大环内酯类抗生素分子印迹聚合物微球的制备方法.pdf

本发明公开了一种大环内酯类抗生素分子印迹聚合物微球的制备方法，其特点是将分散剂聚乙烯醇或羟乙基纤维素溶于二次蒸馏水中，制成水相分散液；将印迹分子和功能单体溶于有机溶剂中，制成油相混合液；在搅拌作用下，将油相混合液加到水相分散液中，再加入引发剂偶氮二异丁腈，水浴中热引发聚合，得到聚合物微球；然后在乙酸丁酯水溶液或乙酸的甲醇溶液中，采用超声萃取的方法洗脱印迹分子，用蒸馏水洗涤，下真空干燥，得到大环内酯类抗生素分子印迹聚合物微球。本发明在水相中制备出了大环内酯类抗生素分子印迹聚合物微球，可在水相中进行分子识别，更接近于天然的生物分子识别系统，为亲水性药物在水相中识别、分离和分析提供了方法。

1、  一种大环内酯类抗生素分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(a)将分散剂聚乙烯醇或羟乙基纤维素溶于50～90℃的二次蒸馏水中，搅拌至全部溶解，成水相分散液，分散剂用量为功能单体用量的0.8％～1.5％；
(b)将印迹分子和功能单体溶于有机溶剂中，20～30℃条件下超声作用30～60min后，加入交联剂，超声作用10～20min，成油相混合液；印迹分子:功能单体:交联剂＝1:2～6:5～40(摩尔比)；
(c)在400～500r/min搅拌作用下，将步骤(b)制备的油相混合液缓慢滴加到步骤(a)制备的水相分散液中，油相混合液与水相分散液的体积比为1:6～14；滴加速度控制在2～3ml/min；通入N₂ 15～30min，N₂流量0.5～1ml/min；
(d)在400～500r/min搅拌作用下，向步骤(c)制备的混合液中加入引发剂偶氮二异丁腈，采用热引发进行悬浮聚合反应，引发剂用量为功能单体用量的0.5～1.5％，在50～70℃水浴中热引发聚合10～24h，冷却至室温，抽滤处理，得到聚合物微球；
(e)将步骤(4)得到的聚合物微球在20～30℃、10～15％乙酸丁酯水溶液或10～15％乙酸的甲醇溶液中，采用超声萃取的方法洗脱印迹分子，超声洗脱时间为30～60min，直至检测不出抗生素为止；
(f)用蒸馏水反复洗涤，除去残留的乙酸丁酯、甲醇或乙酸；
(g)将洗脱后的分子印迹聚合物微球在50～60℃下真空干燥，得到大环内酯类抗生素分子印迹聚合物微球；
所述印迹分子是红霉素、罗红霉素、阿齐霉素、9，3”-二乙酰麦迪霉素或者乙酰螺旋霉素的任一种；所述功能单体是α—甲基丙烯酸、丙烯酸或者丙烯酰胺的任一种；所述交联剂是乙二醇二甲基双丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯或者N’，N’-2甲基双丙烯酰胺乙二醇二甲基丙烯酸酯的任一种；所述有机试剂是氯仿、乙睛、甲苯、乙酸丁酯、乙酸或者甲醇的任一种。

大环内酯类抗生素分子印迹聚合物微球的制备方法
技术领域
本发明涉及一种分子印迹聚合物微球的制备方法，特别是大环内酯类抗生素分子印迹聚合物微球的制备方法。
背景技术
大环内酯类抗生素是应用较多的碱性中谱抗生素，在化学结构上都是以12～16元大环内酯为母体，以苷键和1～3个分子的糖相联结的一类多氧大环内酯抗生素。红霉素(erythromycin，简称EM)和罗红霉素(roxithromycin)是最常用的14元大环内酯类抗生素。阿齐霉素(azithromycin)是15元内酯环半合成的C-9叔胺衍生物，麦迪霉素(midecamycin)、乙酰螺旋霉素(spiramycin)是半合成的16元大环内酯抗生素的半合成的麦迪霉素和螺旋霉素衍生物。红霉素为生物发酵抗生素，其余均为半合成的大环内酯类抗生素。
上述抗生素的发酵体系和合成体系中，存在着结构极为相似的多组分，其抗菌活性不同，毒性不一。要得到高纯度的抗菌药品，在提炼和合成过程中必须进行组分分离，如红霉素A和红霉素C的结构极为相似，但红霉素C抗菌活性比红霉素A低很多，而其毒性却比红霉素A高很多，在药物中为杂质。作为药物，必须将红霉素C与红霉素A予以分离，以提高药物的抗菌活性及降低毒性。由于其结构极为相似，在提炼和合成过程中难以分离。
采用分子印迹技术制备得到的大环内酯类抗生素分子印迹聚合物可利用其特有的空间构效性和特异识别性，来“记忆”大环内酯抗生素的分子构型，从而具备对特定异构体的识别选择能力。
多年来分子印迹聚合物的制备研究主要集中在非水溶剂体系中，水分子被认为是削弱印迹分子与功能单体之间氢键作用的强极性溶剂，容易对印迹分子与功能基团之间的结合作用造成破坏，如果印迹的条件选择不当就很有可能导致印迹的失败。而生物分子的识别系统大多是在水相环境中进行的，非水体系制备的分子印迹聚合物在水相环境中的应用效果较差，有机溶剂中的印迹在多数情况下又无法模拟实际应用中的水相环境，不能满足使用环境的多样化要求。
文献“专利申请号是200610023903.7的发明专利”公开了一种氯霉素分子印迹聚合物微球的制备方法，其制备的是用于食品中氯霉素检测分离的氯霉素分子印迹聚合物微球，氯霉素属苯烃基胺类抗生素。经文献检索，尚未发现采用分子印迹技术在水相中制备大环内酯类抗生素分子印迹聚合物微球的相关报道。
发明内容
为了克服现有技术采用分子印迹技术在水相中不能制备大环内酯类抗生素分子印迹聚合物微球的不足，本发明提供一种大环内酯类抗生素分子印迹聚合物微球的制备方法，在水相中制备大环内酯类抗生素分子印迹聚合物微球。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案：一种大环内酯类抗生素分子印迹聚合物微球的制备方法，其特点是包括以下步骤：
(a)将分散剂聚乙烯醇或羟乙基纤维素溶于50～90℃的二次蒸馏水中，搅拌至全部溶解，成水相分散液，分散剂用量为功能单体用量的0.8％～1.5％；
(b)将印迹分子和功能单体溶于有机溶剂中，20～30℃条件下超声作用30～60min后，加入交联剂，超声作用10～20min，成油相混合液；印迹分子:功能单体:交联剂＝1:2～6:5～40(摩尔比)；
(c)在400～500r/min搅拌作用下，将步骤(b)制备的油相混合液缓慢滴加到步骤(a)制备的水相分散液中，油相混合液与水相分散液的体积比为1:6～14；滴加速度控制在2～3ml/min；通入N₂ 15～30min，N₂流量0.5～1ml/min；
(d)在400～500r/min搅拌作用下，向步骤(c)制备的混合液中加入引发剂偶氮二异丁腈，采用热引发进行悬浮聚合反应，引发剂用量为功能单体用量的0.5～1.5％，在50～70℃水浴中热引发聚合10～24h，冷却至室温，抽滤处理，得到聚合物微球；
(e)将步骤(4)得到的聚合物微球在20～30℃、10～15％乙酸丁酯水溶液或10～15％乙酸的甲醇溶液中，采用超声萃取的方法洗脱印迹分子，超声洗脱时间为30～60min，直至检测不出抗生素为止；
(f)用蒸馏水反复洗涤，除去残留的乙酸丁酯、甲醇或乙酸；
(g)将洗脱后的分子印迹聚合物微球在50～60℃下真空干燥，得到大环内酯类抗生素分子印迹聚合物微球；
所述印迹分子是红霉素、罗红霉素、阿齐霉素、9，3”-二乙酰麦迪霉素或者乙酰螺旋霉素的任一种；所述功能单体是α—甲基丙烯酸、丙烯酸或者丙烯酰胺的任一种；所述交联剂是乙二醇二甲基双丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯或者N’，N’-2甲基双丙烯酰胺乙二醇二甲基丙烯酸酯的任一种；所述有机试剂是氯仿、乙睛、甲苯、乙酸丁酯、乙酸或者甲醇的任一种。
本发明的有益效果是：本发明在水相中制备出了大环内酯类抗生素分子印迹聚合物微球，可在水相中进行分子识别，更接近于天然的生物分子识别系统，为亲水性药物在水相中识别、分离和分析提供了方法。
下面结合实施例对本发明作详细说明。
具体实施方式
实施例1：称取0.622g的聚乙烯醇加入到100ml二次蒸馏水中，搅拌下升温至80℃将其溶解，成水相分散液，冷却至室温后转入250ml反应器中。称取0.734g红霉素溶于10ml甲苯中，加入0.4ml丙烯酸，在30℃条件下超声作用40min，使红霉素和丙烯酸充分作用形成复合物，再加入4.655g乙二醇二甲基双丙烯酸酯，超声10min，成油相混合液。将1份的油相混合液在450r/min的搅拌下缓缓滴加到6份的水相分散液中，滴加速度控制在2ml/min，使其形成乳白色的微悬浮乳液。通入N₂ 15min，N₂流量0.5ml/min。然后将0.0760g偶氮二异丁睛加入并搅拌，搅拌条件400r/min，在50℃水浴中热引发聚合24小时。冷却至室温后，抽虑处理，得到聚合物微球。
将上述聚合物微球在20℃条件下、10％的乙酸丁酯水溶液中，采用超声萃取的方法洗脱印迹分子，超声洗脱时间为30min，直到在492nm处检测不出红霉素分子为止。再用蒸馏水反复洗涤除去残留甲醇、乙酸溶液。所得聚合物微球60℃真空干燥，得到红霉素分子印迹聚合物微球。
经检测，所制备的红霉素分子印迹聚合物微球平均粒径为60μm。竞争底物为罗霉素，分离因子为1.87。
实施例2：称取0.0451g的羟乙基纤维素加入到90ml二次蒸馏水中，搅拌下升温至50℃将其溶解，成水相分散液，冷却至室温后转入250ml反应器中。称取0.734g红霉素溶于7.5ml乙腈中，加入0.4mlα-甲基丙烯酸，在25℃条件下超声作用30min，使红霉素和甲基丙烯酸充分作用形成复合物，再加入3.960g乙二醇二甲基双丙烯酸酯，超声20min，成油相混合液。将1份的油相混合液在400r/min的搅拌下缓缓滴加到14份的水相分散液中，滴加速度控制在3ml/min，使其形成乳白色的微悬浮乳液。通入N₂ 30min，N₂流量1ml/min。然后将0.0760g偶氮二异丁睛加入并搅拌，搅拌条件500r/min，在70℃水浴中热引发聚合20小时。冷却至室温后，抽虑处理，得到聚合物微球。
将上述聚合物微球在30℃条件下、15％的乙酸丁酯水溶液中，采用超声萃取的方法洗脱印迹分子，超声洗脱时间为60min，直到在492nm处检测不出红霉素分子为止，再用蒸馏水反复洗涤除去残留甲醇、乙酸溶液。所得聚合物微球50℃真空干燥。得到红霉素分子印迹聚合物微球。
经检测，所制备的红霉素分子印迹聚合物微球平均粒径为45μm。竞争底物为罗霉素，分离因子2.25。
实施例3：称取0.055g的羟乙基纤维素加入到10ml二次蒸馏水中，搅拌下升温至80℃将其溶解，成水相分散液，冷却至室温后转入250ml反应器中。称取0.734g红霉素溶于7.5ml乙腈中，加入0.4mlα—甲基丙烯酸，在20℃条件下超声作用50min，使红霉素与α—甲基丙烯酸充分作用形成复合物，再加入3.960g乙二醇二甲基双丙烯酸酯，超声10min，成油相混合液。将1份的油相混合液在500r/min的搅拌下缓缓滴加到7份的水相分散液中，滴加速度控制在2ml/min，使其形成乳白色的微悬浮乳液。通入N₂ 20min，N₂流量0.6ml/min。然后将0.0760g偶氮二异丁睛加入并搅拌，搅拌条件450r/min，在65℃水浴中热引发聚合20小时。冷却至室温后，抽虑处理，得到聚合物微球。
将上述聚合物微球在25℃条件下、13％的乙酸丁酯水溶液中，采用超声萃取的方法洗脱印迹分子，超声洗脱时间为40min，直到在492nm处检测不出红霉素分子为止，再用蒸馏水反复洗涤除去残留甲醇、乙酸溶液。所得聚合物微球55℃真空干燥。得到红霉素分子印迹聚合物微球。
经检测，所制备的红霉素分子印迹聚合物微球平均粒径为40μm。竞争底物为罗霉素，分离因子为2.18。
实施例4：称取0.622g聚乙烯醇加入到120ml二次蒸馏水中，搅拌下升温至90℃将其溶解，成水相分散液，冷却至室温后转入250ml反应器中。称取0.825g罗红霉素溶于9ml氯仿中，加入0.5ml丙烯酸，在20℃条件下超声作用40min，使罗红霉素和丙烯酸充分作用形成复合物，再加入2.90g三羟甲基丙烷三丙烯酸酯，超声15min，成油相混合液。将1份的油相混合液在410r/min的搅拌下缓缓滴加到8份的水相分散液中，滴加速度控制在3ml/min，使其形成乳白色的微悬浮乳液。通入N₂ 18min，N₂流量0.7ml/min。然后将0.0760g偶氮二异丁睛加入并搅拌，搅拌条件410r/min，在65℃水浴中热引发聚合18小时。冷却至室温后，抽虑处理，得到聚合物微球。
将上述聚合物微球在22℃条件下、11％的乙酸丁酯水溶液中，采用超声萃取的方法洗脱印迹分子，超声洗脱时间为50min，直到在492nm处检测不出红霉素分子为止，再用蒸馏水反复洗涤除去残留甲醇、乙酸溶液，所得聚合物微球54℃真空干燥。得到罗红霉素分子印迹聚合物微球。
经检测，所制备的罗红霉素分子印迹聚合物微球平均粒径为50μm。竞争底物为阿齐霉素，分离因子为1.62。
实施例5：称取0.0521g的羟乙基纤维素加入到100ml二次蒸馏水中，搅拌下升温至60℃将其溶解，成水相分散液，冷却至室温后转入250ml反应器中。称取0.825g罗红霉素溶于9ml氯仿中，加入0.5ml丙烯酸，在30℃条件下超声作用40min，使罗红霉素和丙烯酸充分作用形成复合物，再加入2.90g三羟甲基丙烷三丙烯酸酯，超声15min，成油相混合液。将1份的油相混合液在420r/min的搅拌下缓缓滴加到9份的水相分散液中，滴加速度控制在2ml/min，使其形成乳白色的微悬浮乳液。通入N₂ 16min，N₂流量0.8ml/min。然后将0.0760g偶氮二异丁睛加入并搅拌，搅拌条件430r/min，在55℃水浴中热引发聚合18小时。冷却至室温后，抽虑处理，得到聚合物微球。
将上述聚合物微球在26℃条件下、14％的乙酸丁酯水溶液中，采用超声萃取的方法洗脱印迹分子，超声洗脱时间为35min，直到在492nm处检测不出红霉素分子为止，再用蒸馏水反复洗涤除去残留甲醇、乙酸溶液，所得聚合物微球53℃真空干燥，得到罗红霉素分子印迹聚合物微球。
经检测，所制备的罗红霉素分子印迹聚合物微球平均粒径为40μm。竞争底物为阿齐霉素，分离因子为1.93。
实施例6：称取0.622g聚乙烯醇加入120ml二次蒸馏水中，搅拌升温至80℃将其溶解，成水相分散液，冷却至室温后转入250ml反应器中。称取0.880g阿齐霉素溶于7.5ml乙腈中，加入0.3g丙烯酰胺，在25℃条件下超声作用60min，使阿齐霉素和丙烯酰胺充分作用形成复合物，再加入4.655g乙二醇二甲基双丙烯酸酯，超声10min，成油相混合液。将1份的油相混合液在430r/min的搅拌下缓缓滴加到10份的水相分散液中，滴加速度控制在3ml/min，使其形成乳白色的微悬浮乳液。通入N₂ 17min，N₂流量0.9ml/min。然后将0.0760g偶氮二异丁睛加入并搅拌，搅拌条件440r/min，在60℃水浴中热引发聚合16小时，冷却至室温后，抽虑处理，得到聚合物微球。
将上述聚合物微球在28℃条件下、12％的乙酸丁酯水溶液中，采用超声萃取的方法洗脱印迹分子，超声洗脱时间为45min，直到在492nm处检测不出红霉素分子为止，再用蒸馏水反复洗涤除去残留甲醇、乙酸溶液。所得聚合物微球52℃真空干燥。得到阿齐霉素分子印迹聚合物微球。
经检测，所制备的阿齐霉素分子印迹聚合物微球平均粒径为60μm。竞争底物为罗红霉素，分离因子为2.35。
实施例7：称取0.0451g羟乙基纤维素加入90ml二次蒸馏水中，搅拌升温至60℃将其溶解，成水相分散液，冷却至室温后转入250ml反应器中。称取0.880g阿齐霉素溶于7.5ml乙睛中，加入0.3g丙烯酰胺，在20℃条件下超声作用60min，使阿齐霉素和丙烯酰胺充分作用形成复合物，再加入4.655g乙二醇二甲基双丙烯酸酯，超声10min，成油相混合液。将1份的油相混合液在460r/min的搅拌下缓缓滴加到11份的水相分散液中，滴加速度控制在2ml/min，使其形成乳白色的微悬浮乳液。通入N₂ 22min，N₂流量0.5ml/min。然后将0.0760g偶氮二异丁睛加入并搅拌，搅拌条件460r/min，在65℃水浴中热引发聚合16小时，冷却至室温后，抽虑处理，得到聚合物微球。
将上述聚合物微球在20℃条件下、10％乙酸的甲醇溶液中，采用超声萃取的方法洗脱印迹分子，超声洗脱时间为55min，直到在492nm处检测不出红霉素分子为止，再用蒸馏水反复洗涤除去残留甲醇、乙酸溶液。所得聚合物微球51℃真空干燥。得到阿齐霉素分子印迹聚合物微球。
经检测，所制备的阿齐霉素分子印迹聚合物微球平均粒径为45μm。竞争底物为罗红霉素，分离因子为2.18。
实施例8：称取0.0451g的羟乙基纤维素加入到90ml二次蒸馏水中，搅拌升温至50℃将其溶解，成水相分散液，冷却至室温后转入250ml反应器中。称取0.850g9，3”-二乙酰麦迪霉素溶于8ml乙腈中，加入0.4ml丙烯酸，在20℃条件下超声作用40min，使9，3”-二乙酰麦迪霉素和丙烯酸充分作用形成复合物，再加入2.16g N’，N’-2甲基双丙烯酰胺乙二醇二甲基丙烯酸酯，超声20min，成油相混合液。将1份的油相混合液在470r/min的搅拌下缓缓滴加到12份的水相分散液中，滴加速度控制在2ml/min，使其形成乳白色的微悬浮乳液。通入N₂ 24min，N₂流量0.6ml/min。然后将0.0469g偶氮二异丁睛加入并搅拌，搅拌条件470r/min，在55℃水浴中热引发聚合20小时。冷却至室温后，抽虑处理，得到聚合物微球。
将上述聚合物微球在30℃条件下、15％乙酸的甲醇溶液中，采用超声萃取的方法洗脱印迹分子，超声洗脱时间为30min，直到在492nm处检测不出红霉素分子为止，再用蒸馏水反复洗涤除去残留甲醇、乙酸溶液。所得聚合物微球56℃真空干燥。得到9，3”-二乙酰麦迪霉素分子印迹聚合物微球。
经检测，所制备的9，3”-二乙酰麦迪霉素分子印迹聚合物微球平均粒径为55μm。竞争底物为红霉素，分离因子为1.88。
实施例9：称取0.622g的聚乙烯醇加入到120ml二次蒸馏水中，搅拌升温至90℃将其溶解，成水相分散液，冷却至室温后转入250ml反应器中。称取0.850g9，3”-二乙酰麦迪霉素溶于8ml乙腈中，加入0.3g丙烯酰胺，在25℃条件下超声作用60min，使9，3”-二乙酰麦迪霉素和丙烯酰胺充分作用形成复合物，再加入2.16gN’，N’-2甲基双丙烯酰胺乙二醇二甲基丙烯酸酯，超声20min，成油相混合液。将1份的油相混合液在480r/min的搅拌下缓缓滴加到13份的水相分散液中，滴加速度控制在3ml/min，使其形成乳白色的微悬浮乳液。通入N₂ 26min，N₂流量0.8ml/min。然后将0.0469g偶氮二异丁睛加入并搅拌，搅拌条件480r/min，在60℃水浴中热引发聚合20小时。冷却至室温后，抽虑处理，得到聚合物微球。
将上述聚合物微球在25℃条件下、13％乙酸的甲醇溶液中，采用超声萃取的方法洗脱印迹分子，超声洗脱时间为60min，直到在492nm处检测不出红霉素分子为止，再用蒸馏水反复洗涤除去残留甲醇、乙酸溶液。所得聚合物微球57℃真空干燥。得到9，3”-二乙酰麦迪霉素分子印迹聚合物微球。
经检测，所制备的9，3”-二乙酰麦迪霉素分子印迹聚合物微球平均粒径为60μm。竞争底物为红霉素，分离因子为1.91。
实施例10：称取0.0451g的羟乙基纤维素加入到90ml二次蒸馏水中，搅拌升温至50℃将其溶解，成水相分散液，冷却至室温后转入250ml反应器中。称取0.922g乙酰螺旋霉素溶于8ml乙睛中，加入0.3g丙烯酰胺，在30℃条件下超声作用40min，使乙酰螺旋霉素和丙烯酰胺充分作用形成复合物，再加入2.16gN’，N’-2甲基双丙烯酰胺乙二醇二甲基丙烯酸酯，超声10min，成油相混合液。将1份的油相混合液在490r/min的搅拌下缓缓滴加到10份的水相分散液中，滴加速度控制在2ml/min，使其形成乳白色的微悬浮乳液。通入N₂ 28min，N₂流量0.5ml/min。然后将0.0469g偶氮二异丁睛加入并搅拌，搅拌条件490r/min，在50℃水浴中热引发聚合16小时。冷却至室温后，抽虑处理，得到聚合物微球。
将上述聚合物微球在26℃条件下、11％乙酸的甲醇溶液中，采用超声萃取的方法洗脱印迹分子，超声洗脱时间为40min，直到在492nm处检测不出红霉素分子为止，再用蒸馏水反复洗涤除去残留甲醇、乙酸溶液。所得聚合物微球58℃真空干燥。得到乙酰螺旋霉素分子印迹聚合物微球。
经检测，所制备的乙酰螺旋霉素分子印迹聚合物微球平均粒径为47μm。竞争底物为麦迪霉素，分离因子为1.93。
实施例11：称取0.622g聚乙烯醇加入到90ml二次蒸馏水中，搅拌升温至90℃将其溶解，成水相分散液，冷却至室温后转入250ml反应器中。称取0.922g乙酰螺旋霉素溶于8ml乙腈中，加入0.5ml甲基丙烯酸，在30℃条件下超声作用60min，使乙酰螺旋霉素和甲基丙烯酸充分作用形成复合物，再加入2.16gN’，N’-2甲基双丙烯酰胺乙二醇二甲基丙烯酸酯，超声20min，成油相混合液。将1份的油相混合液在450r/min的搅拌下缓缓滴加到8份的水相分散液中，滴加速度控制在3ml/min，使其形成乳白色的微悬浮乳液。通入N₂ 29min，N₂流量0.9ml/min。然后将0.0469g偶氮二异丁腈加入并搅拌，搅拌条件410r/min，在70℃水浴中热引发聚合18小时。冷却至室温后，抽虑处理，得到聚合物微球。
将上述聚合物微球在21℃条件下、12％乙酸的甲醇溶液中，采用超声萃取的方法洗脱印迹分子，超声洗脱时间为50min，直到在492nm处检测不出红霉素分子为止，再用蒸馏水反复洗涤除去残留甲醇、乙酸溶液。所得聚合物微球59℃真空干燥。得到乙酰螺旋霉素分子印迹聚合物微球。
经检测，所制备的乙酰螺旋霉素分子印迹聚合物微球平均粒径为55μm。竞争底物为麦迪霉素，分离因子为1.95。