一种获得红掌单倍体植株的方法.pdf

本发明公开了一种获得红掌单倍体植株的方法，属于花卉苗木的遗传育种技术领域。方法包括：（1）培养基的配制；（2）花序的选择、低温预处理与消毒；（3）诱导愈伤组织；（4）增殖培养；（5）分化培养；（6）生根培养；（7）移栽炼苗；（8）染色体鉴定；（9）单倍体扩繁等步骤。本发明红掌花序经5-8℃低温预处理24-72h后，能显著提高其无菌花药的获得率和有效愈伤组织的诱导率，从而能有效获得红掌单倍体植株，且操作方法简便、可以作为育种材料进一步从中选育出红掌新品种，缩短育种年限。

1.  一种获得红掌单倍体植株的方法，其特征在于按以下步骤进行：
（1）培养基的配制：包括花药培养各阶段的培养基，其中，
1）诱导培养基：1/2MS基本培养基添加0.5-3mg/L 2,4-D、0.5-2mg/L 6-BA、30-70g/L蔗糖、20g/L葡萄糖、6g/L琼脂粉，pH灭菌前5.8；
2）增殖培养基：MS基本培养基添加1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖，pH灭菌前5.8；
3）分化培养基:MS基本培养基添加1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖，pH灭菌前5.8； 
4）生根培养基:1/2MS基本培养基添加1g/L活性炭、20g/L蔗糖，pH灭菌前5.8；
（2）花序的选择、低温预处理与消毒：待红掌佛焰苞花序抽出后，从中选择苞片即将开展的花序，剪下并除去其苞片，用酒精棉擦洗花序表面后放入培养瓶中，于5-8℃低温条件下处理24-72h；再将该花序用自来水冲洗3-5min，加少量洗洁精，轻轻搓洗片刻后，用自来水冲洗掉洗洁精和表面污染物，再在超净工作台上用75%酒精浸泡30s后，用0.1%升汞溶液摇晃消毒10-15min，倒掉升汞溶液，用无菌水冲洗5次后，备用；
（3）诱导愈伤组织：将低温预处理、消毒的花序用刀片横切，用解剖针剥出花药后，接种到诱导培养基中诱导培养4个月，其中的无菌花药将诱导产生愈伤组织，且对污染花药要及时剔除；
（4）增殖培养：将诱导产生的愈伤组织转接到增殖培养基中，经继代培养至愈伤组织进入增殖期；
（5）分化培养：将快速增殖期的愈伤组织转接种到分化培养基上，诱导分化成芽；
（6）生根培养：当芽长至2cm时，从愈伤组织上切下并转接到生根培养基上诱导生根，长成幼苗；
（7）移栽炼苗：当幼苗长至4-5cm时，将该幼苗从培养瓶移栽到大棚穴盘中炼苗；
（8）染色体鉴定：当移栽苗新根长出后，取其白色幼嫩根尖0.3-0.5 cm，于室温黑暗条件下，用0.002 mol/L 8-羟基喹啉浸渍处理2-3 h；清水洗净后于4℃条件下用95%乙醇∶冰醋酸= 3 ∶1新鲜配制的卡诺固定液固定18-24 h；弃去固定液后将根尖置于37℃水浴中，用0.2mol/L HCl酸解15-20 min后，用蒸馏水冲洗3次；切取该根尖的分生组织放在预先滴一滴石炭酸品红染料的载玻片上，用镊子压碎根尖，弃去残渣，盖上盖玻片后，吸干多余的染料，在40×10倍显微镜下拍照、观察、鉴定；
（9）单倍体扩繁：将确定为单倍体的植株进行组培扩繁。

一种获得红掌单倍体植株的方法
技术领域
    本发明涉及花卉苗木的遗传育种技术领域，具体涉及一种获得红掌单倍体植株的方法。
背景技术
红掌（A.andraeanum）又名安祖花、花烛等，天南星科花烛属，原产哥伦比亚，是一种多年生、常绿、四季开花、观花观叶兼可的草本植物，可分为切花和盆栽两大类。由于红掌的花型奇特、颜色鲜艳多彩、生性耐荫、观赏期长等特点，在国内外的市场消费量很大，在全球热带花卉贸易中仅次于兰花名列第二。
单倍体（Haploid）是指具有配子染色体（n）的个体，一般是利用花药、花粉作外殖体进行组织培养，从小孢子经愈伤组织或胚状体产生植株，或以孤雌生殖、人工引变等方式产生具有配子体染色全数的植株（单倍体植株）。在育种上利用单倍体具有克服杂种分离、缩短育种年限和提高获得纯和材料的效率等优点。单倍体育种在粮食和果蔬作物上已研究较多，并已育成了一些烟草、水稻、小麦等优良品种，但对单倍体观赏植物的研究还处于起步阶段。目前红掌育种的主要方法还是以传统的杂交育种为主，存在育种周期长、进程慢、后代不稳定等问题，在国内还未见有关于红掌花药培养单倍体成功的文献报道。
发明内容
    本发明目的是，针对红掌传统杂交育种存在周期长、进程慢、后代不稳定等问题，提出一种能克服杂种分离、缩短育种年限、获得高纯度红掌单倍体育种材料的方法，并进一步可从中选育出红掌的新品种。
本发明目的通过以下技术方案得以实现：
一种获得红掌单倍体植株的方法，该方法按以下步骤进行：
（1）培养基的配制：包括花药培养各阶段的培养基，其中，
1）诱导培养基：1/2MS基本培养基添加0.5-3mg/L 2,4-D、0.5-2mg/L 6-BA、30-70g/L蔗糖、20g/L葡萄糖、6g/L琼脂粉，pH灭菌前5.8；
2）增殖培养基：MS基本培养基添加1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖，pH灭菌前5.8；
3）分化培养基:MS基本培养基添加1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖，pH灭菌前5.8； 
4）生根培养基:1/2MS基本培养基添加1g/L活性炭、20g/L蔗糖，pH灭菌前5.8；
（2）花序的选择、低温预处理与消毒：待红掌佛焰苞花序抽出后，从中选择苞片即将开展的花序，剪下并除去其苞片，用酒精棉擦洗花序表面后放入培养瓶中，于5-8℃低温条件下处理24-72h；再将该花序用自来水冲洗3-5min，加少量洗洁精，轻轻搓洗片刻后，用自来水冲洗掉洗洁精和表面污染物，再在超净工作台上用75%酒精浸泡30s后，用0.1%升汞溶液摇晃消毒10-15min，倒掉升汞溶液，用无菌水冲洗5次后，备用；
    （3）诱导愈伤组织：将低温预处理、消毒的花序用刀片横切，用解剖针剥出花药后，接种到诱导培养基中诱导培养4个月，其中的无菌花药将诱导产生愈伤组织，且对污染花药要及时剔除；
（4）增殖培养：将诱导产生的愈伤组织转接到增殖培养基中，经继代培养至愈伤组织进入增殖期；
（5）分化培养：将快速增殖期的愈伤组织转接种到分化培养基上，诱导分化成芽；
（6）生根培养：当芽长至2cm时，从愈伤组织上切下并转接到生根培养基上诱导生根，长成幼苗；
（7）移栽炼苗：当幼苗长至4-5cm时，将该幼苗从培养瓶移栽到大棚穴盘中炼苗；
（8）染色体鉴定：当移栽苗新根长出后，取其白色幼嫩根尖0.3-0.5 cm，于室温黑暗条件下，用0.002 mol/L 8-羟基喹啉浸渍处理2-3 h；清水洗净后于4℃条件下用95%乙醇∶冰醋酸= 3 ∶1新鲜配制的卡诺固定液固定18-24 h；弃去固定液后将根尖置于37℃水浴中，用0.2mol/L HCl酸解15-20 min后，用蒸馏水冲洗3次；切取该根尖的分生组织放在预先滴一滴石炭酸品红染料的载玻片上，用镊子压碎根尖，弃去残渣，盖上盖玻片后，吸干多余的染料，在40×10倍显微镜下拍照、观察、鉴定；
（9）单倍体扩繁：将确定为单倍体的植株进行组培扩繁。
本发明具有以下几方面的有益效果：
1、本发明的红掌花序经5-8℃低温预处理24-72小时后，能有效提高无菌花药的获得率和有效愈伤组织的诱导率。如品种‘阿拉巴马（Alabamb）’的花序经过5-8℃低温预处理24-72h后，无菌花药的获得率平均为49.73%，而对照为26.7%，提高了86.25%；有效愈伤诱导率平均为24.24%，而对照为13.47%，提高了79.92%；单倍体诱导率平均为33.75%，而对照为20%，提高了68.75%；对品种‘燕尾红（Loattails Red）’来说，效果更加明显，无菌花药的获得率从对照的7.14%提高到平均25.43%，有效愈伤诱导率从对照0提高到平均11.85%，单倍体诱导率从对照0提高到平均30%。（见试验例）.
（2）本发明中的红掌花序5-8℃低温预处理24-72h比现有的报道10℃低温预处理3d（杜宝贵，黄丽娟，张志胜等. 红掌花药培养. 生物技术通讯，2009年增刊：189-195.）能有效提高花药膨大率和有效愈伤组织的诱导率。10℃低温预处理3d后的花药膨大率最高为17.33%，花药有效愈伤诱导率最高为1.67%，而本发明中的花药膨大率最高为87%；花药有效愈伤诱导率最高为29%。（见实施例6、7和2）
（3）本发明能有效得到红掌单倍体，而之前的有关报道表明得到的花药再生植株均是二倍体，并没有得到红掌单倍体。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的具体说明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1：（获得红掌品种‘阿拉巴马（Alabamb）’单倍体植株的方法1）
该方法按以下步骤进行：
（1）培养基的配制：包括花药培养各阶段的培养基，其中，
1）诱导培养基：1/2MS基本培养基添加0.5mg/L 2,4-D、0.5mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、20g/L葡萄糖、6g/L琼脂粉，pH灭菌前5.8； 
2）增殖培养基:MS基本培养基添加1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖，pH灭菌前5.8；
 3）分化培养基:MS基本培养基添加1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖，pH灭菌前5.8； 
4）生根培养基:1/2MS基本培养基添加1g/L活性炭、20g/L蔗糖，pH灭菌前5.8； 
（2）花序的选择、低温预处理与消毒：以红掌品种‘阿拉巴马（Alabamb）’为试材，待佛焰苞花序抽出后，从中选择苞片即将开展的花序，剪下并除去其苞片，用酒精棉擦洗花序表面后放入培养瓶中，于5℃低温条件下处理24h；将该花序用自来水冲洗3-5min后，加少量洗洁精，轻轻搓洗片刻后，用自来水冲洗掉洗洁精和表面污染物，再在超净工作台上用75%酒精浸泡30s后，用0.1%升汞溶液摇晃消毒10-15min；倒掉升汞溶液，用无菌水冲洗5次后，备用；
（3）诱导愈伤组织：将低温预处理与消毒后的花序用刀片横切，用解剖针剥出花药后，按每瓶接种30-50粒花药接种到诱导培养基中，在25-27℃自然散射光下培养，共接种10瓶；其中的无菌花药将诱导产生愈伤组织，污染花药则需及时剔除，共诱导培养4个月，该例7d后得到的无菌花药率为42.00%, 15d花药膨大率为76.14%，40d后有效愈伤诱导率为20.00%；
（4）增殖培养：将诱导产生的愈伤组织转接到增殖培养基中，经继代培养至愈伤组织进入增殖期；
    （5）分化培养：将快速增殖期的愈伤组织接种到分化培养基上，诱导分化成芽；
    （6）生根培养：当幼苗芽长至2cm时，将其从愈伤组织上切下并转接至生根培养基上，4d后开始长根, 20d后根长至1-2cm， 50d后全部生根；
（7）移栽炼苗：当幼苗长至4-5cm时，将该幼苗从培养瓶移栽到大棚穴盘中炼苗；
    （8）染色体鉴定：当移栽苗新根长出后，取其白色幼嫩根尖0.3cm，于室温黑暗条件下，用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理3 h；用清水洗净，于4℃条件下用95%乙醇∶冰醋酸= 3 ∶1新鲜配制的卡诺固定液固定18 h；弃去固定液后将根尖置于37℃水浴中，用0.2mol/L HCl酸解15 min后并用蒸馏水冲洗3次；切取该根尖的分生组织放在预先滴一滴石炭酸品红染料的载玻片上，用镊子压碎根尖，弃去残渣，盖上盖玻片，吸干多余的染料，在40×10倍显微镜下拍照、观察、鉴定染色体，其中有35%左右的苗为单倍体；
（9）单倍体扩繁：将确定为单倍体的植株进行组培扩繁后，分化形成的新苗均为单倍体。
 
实施例2：（获得红掌品种‘阿拉巴马（Alabamb）’单倍体植株的方法2）：
本例中，步骤（1）诱导培养基配方添加的2,4-D为1.5mg/L， 6-BA为1mg/L，蔗糖为45g/L；步骤（2）花序于6℃低温条件下处理36h；步骤（8）取其白色幼嫩根尖0.4cm，用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理2.5 h，用卡诺固定液固定20 h，用0.2mol/L HCl酸解17 min；其余步骤工艺同于实施例1，结果：步骤（3）得到的无菌花药率为59.42%,花药膨大率为75.50%，有效愈伤诱导率为29.00%，步骤（8）中单倍体苗比例为40%左右。
 
实施例3：（获得红掌品种‘阿拉巴马（Alabamb）’单倍体植株的方法3）：
本例中，步骤（1）诱导培养基配方添加的2,4-D为2.5mg/L， 6-BA为1.5mg/L，蔗糖为55g/L；步骤（2）花序于7℃低温条件下处理48h；步骤（8）取其白色幼嫩根尖0.5cm，用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理2.5 h，用卡诺固定液固定22 h，用0.2mol/L HCl酸解19 min；其余步骤工艺同于实施例1，结果：步骤（3）得到的无菌花药率为43.33%，花药膨大率为60.82%，有效愈伤诱导率为19.21%，步骤（8）中单倍体苗的比例为30%左右。
 
实施例4：（获得红掌品种‘阿拉巴马（Alabamb）’单倍体植株的方法4）：
本例中，步骤（1）诱导培养基配方添加的2,4-D为3mg/L， 6-BA为2mg/L，蔗糖为70g/L；步骤（2）花序于8℃低温条件下处理72h；步骤（8）取其白色幼嫩根尖0.4cm，用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理2 h，用卡诺固定液固定24 h，用0.2mol/L HCl酸解20 min；其余步骤工艺同于实施例1，结果：步骤（3）得到的无菌花药率为23.5%，花药膨大率为83.78%，有效愈伤诱导率为23%，步骤（8）中单倍体苗的比例为30%左右。
 
实施例5：（获得红掌品种‘燕尾红（Loattails Red）’单倍体植株的方法5）：
本例中，步骤（1）诱导培养基配方添加的2,4-D为0.5mg/L， 6-BA为0.5mg/L，蔗糖为30g/L；步骤（2）以红掌品种‘燕尾红（Loattails Red）’为试材，其花序于5℃低温条件下处理24h；步骤（8）取其白色幼嫩根尖0.3cm，用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理3 h，用卡诺固定液固定18 h，用0.2mol/L HCl酸解15 min；其余步骤工艺同于实施例1，结果：步骤（3）得到的无菌花药率为24.5%，花药膨大率为70.61%，有效愈伤诱导率为5%，步骤（8）中单倍体苗的比例为30%左右。
 
实施例6：（获得红掌品种‘燕尾红（Loattails Red）’单倍体植株的方法6）：
本例中，步骤（1）诱导培养基配方添加的2,4-D为1.5mg/L， 6-BA为1mg/L，蔗糖为45g/L；步骤（2）以红掌品种‘燕尾红（Loattails Red）’为试材，其花序于6℃低温条件下处理36h；步骤（8）取其白色幼嫩根尖0.4cm，用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理2.5 h，用卡诺固定液固定20 h，用0.2mol/L HCl酸解17 min；其余步骤工艺同于实施例1，结果：步骤（3）得到的无菌花药率为33.3%，花药膨大率为87.71%，有效愈伤诱导率为13.49%，步骤（8）中单倍体苗的比例为35%左右。
 
实施例7：（获得红掌品种‘燕尾红（Loattails Red）’单倍体植株的方法7）：
本例中，步骤（1）诱导培养基配方添加的2,4-D为2.5mg/L， 6-BA为1.5mg/L，蔗糖为55g/L；步骤（2）以红掌品种‘燕尾红（Loattails Red）’为试材，其花序于7℃低温条件下处理48h；步骤（8）取其白色幼嫩根尖0.4cm，用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理2.5 h，用卡诺固定液固定22 h，用0.2mol/L HCl酸解19 min；其余步骤工艺同于实施例1，结果：步骤（3）得到的无菌花药率为20.5%，花药膨大率为87.8%，有效愈伤诱导率为12%，步骤（8）中单倍体苗的比例为30%左右。
 
实施例8：（获得红掌品种‘燕尾红（Loattails Red）’单倍体植株的方法8）：
本例中，步骤（1）诱导培养基配方添加的2,4-D为3mg/L， 6-BA为2mg/L，蔗糖为70g/L；步骤（2）以红掌品种‘燕尾红（Loattails Red）’为试材，其花序于8℃低温条件下处理72h；步骤（8）取其白色幼嫩根尖0.5cm，用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理2 h，用卡诺固定液固定24 h，用0.2mol/L HCl酸解20 min；其余步骤工艺同于实施例1，结果：步骤（3）得到的无菌花药率为18.37%，花药膨大率为86.19%，有效愈伤诱导率为12.73%，步骤（8）中单倍体苗的比例为35%左右。
 
试验例（不同品种不同花序预处理对花药诱导培养的影响试验）：
    本试验于2011年在杭州进行，红掌参试品种2个为 ‘阿拉巴马（Alabamb）’和 ‘燕尾红（Loattails Red）’，花序低温预处理设为5℃/24h、6℃/36h、7℃/48h、8℃/72h及不预处理直接消毒接种（对照）共5个，其余步骤工艺均相同。每个处理接种15瓶，每瓶约接30-50个花药，一个花序约可接5瓶，接种后在25℃左右自然散射光下培养。在培养过程中：每隔3-5天观察并记录污染花药数一次；40天后统计膨大的花药个数；4个月后统计成活愈伤组织块数；8个月后瓶苗移栽；12个月后进行染色体鉴定。并按照下述公式计算无菌花药率、花药膨大率和有效愈伤诱导率：
无菌花药率=无污染瓶数/接种总瓶数×100%，
花药膨大率=发生膨大的花药数/无菌花药总数×100%，
有效愈伤诱导率=愈伤成活数/无菌花药总数×100%。
试验结果表明： 5-8℃低温预处理24-72h均能有效提高无菌花药的获得率、有效愈伤组织的诱导率以及单倍体诱导率（见表1）。品种‘阿拉巴马（Alabamb）’的花序经过5-8℃低温预处理24-72h后，无菌花药的获得率平均为49.73%，而对照为26.7%，提高了86.25%；有效愈伤诱导率平均为24.24%，而对照为13.47%，提高了79.92%；单倍体诱导率平均为33.75%，而对照为20%，提高了68.75%；对品种‘燕尾红（Loattails Red）’来说，效果更加明显，无菌花药的获得率从对照7.14%提高到平均25.43%，有效愈伤诱导率从对照0提高到平均11.85%，单倍体诱导率从对照0提高到平均30%。
表1 不同品种不同预处理的花药诱导培养结果