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1、10申请公布号CN104127408A43申请公布日20141105CN104127408A21申请号201410352969522申请日20140723A61K31/40200601A61P37/0620060171申请人暨南大学地址510632广东省广州市黄埔大道西601号72发明人邢飞跃于哲刘静郭中锋方志远74专利代理机构广州市华学知识产权代理有限公司44245代理人苏运贞陈燕娴54发明名称一种细菌源性吡咯烷类化合物在制备免疫抑制剂中的应用57摘要本发明属于生物医药领域，具体涉及一种细菌源性吡咯烷类化合物在制备免疫抑制剂中的应用。所述的细菌源性吡咯烷类化合物为ANISOMYCIN，其结构。
2、式如式1所示；所述的ANISOMYCIN能显著抑制淋巴结T细胞的活性及其生物学行为，抑制炎细胞分泌炎症因子，抑制组织移植排斥反应，作用优于临床常用的地塞米松和环磷酰胺。同时本发明还提供了一种细菌源性吡咯烷类化合物免疫抑制剂的制备方法，该方法制备的免疫抑制剂能大大提高药物的溶解度至20MG/ML，又能避免常规需要用乙醇12MG/ML或二甲基亚砜20MG/ML等溶剂溶解，毒副作用小，用药途径简单，易操作。51INTCL权利要求书1页说明书7页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图5页10申请公布号CN104127408ACN104127408A1/1页。
3、21一种细菌源性吡咯烷类化合物在制备免疫抑制剂中的应用，其特征在于所述的细菌源性吡咯烷类化合物为ANISOMYCIN，其结构式如式1所示2一种免疫抑制剂，其特征在于含有权利要求1所述的细菌源性吡咯烷类化合物。3权利要求2所述的免疫抑制剂的制备方法，其特征在于包含如下步骤1将10100MG细菌源性吡咯烷类化合物与053ML生理盐水或磷酸缓冲盐溶液混合；2在步骤1得到的溶液中缓慢滴加HCL溶液，并轻轻反复抽吸或搅拌直至细菌源性吡咯烷类化合物完全溶解时停止滴加HCL溶液；3在步骤2得到的溶液中滴加NAOH溶液，调整PH至7072；再用生理盐水或磷酸缓冲盐溶液补足溶液总体积至15ML，得到浓度为102。
4、0MG/ML的细菌源性吡咯烷类化合物免疫抑制剂；步骤1中所述的细菌源性吡咯烷类化合物为权利要求1所述的ANISOMYCIN。4根据权利要求3所述的免疫抑制剂的制备方法，其特征在于步骤2所述的HCL溶液的浓度为0530MOL/L。5根据权利要求4所述的免疫抑制剂的制备方法，其特征在于步骤2所述的HCL溶液的的浓度为1MOL/L。6根据权利要求3所述的免疫抑制剂的制备方法，其特征在于步骤3中所述的的NAOH溶液的浓度为0530MOL/L。7根据权利要求6所述的免疫抑制剂的制备方法，其特征在于步骤3中所述的的NAOH溶液的浓度为1MOL/L。8根据权利要求3所述的免疫抑制剂的制备方法，其特征在于步骤。
5、1、2中所述的磷酸盐缓冲盐溶液的PH为72，其组成如下NACL80G，KCL020G，NA2HPO412H2O3484G，NAH2PO412H2O020G，用三蒸水定容至1000ML。9根据权利要求3所述的免疫抑制剂的制备方法，其特征在于步骤1、2和3在无菌条件下操作。10根据权利要求3所述的免疫抑制剂的制备方法，其特征在于步骤1和3中所述的生理盐水和磷酸缓冲盐溶液经过无菌处理；步骤2中所述的HCL溶液经过无菌处理；步骤3中所述的NAOH溶液经过无菌处理。权利要求书CN104127408A1/7页3一种细菌源性吡咯烷类化合物在制备免疫抑制剂中的应用技术领域0001本发明属于生物医药领域，具体涉。
6、及一种细菌源性吡咯烷类化合物在制备免疫抑制剂中的应用。背景技术0002组织和器官移植手术后的排斥反应以及自身免疫性疾病的治疗，长久以来一直是医学界面临的难题。免疫抑制剂的应用在组织器官移植排斥反应和自身免疫性疾病的预防和治疗中有着极其重要的作用，但目前临床上使用的免疫抑制剂除了损伤造血、免疫系统及肝、肾和消化道功能，造成神经和内分泌功能紊乱等副作用外还面临着很多问题1缺乏选择性长期应用可降低机体的正常免疫应答,诱发感染。例如抗癌药物环磷酰胺、硫唑嘌呤等对所有增殖快的细胞均有杀伤作用，糖皮质激素抑制淋巴细胞增殖。2抑制强度不足免疫抑制剂抑制初次免疫应答的强度一般较再次免疫应答为高，因为建立中的免。
7、疫应答较已经建立的免疫病变容易干预。3诱导恶性肿瘤器官移植等病人长期应用免疫抑制剂，可使某些恶性肿瘤的发生率增加，其机制可能与某些免疫抑制剂引起染色体突变或激活内源性致癌病毒有关。4作用时机差异动物实验证明,免疫抑制剂的作用与抗原刺激的间隔时间和给药先后次序有很大关系。例如环磷酰胺在抗原攻击前给药，抑制了快速分裂的短寿抑制性T细胞，反而表现为免疫增强作用。5抗炎作用问题炎症本身就是一种免疫反应，免疫抑制剂多具有抗炎作用，而抗炎药物也可抑制免疫反应，如吲哚美辛可抑制前列腺素合成而影响免疫应答。理想的免疫抑制剂应该是选择性强、作用快速、效果明显、停药后作用可逆，不良反应少，不损伤机体正常免疫功能的。
8、药物。因此，人们在不懈地寻找高效、低毒、安全和有选择性的新的免疫抑制剂PFLUGHOEFTKJETALMODULATIONOFTHEBACILLUSANTHRACISSECRETOMEBYTHEIMMUNEINHIBITORA1PROTEASEJBACTERIOL2014,196242435；SCHMIDTCQETALRATIONALENGINEERINGOFAMINIMIZEDIMMUNEINHIBITORWITHUNIQUETRIPLETARGETINGPROPERTIESJIMMUNOL2013,19011571221。0003ANISOMYCIN是从链霉菌属STREPTOMYCES的培。
9、养液中分离得到的细菌组份分子式为C14H19NO4，分子量2653，能够通过与60S核糖体亚单位结合、阻断肽键形成从而阻止肽链延长和导致多核糖体降解，最终抑制蛋白质和DNA合成。ANISOMYCIN最初被视为抗真菌和抗阿米巴原虫的抗生素，之后发现ANISOMYCIN能够激活丝裂原活化蛋白激酶家族成员P38和CJUN氨基末端激酶，因而常被作为丝裂原活化蛋白激酶信号通路的激活剂TANGZL,XINGFYETALINVIVOTOXICOLOGICALEVALUATIONOFANISOMYCINTOXICOLLETT,2012,2081111。国外学者近来发现它与健忘症、创伤后记忆恢复及学习等关系密切。
10、，又被广泛用于中枢神经记忆系统中的研究SHARMAAV,ETALNEUROSILENCEPROFOUNDSUPPRESSIONOFNEURALACTIVITYFOLLOWINGINTRACEREBRALADMINISTRATIONOFTHEPROTEINSYNTHESISINHIBITORANISOMYCINJNEUROSCI,2012,327237787；GUOXETALEPIGENETIC说明书CN104127408A2/7页4MECHANISMSOFAMYLOIDPRODUCTIONINANISOMYCINTREATEDSHSY5YCELLSNEUROSCIENCE2011,194272。
11、81。发明内容0004本发明的目的在于克服现有技术中免疫抑制用药剂量高、药效不理想、对移植组织和器官缺乏选择性，且对造血系统、消化系统、免疫系统、神经和内分泌系统的毒副作用大的缺点和不足，提供一种细菌源性吡咯烷类化合物在制备免疫抑制剂中的应用。0005本发明的目的通过下述技术方案实现0006一种细菌源性吡咯烷类化合物在制备免疫抑制剂中的应用，所述的细菌源性吡咯烷类化合物为ANISOMYCIN，其结构式如式1所示00070008所述的细菌源性吡咯烷类化合物ANISOMYCIN可作为新型的免疫抑制剂，应用于组织器官移植排斥的防治。0009一种免疫抑制剂，含有上述细菌源性吡咯烷类化合物；0010上述。
12、免疫抑制剂的制备方法，包含如下步骤00111将10100MG细菌源性吡咯烷类化合物与053ML生理盐水NS或磷酸缓冲盐溶液PBS混合；00122在步骤1得到的溶液中缓慢滴加HCL溶液，并轻轻反复抽吸或搅拌直至细菌源性吡咯烷类化合物完全溶解时停止滴加HCL溶液；00133在步骤2得到的溶液中滴加NAOH溶液，调整PH至7072；再用生理盐水NS或磷酸缓冲盐溶液PBS补足溶液总体积至15ML，得到浓度为1020MG/ML的细菌源性吡咯烷类化合物免疫抑制剂；0014步骤1中所述的细菌源性吡咯烷类化合物为ANISOMYCIN；0015步骤1、2中所述的磷酸盐缓冲盐溶液的PH为72，其组成如下NACL8。
13、0G，KCL020G，NA2HPO412H2O3484G，NAH2PO412H2O020G，用三蒸水定容至1000ML；0016步骤2所述的HCL溶液的浓度为0530MOL/L；0017步骤2所述的HCL溶液的浓度优选为1MOL/L；0018步骤3中所述的的NAOH溶液浓度0530MOL/L；0019步骤3中所述的的NAOH溶液浓度优选为1MOL/L；0020步骤1、2和3优选在无菌条件下操作；0021步骤1和3中所述的生理盐水和磷酸缓冲盐溶液优选经过无菌处理；说明书CN104127408A3/7页50022步骤2中所述的HCL溶液优选经过无菌处理；0023步骤3中所述的NAOH溶液优选经过无。
14、菌处理；0024本发明的原理组织移植排斥因主要组织相容性复合体和次要组织相容性抗原的不同、炎症及局部血运障碍引起，受者T细胞攻击是导致移植排斥的关键，本发明发现ANISOMYCIN能抑制T细胞的活性及其生物学行为，抑制炎细胞分泌炎症因子，从而抑制组织器官移植排斥反应；因ANISOMYCIN的使用剂量低，且同样剂量下毒性也比较低，所以它的毒副作用低于临床常用免疫抑制剂。0025本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果00261本发明首次发现细菌源性吡咯烷类化合物ANISOMYCIN能显著抑制淋巴结T细胞增殖、周期、活化、免疫应答和细胞毒作用，抑制皮肤移植排斥反应，作用优于临床常用的地塞米松和环磷。
15、酰胺，从体内外证明了ANISOMYCIN可作为免疫抑制剂的新用途。00272ANISOMYCIN的用药剂量明显低于现有临床上常用免疫抑制剂的使用剂量，且在有效用药剂量范围内毒性较低。00283ANISOMYCIN在水中的溶解度最高可达2MG/ML，本发明制备的细菌源性吡咯烷类化合物免疫抑制剂能大大提高药物的溶解度至20MG/ML，又能避免常规需要用乙醇12MG/ML或二甲基亚砜20MG/ML等溶剂溶解，而后二者对组织细胞有明显的毒副作用；用药途径简单，易操作。附图说明0029图1是实施例4中不同剂量ANISOMYCIN作用48H后CONA诱导的淋巴结T细胞增殖的流式图，其中，AM为ANISOM。
16、YCIN。0030图2是实施例5中ANISOMYCIN抑制T细胞早期和中期活化的流式图，其中，A为ANISOMYCIN对CD3T细胞CD69表达的影响；B为ANISOMYCIN对CD3T细胞CD25表达的影响。0031图3是实施例6中不同剂量ANISOMYCIN作用下培养48H后淋巴结T细胞周期的流式图。0032图4是实施例7中ANISOMYCIN抑制双向和单向混合淋巴细胞反应的结果分析图，其中，A为双向混合淋巴细胞反应结果分析，B为单向混合淋巴细胞反应结果分析；与CONTROL组比较，P005；与CONTROL组比较，P001；与CONA组比较，P001。0033图5是实施例8中ANISOM。
17、YCIN抑制T细胞杀伤效应的结果分析图，其中，代表与CONTROL组比较，P005；与CONTROL组比较，P001；与LPS组比较，P005；与LPS组比较，P001。0034图6是实施例9中ANISOMYCIN延长小鼠移植皮肤存活时间的结果分析图，其中，与CONTROL组比较，P005；与CONTROL组比较，P001；与CSA组比较，P005；与CSA组比较，P001。0035图7是实施例9中ANISOMYCIN治疗后小鼠移植皮瓣的排斥情况结果分析图，其中，移植后第6D，A1D1对照组、CSA组、150MG/KGANISOMYCIN组和50MG/KGANISOMYCIN组；移植后第11D。
18、，A2D2对照组、CSA组、150MG/KGANISOMYCIN组和50MG/KGANISOMYCIN组；移植后第16D，A3D3对照组、CSA组、150MG/KGANISOMYCIN组和说明书CN104127408A4/7页650MG/KGANISOMYCIN组；移植后第28D，A4D4对照组、CSA组、150MG/KGANISOMYCIN组和50MG/KGANISOMYCIN组。0036图8是实施例9中ANISOMYCIN抑制皮肤移植小鼠迟发性超敏反应结果分析图，其中，与CONTROL组比较，P001。具体实施方式0037下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不。
19、限于此。0038BALB/C小鼠和C57BL/6小鼠购于广东省医学实验动物中心；0039BALB/C小鼠的淋巴结T细胞和C57BL/6小鼠的淋巴结T细胞参照参考文献陈玲,邢飞跃,狄静芳,等JAGGED1在树突状细胞介导淋巴细胞诱导皮肤移植免疫耐受中的作用J暨南大学学报自然科学与医学版,2008,292147151；YOUP,XINGF,MAOC,ETALJAGGED1HES1SIGNALINGINHIBITSTHEDIFFERENTIATIONOFTH17CELLSVIARORGAMMATJJOURNALOFBIOLOGICALREGULATORSANDHOMEOSTATICAGENTS,20。
20、12,2717993制备得到；0040实施例中所述的磷酸盐缓冲盐溶液PBS的PH为72，其组成如下NACL80G，KCL020G，NA2HPO412H2O3484G，NAH2PO412H2O020G，用三蒸水定容至1000ML；0041实施例1细菌源性吡咯烷类化合物免疫抑制剂的制备00421在无菌条件下，将100MGANISOMYCINSIGMAALDRICH,STLOUIS,MO,USA与3ML无菌PBS混合；00432在步骤1得到的溶液中缓慢滴加无菌双蒸水配制的1MOL/LHCL溶液，并用1ML移液器轻轻反复抽吸，至白色结晶完全溶解时停止滴加HCL溶液；00443在步骤2得到的溶液中缓慢滴。
21、加无菌双蒸水配制的1MOL/LNAOH溶液，PH试纸监测溶液PH值以调整PH至72，再用PBS补足溶液总体积至5ML，得到浓度为20MG/ML的ANISOMYCIN免疫抑制剂，置20下避光保存备用。0045实施例2细菌源性吡咯烷类化合物免疫抑制剂的制备00461在无菌条件下，将10MGANISOMYCIN与05ML无菌PBS混合；00472在步骤1得到的溶液中缓慢滴加无菌双蒸水配制的1MOL/LHCL溶液，并用200L移液器轻轻反复抽吸，至白色结晶完全溶解时停止滴加HCL溶液；00483在步骤2得到的溶液中缓慢滴加无菌双蒸水配制的1MOL/LNAOH溶液，PH试纸监测溶液PH值以调整PH至70。
22、，再用PBS补足溶液总体积至1ML，得到浓度为10MG/ML的ANISOMYCIN免疫抑制剂，置20下避光保存备用。0049实施例3细菌源性吡咯烷类化合物免疫抑制剂的制备00501在无菌条件下，将25MGANISOMYCIN与1ML无菌PBS混合；00512在步骤1得到的溶液中缓慢滴加无菌双蒸水配制的1MOL/LHCL溶液，并用1ML移液器轻轻反复抽吸，至白色结晶完全溶解时停止滴加HCL溶液；00523在步骤2得到的溶液中缓慢滴加无菌双蒸水配制的1MOL/LNAOH溶液，PH试纸监测溶液PH值以调整PH至71，再用PBS补足溶液总体积至2ML，得到浓度为125MG/ML的ANISOMYCIN免。
23、疫抑制剂，置20下避光保存备用。说明书CN104127408A5/7页70053实施例4细菌源性吡咯烷类化合物ANISOMYCIN抑制T细胞增殖0054用PBS调整BALB/C小鼠的淋巴结T细胞悬液的密度为21010/L，加入等体积的CFSECARBOXYLFLUORESCINDIACETATESUCCINMIDYLESTERMOLECULARPROBES,USA工作液终浓度为10MOL/L，充分混匀后在室温条件下，避光轻轻振荡10MIN,然后用PBS离心300G，5MIN洗涤细胞2次，悬浮于RPMI1640完全培养液中，并调整细胞浓度为2109/L，并将细胞种于96孔细胞培养板上，每孔200。
24、L；上述细胞分为3组，其中第一组添加不同剂量ANISOMYCIN终浓度为分别为001、005、01、05、10、25、50、100、250、500和1000NG/ML终浓度为50G/ML的CONA，第2组细胞加入终浓度为50G/ML的CONA，第3组细胞加入RPMI1640完全培养液作为空白对照组CONTROL。将上述处理组细胞置于370、5CO2培养箱中孵育48H，收获细胞进行流式细胞仪检测与分析，MODIT30软件自动拟合显示各组细胞的增增殖指数PROLIFERATIONINDEX，PIPI增殖后细胞总数/增殖前细胞总数。结果如图1所示，10250NG/MLANISOMYCIN抑制CONA。
25、对淋巴结T细胞的促增殖作用，当剂量达到5001000NG/ML时子代细胞完全被抑制。0055实施例5细菌源性吡咯烷类化合物ANISOMYCIN抑制T细胞活化0056BALB/C小鼠的淋巴结T细胞悬浮于RPMI1640完全培养液中，并调整细胞浓度为2109/L，将细胞接种于24孔细胞培养板上，每孔1ML。上述细胞分为3组，其中第一组添加终浓度为100NG/MLANISOMYCIN终浓度为50G/ML的CONA，第2组细胞添加终浓度为50G/ML的CONA，第3组细胞添加RPMI1640完全培养液作为空白对照组CONTROL。将上述处理组细胞置于370、5CO2培养箱中孵育6H，离心收集细胞300。
26、G，5MIN，加入ANTICD3PEEBIOSCIENCE,SANDIEGO,CA,USA和ANTICD69FITCEBIOSCIENCE,SANDIEGO,CA,USA各10G，混匀后40下避光放置30MIN。经PH72PBS洗涤两次后300G，5MIN，流式细胞仪检测与分析。0057另取淋巴结T细胞悬液，分组如上，同样条件下培养24H，离心收集细胞，加入ANTICD3PEEBIOSCIENCE,SANDIEGO,CA,USA和ANTICD25FITCEBIOSCIENCE,SANDIEGO,CA,USA各10G，混匀后40下避光放置30MIN，PH72PBS洗涤，流式细胞仪检测与分析。00。
27、58流式细胞仪检测显示淋巴结T细胞在静息状态下很少表达CD69和CD25分别为735和1430,CONA刺激6H和24H后，淋巴结T细胞表面CD69和CD25表达明显增高分别为6026和9144，ANISOMYCIN剂量为100NG/ML时能明显抑制CD69和CD25的表达图2。0059实施例6细菌源性吡咯烷类化合物ANISOMYCIN阻滞T细胞周期0060BALB/C小鼠的淋巴结T细胞悬浮于RPMI1640完全培养液中，并调整细胞浓度为2109/L，并将细胞接种于96孔细胞培养板上，每孔200L；上述细胞分为3组，其中第一组添加不同剂量ANISOMYCIN终浓度分别为001、005、01、0。
28、5、10、25、50、100和250NG/ML终浓度为50G/ML的CONA，第2组细胞添加终浓度为50G/ML的CONA，第3组细胞添加RPMI1640完全培养液作为空白对照组。将上述处理组置370、5CO2培养箱中培养48H，收获细胞，PBS洗涤细胞一次300G，5MIN，体积分数为70的乙醇固定30MIN，PBS洗涤细胞两次300G，5MIN，碘化丙锭溶液染色15MIN，流式细胞仪检测分说明书CN104127408A6/7页8析各组细胞DNA含量。结果显示，10250NG/MLANISOMYCIN能使淋巴结T细胞停滞于G0/G1期，阻止其进入S期从而抑制淋巴结T细胞增殖图3。0061实施。
29、例7细菌源性吡咯烷类化合物ANISOMYCIN抑制T细胞应答0062双向混合淋巴细胞反应MLR0063将BALB/C小鼠的淋巴结T细胞悬浮于RPMI1640完全培养液中，并调整细胞浓度为2109/L，并将细胞接种于96孔细胞培养板上，每孔100L，作为刺激细胞；上述细胞分为5个处理组，第1组添加终浓度100NG/ML的ANISOMYCIN；第2组添加终浓度为10G/ML的地塞米松；第3组添加终浓度为50G/ML的CONA；第4组添加终浓度100NG/ML的ANISOMYCIN终浓度为50G/ML的CONA；第5组添加终浓度为10G/ML的地塞米松终浓度为50G/ML的CONA；未加反应细胞的上。
30、述处理组在370、5CO2培养箱中孵育48H，加入100LC57BL/6小鼠淋巴结T细胞悬液作为反应细胞细胞密度为2109/L，继续培养72H，另设刺激细胞组、反应细胞组、刺激细胞反应细胞组对照。上述8组细胞分别加入MTT终浓度为05MG/ML，4H后离心弃上清300G，5MIN，DMSO溶解沉淀后，酶标仪检测在540NM处OD值。0064单向混合淋巴细胞反应MLR细胞培养及分组同上，在加入反应细胞前先用250G/ML丝裂霉素处理30MIN，PBS洗细胞，离心300G，5MIN，共3次。0065结果表明，ANISOMYCIN能明显抑制双向或单向MLR中小鼠淋巴结细胞的反应性，且100NG/ML。
31、ANISOMYCIN的抑制作用与10G/ML地塞米松的作用相当图4。0066实施例8细菌源性吡咯烷类化合物ANISOMYCIN抑制T细胞杀伤活性CYTOTOXICITY00671大鼠肝癌细胞7919由长沙赢润生物技术有限公司提供。取15106个细胞，经超声粉碎后得到蛋白10ML,一次性注入BALB/C小鼠购于广东省医学实验动物中心体内皮下05ML，腹腔05ML，9天后取小鼠淋巴结T细胞，调整细胞密度为101011/L。00682将步骤1得到的小鼠淋巴结细胞接种于96孔板，每孔100L；上述细胞分为5组，其中，第一组添加终浓度为100NG/ML的ANISOMYCIN，第2组添加终浓度为100NG。
32、/ML的ANISOMYCIN终浓度为10G/ML的脂多糖LPS、第3组添加终浓度为10G/ML的LPS，第4组添加终浓度为10G/ML的LPS终浓度为10G/ML的地塞米松、第5组添加终浓度为10G/ML的地塞米松；在370、5CO2培养箱中作用24H，加入100L7919靶细胞细胞密度为10109/L，在370、5CO2培养箱中培养48H，另设单纯效靶细胞组及RPMI1640完全培养液空白对照组。上述细胞组MTT检测540NM处OD值。如图5所示，ANISOMYCIN能够明显抑制淋巴结T细胞对大鼠肝癌细胞的杀伤效应，且100NG/MLANISOMYCIN的抑制强度接近于100G/ML地塞米松。
33、的作用。0069实施例9细菌源性吡咯烷类化合物ANISOMYCIN抑制皮肤移植排斥0070BALB/C小鼠购于广东省医学实验动物中心随机分为4组，于术前分别腹腔注射生理盐水、15MG/KG环孢素ACSA、15MG/KG和50MG/KG的ANISOMYCIN各01ML，隔天给药1次，共3次；C57BL/6小鼠购于广东省医学实验动物中心腹腔注射质量分数10的水合氯醛016ML/KG,无菌取1010MM背部皮瓣，去除皮下筋膜置于生理盐水中作为供体移植物备用；同法给BALB/C小鼠腹腔注射10的水合氯醛013ML/KG，在显微外科显微说明书CN104127408A7/7页9镜下，于前肢背部脊中线处无菌。
34、手术去除稍微大于上述皮瓣的皮肤，剔除皮下脂肪膜作为移植物受体，对接移植皮瓣；术后小鼠分组给药剂量同术前，每天1次，共7次；观察移植物色泽、硬度、有无充血、坏死、结痂脱落、毛发色泽及生长等。移植物变硬、结痂脱落或坏死判定为移植排斥；红润、柔软、鼠毛生长为耐受，并记录开始发生排斥时间及最后掉皮时间。结果发现，150MG/KGANISOMYCIN能明显抑制小鼠对同种异基因皮肤移植的排斥,延长移植物的存活时间，且抑制作用强于CSA。CSA组小鼠自第一次注射药物后起就显得暴躁不安、易激惹、皮毛耸立，且逐渐消瘦，停药后体重恢复较慢，而ANISOMYCIN组小鼠几乎无上述症状，提示ANISOMYCIN对小鼠。
35、的毒性作用弱于CSA图6，图7。0071实施例10细菌源性吡咯烷类化合物ANISOMYCIN抑制皮肤移植小鼠的迟发性超敏反应DTH0072按照实施例9所述完成小鼠术前注射、皮肤移植手术和术后治疗，在皮肤移植后第9天将供体C57BL/6小鼠广东省医学实验动物中心提供的淋巴结T细胞和脾脏细胞悬液100L细胞密度101010/L分别皮下注入受体BALB/C小鼠广东省医学实验动物中心提供腹股沟皮下组织预致敏，7天后于各组受体小鼠右后脚掌注射50L相同的脾脏细胞细胞密度为21010/L，左后脚掌注射相同体积生理盐水作为对照。24H后以游标卡尺测量两脚掌脚蹼的厚度，取其差值作为DTH指标。结果显示150M。
36、G/KGCSA和150MG/KGANISOMYCIN均能抑制受体小鼠的DTH，后者作用强于前者图8。0073上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。说明书CN104127408A1/5页10图1图2说明书附图CN104127408A102/5页11图3图4说明书附图CN104127408A113/5页12图5图6说明书附图CN104127408A124/5页13图7说明书附图CN104127408A135/5页14图8说明书附图CN104127408A14。