取所述浸泡后的膜组织加入PH为80的磷酸盐缓冲液中浸泡至少5H；00757将上述步骤浸泡后的膜组织冷冻干燥，所述的冷冻干燥程序为产品预冻先降温至60以下后抽真空、升温，进入升华阶段；一次升华温度由35以下升至25，时间不少于6小时；一次升温温度由25升至15，时间在13小时；二次升温温度由15升至25，时间在13小时。随后以辐照计量为10KGY的电子束辐射灭菌，即得。0076对照例10077本实施例与实施例1的制备方法相同，其区别仅在于没有经过交联剂处理的步骤。0078对照例20079本实施例与实施例2的制备方法相同，其区别仅在于没有经过交联剂处理的步骤。0080对照例30081本实。
24、施例与实施例1的制备方法相同，其区别仅在于没有经过所述表面活性剂浸泡的步骤。0082对照例40083本实施例与实施例1的制备方法相同，其区别仅在于所用交联剂为戊二醛交联。0084效果例0085以下通过实验例来考察本发明下述相关实施例及对照例制备的硬脑/脊膜生物补片材料各项性能，进而证明本发明制备的硬脑/脊膜生物补片具有显著技术效果。00861、撕裂力测试0087试验方法使用拉伸压缩试验机，将按照实施例12、对照例12方法制备的生物补片材料，将样品剪成规格为1CM3CM的长条状，在离短边边缘35MM处用40号缝说明书CN104130437A6/8页8合线穿过样品，对折缝合线，在距离穿孔处约5CM。
25、处将缝合线打结，防止缝合线脱落；将上述方法得到的试样，用纯化水水化35分钟，将未穿线的一端固定在拉力试验机的下部，将穿线一端通过挂钩固定于拉力试验机的上部，开始检测，直至试样被撕裂，读取拉伸负荷力的最大值，即为本试样的撕裂力。结果见下表1以及图12。0088表1撕裂力测试结果0089测试组撕裂力N实施例11325实施例21065对照例1856对照例2735对照例410010090结论上表为三次试验共30片产品撕裂力的平均值，实施例1、2无论15KGY还是25KGY的剂量下，相对于无交联剂处理的对照例1、2的情况，撕裂力均有明显提升，提升比例分别为5479和4490，而相对于采用其他交联剂处理的。
26、对照例4，相对于无交联剂处理的对照例1、2的情况，同样撕裂力均有明显提升，提升比例分别为1694和3619。由于膜组织材料的胶原纤维无规编织而形成的纤维之间存在大量不规则的间隙，孔隙率主要取决天然胶原纤维的结构，交联剂会在胶原间形成新的键将胶原纤维拉紧引起膜材料的轻微收缩，从图12中对比可知，交联前后,生物补片的胶原纤维有明显的收缩，证明使用本发明的交联剂有交联效果，对膜的胶原纤维有一定的拉紧作用。00912、体外降解方面0092试验方法将按照实施例12、对照例34方法制备的生物补片分剪成1346MM大小的长条状，分别放置于试管中，加入一定量的生理盐水，放置在37中1D后，更换一次溶液，然后放。
27、置34D，取溶液根据医疗器械行业标准16886内的检测方法进行检测，试验结果见下表2。0093表2降解质量百分比0094测试组第一次取样第二次取样实施例13514实施例26224对照例115173对照例221876说明书CN104130437A7/8页9对照例441180095上面表格表明分别为15KGY和25KGY辐照剂量生物补片的降解质量百分比，通过比较可以看出在有交联剂作用的情况下，生物补片的降解速度明显下降。00963、体内降解方面0097试验方法将按照实施例1、对照例1、对照例4方法制备的生物补片，将上述制备的生物补片原位植入健康的大鼠体内，所述植入试验方法如下取20只雄性SD大鼠，。
28、34周龄，体重180220G，麻醉后皮下植入实施例1的生物补片，在对侧植入对照例1或对照例4的生物补片，每张材料1CM2，选取植入3个周、12个周、30个周后各5只大鼠处死，取所述植入区的周围组织用多聚甲醛固定照相。试验结果见表3以及图34，图3为对照例1的植入12个周后的小鼠照片，图4为实施例1的植入12个周后的小鼠照片，从图中可以看出，图3已完全降解，图4还有未降解的生物补片存在，且膜形态比较完整，膜与周围组织未发生粘连情况，降解时间明显比未交联或选用其他交联剂制备的生物补片延长。试验结果见下表3。0098表3体内降解试验结果0099测试组3个月12个月30个月实施例1未降解未完全降解完全。
29、降解对照例1未完全降解完全降解对照例4未降解未完全降解未完全降解01004、细胞毒性方面0101试验方法将按照实施例1、对照例1、对照例4的方法制备的生物补片进行浸提，制备浸提液；制备相应的细胞悬液；弃去原培养基，在96孔板中加入适当浓度的浸提液、阴性对照、阳性对照以及空白对照，置于37二氧化碳培养箱内分别培养24H、48H。在24H和48H后，观察细胞生长状况，弃去96孔培养板内的浸提液，并加入1MG/ML的MTT溶液50L。加入MTT溶液的96孔板置于37二氧化碳培养箱2小时。2小时后，弃掉96孔板中的MTT溶液，并加入异丙醇100L，震荡96孔板510MIN，测定其在492NM处的吸光度。
30、值。细胞毒性的检测方法是参照16886行业标准中细胞毒性检测中的MTT法进行的检测。结果见下表4，0102表4细胞毒性试验结果0103测试组观察期24H观察期48H实施例11031210407对照例11003110125说明书CN104130437A8/8页10对照例4920290840104上表为三次试验产品细胞毒性的平均值，可以清楚的看到实施例1使用交联剂制备的产品，细胞毒性有所降低，且都在0级范围内，相比于对照例1的细胞毒性实施例1的下降比例为280和279，细胞毒性变化不大，说明加入此交联剂后，不会增加产品本身的细胞毒性，然而相比于对照例1的细胞毒性对照例4的细胞毒性有一定的增加，且增。
31、加比例为901和1146，说明对照例4中所用交联剂有一定的细胞毒性。01055、脂肪含量方面0106试验方法将按照实施例1、对照例3方法制备的生物补片进行试验，脂肪含量的测定方法是依据中华人民共和国药典二部“胰酶脂肪检测”制定，测定结果见下表5。0107表5脂肪含量试验结果0108对照例3实施例1提升比例脂肪含量02700677770109上表为三次试验01G生物补片脂肪含量的平均值，可以清楚的看到本发明实施例1通过碱液NAOH和表面活性性剂TRIRONX100配合使用获得的生物补片，脂肪含量明显降低。01106、安全性和有效性011161安全性0112试验方法将本发明实施例1制备的生物补片进。
32、行HE染色处理，所述HE染色处理步骤如下将材料用梯度酒精下行入水，后用自来水和蒸馏水先后清洗，用05苏木素处理后用自来水清洗，再用1盐酸酒精分色后用自来水清洗，再用1/400的氨水促蓝后清洗，用1伊红染色后用80酒精分色，梯度酒精脱水，二甲苯透明后得到树脂封片。本发明实施例1制备的生物补片材料的HE染色图见图5，从图中可知，该生物补片没有细胞和细胞核残留，证明本发明的方法可以有效的脱去膜材料中的细胞等杂物，安全性高。011362有效性0114试验方法将本发明实施例1制备的生物补片植入健康白兔中作为试验组，以未使用硬脑脊膜修复的兔子作为对照组，所述试验方法如下麻醉兔子后，打开兔子头盖骨，破坏硬脑。
33、膜，加入生物补片替代硬脑膜，对照组不植入生物补片；然后将头盖骨复位，缝合伤口。定期查看实验结果，试验结果见图67，图6为未使用硬脑脊膜修复的对照组，图7为使用本发明实施例1制备的硬脑/脊膜生物补片的试验组照片，从图中可以看出两张图片的伤口都已经痊愈，但图6照片中疤痕较大，且有部分组织出现坏死现象，而图7照片中伤口恢复良好，且疤痕较小，伤口平滑，没有组织坏死现象，说明修复组织功能良好且无免疫排斥反应。0115显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。说明书CN104130437A101/2页11图1图2图3图4图5图6说明书附图CN104130437A112/2页12图7说明书附图CN104130437A12。