技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种治疗、预防脑白质损伤的医药组合物及其医药用途。
背景技术
大脑主要由灰质和白质构成，其中灰质主要由神经元的胞体和无髓轴突构成，是中枢神经系统的中央处理器，担负着许多大脑的高级功能。脑白质作为大脑的另一个重要组成部分，其由大量的神经纤维构成，形成脑联合纤维、联络纤维和投射纤维，主要包括胼胝体、内囊、前连合和纹状体纤维束等。脑白质具有应答来自于大脑皮层运动和感觉信息并回应其信号给大脑皮层的功能，从而确定认知行为。
脑白质损伤(White Matter Injury，简写WMI)是中枢神经系统损伤的一种重要形式，以中枢神经细胞的髓鞘损害为主要特征，病变如累及专门发挥高级大脑功能的白质束，患者则表现出注意力不集中、健忘和个性改变，直至痴呆、昏迷甚至是死亡。目前，许多神经疾病都涉及到脑白质损伤，如中毒性脑白质变性、缺血性和出血性脑损伤、多发性硬化及脑外伤。以往对于脑损伤的治疗，大多关注于灰质的病理变化及修复过程，白质损伤在很大程度上被忽视。近年来，越来越多的研究表明，白质损伤也成为这些疾病的重要病理过程，对于白质损伤的研究也越来越受到重视。目前，针对脑外伤及脑缺血的治疗药物均未能有效降低病人的死亡率和致残率，很大可能原因就是目前的治疗药物只对神经元胞体损伤有一定保护作用，而对维系神经元之间、皮质与皮质下之间联系的白质部分没有明显的保护作用。
目前，还缺乏确实有效的临床神经保护剂，因此，针对脑白质损伤的治疗需要也越来越迫切。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种治疗、预防脑白质损伤的医药组合物及其医药用途，能够在治疗和预防脑白质损伤方面起到有效的药物作用。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种治疗脑白质损伤的医药组合物，所述医药组合物包括：抗脑白质损伤有效剂量的丝氨酸和医药上可接受的载体。
其中，所述丝氨酸为L-丝氨酸。
其中，所述医药组合物呈剂量单位形式。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种预防脑白质损伤的医药组合物，所述医药组合物包括：防止脑白质损伤的有效剂量的丝氨酸和医药上可接受的载体。
其中，所述丝氨酸为L-丝氨酸。
其中，所述医药组合物呈剂量单位形式。
为解决上述技术问题，本发明采用的又一个技术方案是：提供一种丝氨酸在治疗脑白质损伤的药物的制备中的用途。
其中，所述丝氨酸为L-丝氨酸。
为解决上述技术问题，本发明采用的又一个技术方案是：提供一种丝氨酸在预防脑白质损伤的药物的制备中的用途。
其中，所述丝氨酸为L-丝氨酸。
本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明医药组合物中丝氨酸是一种重要的胶质细胞源性神经营养物质，对神经元存活及神经突起的生长有重要作用，可以抑制炎症反应、促进少突胶质细胞增生。因此，丝氨酸能够在治疗和预防脑白质损伤方面起到有效的药物作用。
附图说明
图1是水迷宫实验中找到平台的潜伏期示意图；
图2是水迷宫实验中保留平台时小鼠的定位导航运动轨迹示意图；
图3是水迷宫实验中撤除平台后小鼠在目标象限停留的时间示意图；
图4是水迷宫实验中撤除平台后小鼠的定位导航运动轨迹示意图；
图5是新物再认实验中各组小鼠在熟悉物体周围和新异物体周围的探索时间示意图；
图6是新物再认实验中各组小鼠的认知指数示意图；
图7是L-丝氨酸对脑白质损伤小鼠绿色荧光标记的小胶质细胞表达情况一图片示意图；
图8是L-丝氨酸对脑白质损伤小鼠绿色荧光标记的小胶质细胞表达情况数据分析示意图；
图9是L-丝氨酸对炎症因子表达的影响情况数据分析示意图；
图10是L-丝氨酸治疗对少突胶质细胞增殖的影响情况一图片示意图；
图11是L-丝氨酸治疗对少突胶质细胞增殖的影响情况数据分析示意图；
图12是L-丝氨酸治疗对小鼠胼胝体区髓鞘超微结构的影响透射电镜示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供一种治疗脑白质损伤的医药组合物，该医药组合物包括：抗脑白质损伤有效剂量的丝氨酸和医药上可接受的载体。
脑白质损伤的主要病理改变包括：从局部水肿到脱髓磷脂；轴突和少突胶质细胞的丢失；轻度胶质细胞增生等组织学变化。少突胶质细胞(oligodendrocyte，简写OLG)是形成和维持髓鞘的基本细胞，在轴突损伤后的脱髓鞘及髓鞘修复过程中发挥主要作用。OLG包绕轴突，形成绝缘的髓鞘结构，协助传递神经电信号，维持和保护神经元的正常生理功能。OLG在成年个体脑中仍能再生，新的OLG主要来源于少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells，简写OPCs)，部分来源于神经干细胞。另外，脑白质高度易感于炎症反应，脑白质损伤往往伴随炎症反应的发生。尽管炎症反应是应对损伤和感染的第一道防线，但过度的炎症反应会加重神经组织的损伤。在中枢神经系统中，主要是小胶质细胞和星形胶质细胞参与炎症反应。在白质损伤过程中，伴随有胶质细胞增殖、活化，并产生促炎因子，进一步损伤神经系统。
丝氨酸是一种重要的胶质细胞源性神经营养物质，对神经元存活及神经突起的生长有重要作用。丝氨酸也是合成磷脂酰丝氨酸、鞘脂、核苷酸及神经递质D-丝氨酸的前体，是中枢神经系统重要的非必需氨基酸。丝氨酸已被用于治疗抑郁症、精神分裂症、慢性疲劳综合征，并用于防止精神运动迟缓、小头畸形。有研究发现，一些神经递质对于内源性神经干细胞具有激活作用，如激活抑制性神经递质GABA受体，可促进神经干细胞的增生。丝氨酸属于机体内源性物质，能够激动抑制性氨基酸甘氨酸(Glycine)受体，对GABA受体也有一定的激动作用。
本申请的发明人在实验研究中发现，丝氨酸治疗可以抑制脱髓鞘损伤，改善小鼠空间学习及记忆能力；丝氨酸对脑白质损伤的治疗作用可能与抑制炎症反应、促进少突胶质细胞增生有关。
其中，丝氨酸为L-丝氨酸。
其中，医药组合物呈剂量单位形式。
本发明还提供一种预防脑白质损伤的医药组合物，该医药组合物包括：防止脑白质损伤的有效剂量的丝氨酸和医药上可接受的载体。
其中，丝氨酸为L-丝氨酸。
其中，医药组合物呈剂量单位形式。
本发明还提供一种丝氨酸在治疗脑白质损伤的药物的制备中的用途。
其中，丝氨酸为L-丝氨酸。
本发明还提供一种丝氨酸在预防脑白质损伤的药物的制备中的用途。
其中，丝氨酸为L-丝氨酸。
本文所述丝氨酸可构成医药组合物的活性成分，且通常可与适当选择的合适赋形剂或载体混合以口服片剂或胶囊的形式给药。例如片剂、胶囊、丸剂、栓剂和散剂等剂量组合物取决于预定的给药方式，其可通过任何可接受的途径。这些给药途径包括经口服、静脉注射(静注)、肌肉注射(肌注)、皮下注射(皮下)。在一名患者中可以使用这些途径中的一或多种。在一实施方式中，本发明的化合物用作口服剂量形式给药且可与无毒的医药上可接受的非活性载体组合，例如水、甘油、乙醇等等。也可以在口服混合物中加入通常用作粘合剂、崩解剂和着色剂的惰性赋形剂。
需要时，所给予的医药组合物也可包含少量的无毒物质，例如pH缓冲剂、乳化剂、乙酸钠等。使用化合物的剂量方案将取决于患者的物种、性别、体重、年龄、医学状况、给药途径以及所治疗病症的严重程度。熟练的医师可以很容易地确定和规定治疗疾病的药物有效剂量。
视患者的疾病和状况而定，本文所用术语“治疗”包括治愈治疗、姑息治疗和预防性治疗中的一种或多种。各活性化合物所施用的精确剂量将根据许多因素而变化，这些因素包括但不限于患者的类型和所治疗疾病状态的类型、患者的年龄、以及给药途径。
对于上述治疗用途来说，所施用的剂量当然会随所施用方式、所需治疗以及所指示的疾病而变化。总日剂量可以单次剂量或分次剂量施用。本发明也涵盖缓释组合物。
举例而言，医药组合物可以呈适合口服投药的形式，如片剂、胶囊、丸剂、散剂、缓释调配物、溶液。医药组合物可以呈适合于精确剂量的单次施用的单位剂量形式。医药组合物将包括常规的医药载体和活性化合物。另外，它可包括其他药用或医药剂、载体、佐剂等。
合适的医药载体包括惰性稀释剂或填充剂、水。若需要，医药组合物可包含另外的成分，例如调味剂、粘合剂和类似成分。因此对于口服给药，含例如柠檬酸等各种赋形剂的片剂可以与各种崩解剂(例如淀粉、海藻酸和某些复合硅酸盐)以及粘合剂(例如蔗糖、明胶和阿拉伯胶)一起采用。另外，例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石等润滑剂经常用于制备片剂。类似类型的固体组合物也可用于软和硬填充明胶胶囊中。这些组合物的有用组分包括乳糖或奶糖和高分子量聚乙二醇。当口服给药需要使用水混悬剂或酏剂时，其中的活性化合物可以与各种增甜剂或调味剂、色素或染料以及视需要乳化剂或助悬剂以及稀释剂(例如水、乙醇、丙二醇、甘油)或其组合相结合。
所述领域的技术人员熟知或将明了制备具有特定量的活性化合物的各种医药组合物的方法。
本文所列剂量范围仅为例示性的，并不打算限制所主张组合物的范围或实践。举例而言，剂量可以根据药物代谢动力学或药效学参数调整，药物代谢动力学或药效学参数可包括临床效应如毒效应和/或实验室值。因此，本发明涵盖本领域技术人员所确定的患者内剂量递增。确定施用化疗剂的合适剂量和方案在相关领域中为人熟知，且一旦提供本文所公开的教义，应被理解为被所述领域的技术人员所涵盖。
本发明的医药组合物可以散装形式、以单个单位剂量形式、或以多个单个单位剂量形式制备、包装或出售。本文所用“单位剂量”是包含预定量的活性化合物的医药组合物的个别量。活性化合物的量通常等于将施用至受试者的活性化合物的剂量、或此一剂量的一个方便的分数，例如，举例而言，此一剂量的一半或三分之一。
本发明医药组合物中活性化合物、医药上可接受的载体、及任何其他成分的相对量将根据所治疗受试者的身份、大小和状况且进一步根据组合物的投药途径而变化。举例来说，组合物可包含0.1％与100％(w/w)之间的活性成分。
除活性化合物外，本发明的医药组合物可进一步包含一种或多种另外的如上所讨论的治疗有效化合物。
下面以具体的数据来说明丝氨酸在脑白质损伤方面提供有效的药物作用。其中，丝氨酸以L-丝氨酸为例。
本申请采用的模型是小鼠脱髓鞘模型，通过向C57/BL6小鼠脑内立体定位注射溶血卵磷脂(lysoph-osphatidylcholine，简写LPC)造成脑白质损伤，之后予以L-丝氨酸治疗，具体步骤如下：腹腔注射水合氯醛将小鼠麻醉，将其固定在脑立体定位仪上。消毒并切开小鼠头皮，暴露前囟，读取前囟坐标。确定胼胝体位置，在对应颅骨处开骨窗，移动立体定位仪垂直标尺，将微量进样器针头置于骨孔处，参照小鼠脑立体定位图谱确定胼胝体坐标，注射体积为1.5μL，注射速度为0.3μL/min，留针10min，缓慢退针。缝合皮肤，术后将小鼠置于笼内正常饲养。治疗组在手术半小时后腹腔注射给药(L-丝氨酸的剂量分别为114mg/kg，342mg/kg，1027mg/kg)，每天两次，连给5天。从第六天开始，进行行为学测试，相应时间点取脑组织进行形态学检测。
其中，NS组是指没有脑白质损伤，只是注射生理盐水的对照组；LPC组是指注射LPC造成脑白质损伤后，没有治疗；114mg/kg组是指注射LPC造成脑白质损伤后，注射L-丝氨酸进行治疗，L-丝氨酸的剂量为114mg/kg；342mg/kg组是指注射LPC造成脑白质损伤后，注射L-丝氨酸进行治疗，L-丝氨酸的剂量为342mg/kg；1027mg/kg组是指注射LPC造成脑白质损伤后，注射L-丝氨酸进行治疗，L-丝氨酸的剂量为1027mg/kg。
各组数据以均数±标准误(means±SEM)表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，LSD法进行两两比较，当P<0.05时认为差异具有统计学意义。
第一、L-丝氨酸对脑白质损伤小鼠行为学的影响，主要从两个方面来评价：
(1)L-丝氨酸对小鼠空间学习记忆的影响
在本实施方式中，通过水迷宫实验来反应L-丝氨酸对小鼠空间学习记忆的影响。
水迷宫实验，实验开始前，将迷宫中水温调至25±1℃并保持，室温保持在25℃，水面高于平台1cm，环境保持安静，动物拿到测试房间适应环境。术前两天开始训练，将动物从各个象限放入，记录其找到平台的时间和活动轨迹，如果60秒内没有找到，则潜伏期记为60秒，每次游泳结束将动物至于平台上10秒。手术第六天开始连续4天的训练，分别记录其找到平台的潜伏期。第10天撤除平台，将动物从平台对角的象限放入，记录动物在一分钟内在目标象限停留的时间。每次测试结束后，用毛巾将动物擦干，注意保暖。实验结果请参见图1至图4，图1是水迷宫实验中找到平台的潜伏期示意图，图2是水迷宫实验中保留平台时小鼠的定位导航运动轨迹示意图，目标平台在第3象限；图3是水迷宫实验中撤除平台后小鼠在目标象限停留的时间示意图，图4是水迷宫实验中撤除平台后小鼠的定位导航运动轨迹示意图。
水迷宫实验主要检测动物的空间学习和记忆能力。从图1可以看出，在连续4天的定位航行实验中，LPC组找到平台的潜伏期较NS组明显延长(P<0.05)，经L-丝氨酸治疗后，找到平台的潜伏期显著缩短(P<0.01)。图3表示撤除平台后，小鼠在目标象限穿越时间与总时间的比值，反映了小鼠的记忆能力。从图中可以LPC组小鼠在目标象限穿越的时间明显少于NS组(P<0.01)，经L-丝氨酸治疗后，342m/kg组小鼠在目标象限穿越的时间增加(P<0.05)。
(2)L-丝氨酸对小鼠新物再认能力的影响
在本实施方式中，通过新物再认实验来反应L-丝氨酸对小鼠新物再认能力的影响。
新物再认实验在旷场的箱体内进行测试。在实验测试前，先将动物放在箱体中30分钟以熟悉环境。实验开始时，将两个完全相同的物体放在箱子的两个角落，将动物从另一边放入，自由活动5分钟，并且保证不被动物移动。自由活动结束后，将动物取出放入饲养笼内10分钟，之后将其中一个物体换成颜色和形状均不同的新物体，并且将熟悉的物体移动位置，以防止小鼠空间偏倚，再次将小鼠放入箱体，摄像机记录小鼠自由探索5分钟的情况。小鼠如果用鼻子在2cm之内指向物体或者嗅、舔则被视为探索行为。观察的主要指标为：在熟悉物体周围探索的时间(TF)，在新物体周围探索的时间(TN)，认知指数(RI)计算：RI＝TN/(TN+TF)×100。每只动物结束测试后，用酒精将迷宫擦拭干净消除异味。实验结果请参见图5和图6，图5是各组小鼠在熟悉物体周围和新异物体周围的探索时间示意图，图6是各组小鼠的认知指数示意图。
实验发现，NS组仍然保留了对新事物的探索能力，在新物体周围停留时间明显多于已熟悉物体(P<0.05)，而LPC组在两个物体周围停留的时间并没有差异，L-丝氨酸治疗后，小鼠在新物体周围停留的时间变多。LPC组的认知指数也显著低于NS组(P<0.01)，L-丝氨酸治疗后，114mg/kg和342mg/kg两组认知指数明显提高(P<0.05)。
第二、L-丝氨酸对脑白质损伤小鼠脑组织小胶质细胞活化的影响：
采用Iba-1标记小胶质细胞并检测，具体方法如下：
(1)取各组脑片六片，采用0.1摩尔/升(M)的磷酸盐缓冲液(PB)进行清洗，清洗3次，每次10分钟。
(2)清洗完毕后，放入24孔板内，采用0.1M的PB和1％Triton在常温下进行破膜，时间是30分钟，然后采用0.01M的PBS和0.3％Triton(pH 7.4)进行清洗，清洗3次，每次10分钟。
(3)清洗完毕后，用5％驴血清封闭液封闭1小时。
(4)加入一抗Iba-1(1：1000，Millipore)，于4℃孵育24小时。
(5)采用0.01M的PBS和0.3％Triton进行清洗，清洗四次，每次时间分别为10分钟、15分钟、20分钟、30分钟。
(6)清洗完毕后，加入二抗(驴抗羊IgG，1：1000)，于常温下避光孵育1小时。
(7)采用0.01M的PBS和0.3％Triton进行清洗，清洗四次，每次时间分别为10分钟、15分钟、20分钟、30分钟。
(8)用含DAPI的封片剂封片。
实验结果请参见图7和图8，在正常脑组织中，绿色荧光标记的小胶质细胞(图7中灰色的点状、分支状或杆状代表绿色荧光标记的小胶质细胞，原始图片是绿色，此处将原始图片中的绿色转变为灰色了)数目较少，其胞体较小，呈分支状或杆状，在损伤组的皮层和胼胝体区，Iba-1阳性标记的小胶质细胞数目均增多，其胞体明显增大，突起增粗，有的呈不规则分支状。经L-丝氨酸治疗的小鼠，其皮质与胼胝体区域小胶质细胞的活化受到抑制，表现为Iba-1阳性标记的小胶质细胞数目减少，胞体有所减小(标尺：100μm)。
第三、L-丝氨酸对炎症因子表达的影响：
请参见图9，注射LPC后，小鼠胼胝体区肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1-β(IL1-β)表达水平显著升高，经L-丝氨酸(342mg/kg)治疗后，两者的表达均受到抑制。
第四、L-丝氨酸治疗对少突胶质细胞增殖的影响：
采用Olig2/BrdU标记少突胶质细胞并检测，具体方法如下：
(1)各组动物在术后第3天开始腹腔注射BrdU溶液(50mg/kg，b.i.d)，连续注射3天，隔5天注射3天，术后28天将动物灌注、取材、固定、脱水并切片(25μm/片)。
(2)采用0.01M的PBS清洗3遍，每次10分钟，放入2N的HCl溶液中，在37℃处理20分钟。
(3)处理完毕后，放入0.01M的PBS清洗3遍，每次10分钟。
(4)清洗完毕后，采用0.01M的PBS加1％Triton进行破膜，时间是10分钟，采用0.01M的PBS加0.3％Triton清洗3遍，每次10分钟。
(5)清洗完毕后，采用5％的血清室温下封闭1小时。
(6)加入一抗Olig2(1：500)和BrdU(1：500)，4℃下孵育24小时。
(7)孵育完毕后，采用0.01M的PBS和0.3％Triton进行清洗，清洗4次，时间分别为10分钟、15分钟、20分钟、30分钟。
(8)加入二抗(驴抗大鼠IgG，1：800；驴抗鼠IgG，1：1000)，常温下避光孵育1小时。
(9)孵育完毕后，采用0.01M的PBS和0.3％Triton进行清洗，清洗4次，时间分别为10分钟、15分钟、20分钟、30分钟。
(10)用含DAPI的封片剂封片。
实验结果请参见图10和图11，为了研究L-丝氨酸治疗对小鼠脱髓鞘后少突胶质细胞增生的影响，本实验观察术后28天脑区BrdU和Olig2阳性表达的细胞数量情况。BrdU和Olig2共标的细胞为再生的少突胶质细胞，Olig2是指Olig2标记的细胞，BrdU是指BrdU标记的细胞，MERGE是指BrdU和Olig2共标的细胞。结果如图10所示，LPC组和治疗组均有少突胶质细胞的再生，而L-丝氨酸治疗组与LPC组比较，再生的细胞显著增多(P<0.05，P<0.01)。结果提示，L-丝氨酸治疗可能促进少突胶质细胞的增生，这可参与髓鞘修复的过程(标尺：100μm)。
第五、L-丝氨酸治疗对小鼠胼胝体区髓鞘超微结构的影响：
如图12所示，图12是透射电镜图，假手术组紧密排列的有髓轴突比较丰富，注射LPC的小鼠轴突周围髓鞘缺失较多，用L-丝氨酸(342mg/kg)治疗后，有髓轴突较损伤组多，提示L-丝氨酸能抑制LPC诱导的脱髓鞘。
综上所述，本申请采用L-丝氨酸治疗脑白质损伤，小鼠在行为学上有明显的改善。水迷宫实验显示，小鼠找到平台的潜伏期显著缩短，在目标对象停留的时间也有所增加，提示小鼠的空间学习和记忆能力有所恢复。新物再认实验结果显示，损伤组小鼠认知指数下降，经治疗后认知指数提高。并且，L-丝氨酸治疗能抑制小胶质细胞的活化和炎症因子的表达。这些结果提示，L-丝氨酸的治疗作用可能与其抑制炎症反应从而保护神经细胞与其突起，减少损伤，以及促进少突胶质细胞增生，促进髓鞘的再生修复，进而促进神经功能的恢复有关。
以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。