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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610781880.X (22)申请日 2016.08.31 (71)申请人 广州健坤生物科技有限公司 地址 510063 广东省广州市萝岗区科汇金 谷四街9号301C (72)发明人 赵伟 李波 (74)专利代理机构 广州三环专利代理有限公司 44202 代理人 郝传鑫 宋静娜 (51)Int.Cl. A61K 38/08(2006.01) A61K 38/22(2006.01) A61P 39/06(2006.01) A61K 36/87(2006.01) A61K 3。
2、1/714(2006.01) A61K 31/455(2006.01) A61K 31/4415(2006.01) A61K 31/4172(2006.01) A61K 31/405(2006.01) A61K 31/401(2006.01) A61K 31/205(2006.01) A61K 31/198(2006.01) A61K 31/197(2006.01) A61K 31/195(2006.01) A61K 31/192(2006.01) A61K 31/185(2006.01) A61K 31/05(2006.01) A61K 31/19(2006.01) A61K 31/336(。
3、2006.01) (54)发明名称 一种用于衰老基因表达调控的组合物及其 在保健品中的应用 (57)摘要 本发明涉及一种用于衰老基因表达调控的 组合物及其在保健品中的应用， 属于保健品和生 物工程技术交叉领域。 本发明用于衰老基因表达 调控的组合物含有下述组分： 小肽， 白藜芦醇， -羟基-甲基丁酸盐， 肉桂酸， 褐藻素； 所述 组合物还包括葡萄籽提取物和/或亮氨酸。 本发 明用于衰老基因表达调控的组合物够激活HSF1 及其编码的HSPs， 通过直接激活抗衰老酶通路或 者间接调控抗衰老、 抗凋亡信号通路激活的方式 减缓肌体衰老。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图2页 CN 1063。
4、44911 A 2017.01.25 CN 106344911 A 1.一种用于衰老基因表达调控的组合物， 其特征在于： 所述组合物含有下述组分： 小 肽， 白藜芦醇， -羟基- -甲基丁酸盐， 肉桂酸， 褐藻素； 所述组合物还包括葡萄籽提取物和/ 或亮氨酸。 2.如权利要求1所述的用于衰老基因表达调控的组合物， 其特征在于： 所述组合物中各 组分的重量份为： 小肽3.05.0份， 白藜芦醇0.0300.6份， -羟基- -甲基丁酸盐0.1 4.0份， 肉桂酸0.020.4份， 褐藻素0.010.1份， 葡萄籽提取物0.64.0份， 亮氨酸0.6 4.0份。 3.如权利要求2所述的用于衰老基因。
5、表达调控的组合物， 其特征在于： 所述白藜芦醇为 0.0350.5重量份， 所述 -羟基- -甲基丁酸盐为0.23.0重量份。 4.如权利要求2所述的用于衰老基因表达调控的组合物， 其特征在于： 所述白藜芦醇为 0.0350.5重量份， 所述亮氨酸为0.753.0重量份。 5.如权利要求14任一项所述的用于衰老基因表达调控的组合物， 其特征在于： 所述 小肽由JKB-A1和JKB-A2组成， 所述JKB-A1与JKB-A2的重量比为2： 1； 所述JKB-A1为Gla-Glu- Glu-Lys-Ala-Asp-Pro所示的序列组成的小肽， 所述JKB-A2为Glu-Glu-Lys-Ala-As。
6、n所示的 序列组成的小肽。 6.如权利要求1或2所述的用于衰老基因表达调控的组合物， 其特征在于： 所述组合物 还含有烟酸、 维生素B6、 维生素B12、 泛酸、 鸢尾素中的至少一种； 并且所述组合物含有赖氨 酸、 谷氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 缬氨酸、 异亮氨酸、 天冬氨酸、 天冬酰胺、 甘氨酸、 苏氨酸、 丝氨 酸、 苯丙氨酸、 酪氨酸、 组氨酸、 丙氨酸、 色氨酸、 甲硫氨酸、 谷氨酰胺、 牛磺酸、 肉碱、 胱氨酸 和半胱氨酸中的至少一种。 7.一种保健品， 其特征在于： 所述保健品含有如权利要求16任一项所述用于衰老基 因表达调控的组合物。 8.如权利要求7所述的保健品， 其特征在于：。
7、 所述保健品还含有载体。 9.如权利要求8所述的保健品， 其特征在于： 所述保健品还含有润滑剂、 湿润剂、 增甜 剂、 增香剂、 乳化剂、 悬浮剂、 防腐剂中的至少一种。 10.一种如权利要求16任一项所述用于衰老基因表达调控的组合物在保健品中的应 用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106344911 A 2 一种用于衰老基因表达调控的组合物及其在保健品中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种用于衰老基因表达调控的组合物及其在保健品中的应用， 尤其涉 及一种以HSF1及HSPs为靶点的衰老基因表达调控的组合物及其在保健品中的应用。 背景技术 0002 应激(stress)是细。
8、胞应对生存环境中多种不利因素的反应,温度变化、 蛋白质错 误折叠、 氧化性损伤及病毒入侵都可以引起细胞应激， 它通过改变机体内稳态,启动相应信 号传导途径,引起一系列分子事件， 产生广泛而深刻的影响。 0003 应激反应的典型特征之一是激活细胞热应激因子(heat shock factor,HSF)， 进 而表达一种或数种热激蛋白(heat shock protein,HSP)。 热激转录因子是一类高度保守的 蛋白， 其在细胞生长、 发育以及应激反应和疾病进程中都发挥重要作用。 在人类基因组中， 已发现4个热激转录因子基因， 已知热激转录因子1(HSF1)在热激反应中起关键作用， 热激 转录因。
9、子2(HSF2)在发育和神经分化中起作用， 热激转录因子4(HSF4)则对晶状体形成非常 重要。 体内的HSF1可被多条压力通路激活， 包括热激、 蛋白错误折叠、 重金属、 氧应激等。 在 应激条件下， HSF1发生磷酸化形成活性三聚体， 入核与热激因子效应区(heat shock element,HSE)结合， 激活/抑制相应基因表达。 0004 HSF1调控了应激表达网络， 约占人类全基因组3的基因座在热激条件下被HSF1 结合， 其可与暂停的聚合酶结合， 募集转录延伸因子P-TEFb、 Cdk9-Cyclin T二聚体， 以形 成新的转录延伸复合物。 Rawat和Mitra通过凝胶迁移实。
10、验(EMSA)也已证实HSF1可以激活绝 大多数衰老相关基因， 是衰老的重要调控因子。 0005 由HSF1编码的热激蛋白(heat shock proteins， 简称HSP)是生物体在高温、 盐渍、 干旱、 渗透胁迫等环境条件下诱导合成的一类应激蛋白。 其在细胞内起分子伴侣功能， 参与 新生肽链折叠、 蛋白质组装与转运。 同时， 在细胞发生应激反应时， 热激蛋白还可以与那些 由于环境刺激而自身构象发生改变的蛋白相互作用， 防止非特异性蛋白聚集， 维持信号转 导蛋白的活性。 HSPs属于高度保守蛋白， 约占细胞总蛋白的5-20。 其根据分子量大小分类 为6类： HSP100、 HSP90、 。
11、HSP70、 HSP60、 HSP40和小分子HSPs。 0006 HSP90家族成员即使在无胁迫的条件下， 在真核生物体内也有一定量的表达， 是真 核生物必不可少的因子。 从晶体结构来看， HSP90的N末端是一个二聚体， 由含有一个配基 “口袋” 的 三明治结构组成， 其一侧是一高度扭曲的， 有8条链组成的 折叠， 另一侧则被9 条 螺旋所覆盖， 在螺旋的中心有一个 “口袋” ， 折叠的表面透过这个 “口袋” 形成一个ATP/ ADP结合域。 现已明确这个25kD的N-末端具有格尔德霉素结合位点和根赤霉素结合位点。 HSP90是一种钙结合蛋白， 其N末端可使C末端二聚化， 而C末端具有钙调。
12、蛋白结合位点， 同时 也是蛋白激酶、 肌动蛋白、 微管蛋白及类固醇激素受体等信号转到蛋白的结合位点。 HSP90 其主要功能为胞内信号传导。 如它可与甾体受体结合并维持一种特定的构型， 当受体与甾 体激素结合后， HSP90从复合物中游离出来。 0007 HSP70家族则是研究最多的一类热激蛋白， 在生物体内分布最广， 进化上最保守的 说 明 书 1/7 页 3 CN 106344911 A 3 一类蛋白质。 HSP70具有两个主要的结构域， N端是高度保守的44kD结构域， 且是ATP结合区， C端是25kD的肽链识别结合区。 其中C末端又可分为一个保守的15kD多肽结合功能域和一个 不保守。
13、的近C端10kD的可变功能域。 DnaK(HSC70)的底物结合功能域和部分可变功能域重组 片段的结构主要由两部分组成， N端折叠成一个紧密的 三明治结构； C端由5个 螺旋组成， 形成一个松弛的 螺旋结构。 N端部分的 三明治结构由底部和上部2个片层结构组成， 每个 片层结构都含有4条反向平行的 折叠链， 其中三明治结构底部片层结构由4条链组成， 而上 部的片层结构由另外4条链组成。 在生物体内， 热激蛋白主要是充当分子伴侣的角色， 参与 新生肽的跨膜运输和折叠。 在酵母体内， 含有两种HSP70的成员SSa和SSc， 分别在细胞浆和 细胞核内表达。 肽链刚产生时， 依赖ATP酶的活性与SS。
14、a集合， 当穿过线粒体膜时， 进入线粒 体内与体内合成的SSc结合， 当ATP水解后， 将结合的SSa释放， 在依赖Mg-ATP酶的条件依赖 HSP60、 HSP10分子伴侣的帮助下完成折叠并释放到线粒体内。 同时HSP70也参与胞内信号转 导过程。 0008 上述HSP分子在不同的环境和信号通路中参与了细胞衰老、 凋亡的调控过程。 例如 HSP90与IKK 结合， 曾强了IKK活性， 降解胞内I B， 激活NF- B， 抑制了细胞凋亡。 而HSP70通 过激活HSF1参与了抗衰老基因激活的过程。 除此以外， HSP还广泛参与机体免疫以及能量代 谢过程， 通过调控相关因子减少细胞损伤， 减缓细。
15、胞衰老。 0009 总体而言， HSF1及其编码的HSPs以直接激活抗衰老酶通路或者间接调控抗衰老、 抗凋亡信号通路激活的方式参与了细胞衰老进程。 这类因子尚未开发但有广阔前景的靶 点， 但目前， 国内外都未见有调控HSF1及其编码的HSPs阻止或延缓细胞衰老与死亡的应用。 发明内容 0010 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种用于衰老基因表达调控 的组合物， 该组合物具有激活HSF-1及HSP转录的功能。 0011 本发明的另一目的在于提供一种含有上述组合物的保健品及上述组合物在保健 品中的应用。 0012 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案为： 一种用于衰老基因表达调控的。
16、组合 物， 含有下述组分： 小肽， 白藜芦醇， -羟基- -甲基丁酸盐(HMB)， 肉桂酸， 褐藻素； 所述组合 物还包括葡萄籽提取物和/或亮氨酸。 0013 上述组合物中， 褐藻素为磷酸二酯酶抑制剂。 本发明的组合物由于包含特异应激 信号激活小肽和抗衰老途径激活剂， 其能高效激活HSF-1及HSP转录的功能， 实现体外HSF-1 及HSP的高效调控。 HSF-1及其转录的热激蛋白HSPs密切参与抗衰老酶表达及活性调节过 程， 该过程通过激活体内应激效应因子， 特异激活抗氧化、 抗凋亡途径， 达到抗衰老的目的。 体内HSF-1活性的增加， 可以竞争协同转录增强子NF-B， 从而特异增加腺苷酸环。
17、化酶、 Sirt1和Sirt3活性， 同时协同HSPs协助蛋白折叠和保护特性， 激活抗衰老酶途径。 0014 本发明的组合物获得方便， 且易于通过皮下渗透吸收。 0015 作为本发明所述用于衰老基因表达调控的组合物的优选实施方式， 所述组合物中 各组分的重量份为： 小肽3.05.0份， 白藜芦醇0.0300.6份， -羟基- -甲基丁酸盐0.1 4.0份， 肉桂酸0.020.4份， 褐藻素0.010.1份， 葡萄籽提取物0.64.0份， 亮氨酸0.6 4.0份。 说 明 书 2/7 页 4 CN 106344911 A 4 0016 作为本发明所述用于衰老基因表达调控的组合物的更优选实施方式，。
18、 所述白藜芦 醇为0.0350.5重量份， 所述 -羟基- -甲基丁酸盐为0.23.0重量份。 当白藜芦醇与 -羟 基- -甲基丁酸盐为特定的重量份时， 二者产生协同作用， 本发明组合物调控衰老基因表达 的效果更佳。 0017 作为本发明所述用于衰老基因表达调控的组合物的更优选实施方式， 所述白藜芦 醇为0.0350.5重量份， 所述亮氨酸为0.753.0重量份。 当白藜芦醇与亮氨酸为特定的重 量份时， 二者产生协同作用， 本发明组合物调控衰老基因表达的效果更佳。 0018 作为本发明所述用于衰老基因表达调控的组合物的优选实施方式， 所述小肽由 JKB-A1和JKB-A2组成， 所述JKB-A。
19、1与JKB-A2的重量比为2： 1； 所述JKB-A1为Gla-Glu-Glu- Lys-Ala-Asp-Pro(SEQ ID： 5)所示的序列组成的小肽， 所述JKB-A2为Glu-Glu-Lys-Ala-Asn (SEQ ID： 6)所示的序列组成的小肽。 0019 作为本发明所述用于衰老基因表达调控的组合物的优选实施方式， 所述组合物还 含有烟酸、 维生素B6、 维生素B12、 泛酸、 鸢尾素中的至少一种； 并且所述组合物含有赖氨酸、 谷氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 缬氨酸、 异亮氨酸、 天冬氨酸、 天冬酰胺、 甘氨酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 苯丙氨酸、 酪氨酸、 组氨酸、 丙氨酸、 色氨酸。
20、、 甲硫氨酸、 谷氨酰胺、 牛磺酸、 肉碱、 胱氨酸和半 胱氨酸中的至少一种。 0020 另外， 本发明还提供了一种含有上述组合物的保健品。 上述组合物在保健品中的 用量为保健有效量。 0021 作为本发明所述保健品的优选实施方式， 所述保健品还含有载体。 本发明中的载 体为食品中可用载体或者药用载体， 其通常用在制药或食品保健品配方中， 包括不限于乳 糖、 右旋糖、 蔗糖、 山梨醇、 甘露醇、 淀粉等。 0022 作为本发明所述保健品的优选实施方式， 所述保健品还含有润滑剂、 湿润剂、 增甜 剂、 增香剂、 乳化剂、 悬浮剂、 防腐剂中的至少一种。 0023 本领域技术人员可根据现有的常规技。
21、术， 将保健品的载体和/或赋形剂一起配制， 根据本发明所述的保健品组合物， 最终提供几种形式的单剂量型和多剂量型。 保健品中， 载 体或者润滑剂、 湿润剂、 增甜剂、 增香剂、 乳化剂、 悬浮剂、 防腐剂的用量， 本领域技术人员可 根据现有技术进行选择。 0024 最后， 本发明还提供了上述用于衰老基因表达调控的组合物在保健品中的应用。 0025 与现有技术相比， 本发明的有益效果为： 本发明用于衰老基因表达调控的组合物 够激活HSF-1及其编码的HSPs， 通过直接激活抗衰老酶通路或者间接调控抗衰老、 抗凋亡信 号通路激活的方式减缓肌体衰老。 附图说明 0026 图1为实施例1所述用于衰老基。
22、因表达调控的组合物处理的HeLa细胞系中， HSF-1 及其编码的HSPs的相对表达水平图； 0027 图2为实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物激活抗衰老酶通路关键基因 mRNA表达水平的检测结果图； 0028 图3为经实施例19所述用于衰老基因表达调控的组合物以及对比例1所述组合 物处理的HeLa细胞系中， HSF-1的相对表达水平图； 说 明 书 3/7 页 5 CN 106344911 A 5 0029 图4为经实施例19所述用于衰老基因表达调控的组合物以及对比例1所述组合 物处理的HeLa细胞系中， HSP-27的相对表达水平如图4所示。 具体实施方式 0030 为更好地说明本发。
23、明的目的、 技术方案和优点， 下面将结合附图和具体实施例对 本发明作进一步说明。 0031 实施例中， JKB-A1为Gla-Glu-Glu-Lys-Ala-Asp-Pro(SEQ ID： 5)所示的序列组成 的小肽， JKB-A2为Glu-Glu-Lys-Ala-Asn(SEQ ID： 6)所示的序列组成的小肽。 0032 实施例1 0033 本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例， 本实施例所述用于衰老基 因表达调控的组合物含有下述重量份的组分： 小肽3.0份， 白藜芦醇0.6份， -羟基- -甲基 丁酸盐0.1份， 肉桂酸0.2份， 褐藻素0.05份， 葡萄籽提取物4.0份， 亮。
24、氨酸4.0份； 其中， 所述 小肽由JKB-A1和JKB-A2组成， JKB-A1与JKB-A2的重量比为2： 1。 0034 实施例2 0035 本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例， 本实施例所述用于衰老基 因表达调控的组合物含有下述重量份的组分： 小肽5.0份， 白藜芦醇0.030份， -羟基- -甲 基丁酸盐4.0份， 肉桂酸0.02份， 褐藻素0.1份， 葡萄籽提取物0.6份， 亮氨酸0.6份； 其中， 所 述小肽由JKB-A1和JKB-A2组成， JKB-A1与JKB-A2的重量比为2： 1。 0036 实施例3 0037 本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例，。
25、 本实施例所述用于衰老基 因表达调控的组合物含有下述重量份的组分： 小肽4.0份， 白藜芦醇0.030份， -羟基- -甲 基丁酸盐3.0份， 肉桂酸0.4份， 褐藻素0.01份， 葡萄籽提取物2.0份， 亮氨酸0.6份； 其中， 所 述小肽由JKB-A1和JKB-A2组成， JKB-A1与JKB-A2的重量比为2： 1。 0038 对比例1 0039 本对比例的一种组合物， 其与实施例3所述用于衰老基因表达调控的组合物相比， 不同之处仅在于： 本对比例的组合物不含小肽。 0040 实施例4 0041 本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例， 本实施例所述用于衰老基 因表达调控的组合物。
26、与实施例3所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于白 藜芦醇和 -羟基- -甲基丁酸盐的重量份不同， 本实施例中， 白藜芦醇为0.035重量份， -羟 基- -甲基丁酸盐为1.5重量份。 0042 实施例5 0043 本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例， 本实施例所述用于衰老基 因表达调控的组合物与实施例3所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于白 藜芦醇和 -羟基- -甲基丁酸盐的重量份不同， 本实施例中， 白藜芦醇为0.5重量份， -羟 基- -甲基丁酸盐为3.0重量份。 0044 实施例6 0045 本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例， 本实施例所。
27、述用于衰老基 因表达调控的组合物与实施例3所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于白 说 明 书 4/7 页 6 CN 106344911 A 6 藜芦醇和 -羟基- -甲基丁酸盐的重量份不同， 本实施例中， 白藜芦醇为0.042重量份， -羟 基- -甲基丁酸盐为0.2重量份。 0046 实施例7 0047 本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例， 本实施例所述用于衰老基 因表达调控的组合物与实施例3所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于白 藜芦醇和亮氨酸的重量份不同， 本实施例中， 白藜芦醇为0.035重量份， 亮氨酸为1.5重量 份。 0048 实施例8 004。
28、9 本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例， 本实施例所述用于衰老基 因表达调控的组合物与实施例3所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于白 藜芦醇和亮氨酸的重量份不同， 本实施例中， 白藜芦醇为0.5重量份， 亮氨酸为3.0重量份。 0050 实施例9 0051 本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例， 本实施例所述用于衰老基 因表达调控的组合物与实施例3所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于白 藜芦醇和亮氨酸的重量份不同， 本实施例中， 白藜芦醇为0.042重量份， 亮氨酸为0.75重量 份。 0052 实施例10 0053 本发明用于衰老基因表达调控的组。
29、合物的一种实施例， 本实施例所述用于衰老基 因表达调控的组合物与实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于： 本实施例用于衰老基因表达调控的组合物不含葡萄籽提取物。 0054 实施例11 0055 本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例， 本实施例所述用于衰老基 因表达调控的组合物与实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于： 本实施例用于衰老基因表达调控的组合物不含亮氨酸。 0056 实施例12 0057 本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例， 本实施例所述用于衰老基 因表达调控的组合物与实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于：。
30、 本实施例用于衰老基因表达调控的组合物还含有鸢尾素和丝氨酸。 0058 实施例13 0059 本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例， 本实施例所述用于衰老基 因表达调控的组合物与实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于： 本实施例用于衰老基因表达调控的组合物还含有泛酸和丙氨酸。 0060 实施例14 0061 本发明保健品的一种实施例， 本实施例所述保健品含有实施例1所述用于衰老基 因表达调控的组合物和载体。 0062 实施例15 0063 本发明保健品的一种实施例， 本实施例所述保健品含有实施例2所述用于衰老基 因表达调控的组合物、 载体和润滑剂。 0064 实施例。
31、16 说 明 书 5/7 页 7 CN 106344911 A 7 0065 本发明保健品的一种实施例， 本实施例所述保健品含有实施例3所述用于衰老基 因表达调控的组合物、 载体、 润滑剂和防腐剂。 0066 实施例17 0067 本实施例对实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物激活HSF-1mRNA转录水 平进行了研究， 具体研究方法如下： 0068 提取经实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物处理的HeLa细胞系不同时间 点的总RNA， 利用反转录酶合成相关基因的cDNA第一链， 在适当的温度参数下扩增28-32个 循环。 为了保证实验结果的可靠与准确， 在PCR扩增目的基因时， 加入。
32、一对内参(如 -actin) 的特异性引物， 同时扩增内参DNA， 作为对照。 扩增结果通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。 其 中， 内参基因为 -actin， 上游引物： 5 -TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3 (如SEQ ID： 1所示),下游 引物5 -AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3 ( 如SEQ ID： 2所示 ),HSF-1上游引物5 - GCCTTCCTGACCAAGCTGT-3 (如SEQ ID： 3所示),下游引物： 5 -AAGTACTTGGGCAGCACCTC-3 (如 SEQ ID： 4所示),PCR实验方法参照Sambrook ,Molecular 。
33、Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Pr； 3rd edition.标准操作进行， 采用ABI 7300 实时荧光定量PCR仪进行检测。 经不同含量(0、 20ng/ L、 100ng/ L)实施例1所述用于衰老基 因表达调控的组合物处理的HeLa细胞系中， HSF-1及其编码的HSPs的相对表达水平如图1所 示。 由图1可见， 在本发明用于衰老基因表达调控的组合物加入的条件下， 热激蛋白HSF-1的 转录水平随着抗衰老酶通路激活水平的提高而逐渐升高。 0069 实施例18 0070 本实施例对实施例1所述用于衰老。
34、基因表达调控的组合物激活抗衰老酶通路进行 了研究， 具体研究方法如下： 0071 将实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物在适当稀释比例梯度下与生理盐 水混匀， 肌肉注射给雌性4周龄Wistar大鼠， 每隔24小时注射一次， 共注射3次。 最后一次注 射后12小时检测大鼠组织细胞中抗衰老酶通路关键基因mRNA表达水平。 实施例1所述用于 衰老基因表达调控的组合物激活抗衰老酶通路关键基因mRNA表达水平的检测结果如图2所 示。 由图2可知， 本发明用于衰老基因表达调控的组合物在体内存在的条件下， 基因Bdnf、 lgf1、 Arc、 cFOS、 Npas4、 和Zif268的表达量都出现明显上。
35、调。 0072 实施例19 0073 本实施例比较了实施例19所述用于衰老基因表达调控的组合物以及对比例1所 述组合物激活HSF-1mRNA转录的效果， 具体比较的方法如下： 0074 将实施例19所述用于衰老基因表达调控的组合物(含量为100ng/ L)以及对比 例1所述组合物(含量为100ng/ L)分别用于处理HeLa细胞， 提取经处理的HeLa细胞系不同 时间点的总RNA， 利用反转录酶合成相关基因的cDNA第一链， 在适当的温度参数下扩增28- 32个循环。 为了保证实验结果的可靠与准确， 在PCR扩增目的基因时， 加入一对内参(如 - actin)的特异性引物， 同时扩增内参DNA。
36、， 作为对照。 扩增结果通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴 定。 其中， 内参基因为 -actin， 上游引物： 5 -TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3 (如SEQ ID： 1所 示),下游引物5 -AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3 (如SEQ ID： 2所示),HSF-1上游引物5 - GCCTTCCTGACCAAGCTGT-3 (如SEQ ID： 3所示),下游引物： 5 -AAGTACTTGGGCAGCACCTC-3 (如 SEQ ID： 4所示),PCR实验方法参照Sambrook ,Molecular Cloning:A Laboratory 说 明 书 6/7 页 8。
37、 CN 106344911 A 8 Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Pr； 3rd edition.标准操作进行， 采用ABI 7300 实时荧光定量PCR仪进行检测。 经实施例19所述用于衰老基因表达调控的组合物以及对 比例1所述组合物处理的HeLa细胞系中， HSF-1的相对表达水平如图3所示， HSP-27的相对表 达水平如图4所示； 图3和图4中， NT表示未经本发明用于衰老基因表达调控的组合物或对比 例1所述组合物处理的组别。 0075 由图3和图4可见， 当白藜芦醇为0.0350.5重量份且 -羟基- -甲基丁酸盐为0.2 3.0重量份或者。
38、白藜芦醇为0.0350.5重量份且亮氨酸为0.753.0重量份或者时， HSF- 1和HSP-27的相对表达水平较高； 尤其是当白藜芦醇为0.5重量份且 -羟基- -甲基丁酸盐 为3.0重量份或者白藜芦醇为0.042重量份且亮氨酸为0.75重量份或者时， HSF-1和HSP-27 的相对表达水平达更高。 0076 最后所应当说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制， 尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明， 本领域的普通技术人员应当 理解， 可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。 说 明 书 7/7 页 9 CN 106344911 A 9 0001 序 列 表 1/2 页 10 CN 106344911 A 10 0002 序 列 表 2/2 页 11 CN 106344911 A 11 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 12 CN 106344911 A 12 图3 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 13 CN 106344911 A 13 。