一种利用MFH融合蛋白制备GLP1多肽或其类似物方法和应用.pdf

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1、10申请公布号CN104098702A43申请公布日20141015CN104098702A21申请号201410353241422申请日20140723C07K19/00200601C12N15/70200601C07K1/30200601C07K1/22200601C07K1/20200601C07K14/605200601C12P21/06200601A61K38/26200601A61P3/1020060171申请人湖北工业大学地址430068湖北省武汉市武昌区南湖李家墩1村1号72发明人苏正定吴刚赵以军李祝74专利代理机构武汉科皓知识产权代理事务所特殊普通合伙42222代理人常海涛5。

2、4发明名称一种利用MFH融合蛋白制备GLP1多肽或其类似物方法和应用57摘要本发明公开了一种利用MFH融合蛋白制备GLP1多肽或其类似物方法和应用，属于生物技术领域。GLP1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的结构式为MFHDPH6E7PEP，其中，MFH为蛋白融合载体；DP为甲酸水解位点；H6为组氨酸标签；E7为专一性蛋白酶切位点；PEP为GLP1多肽或其类似物。将编码DPH6E7PEP的DNA连接到PMFH质粒上再转入大肠杆菌，通过原核表达得到MFHDPH6E7PEP融合蛋白，利用甲酸水解、专一性蛋白酶水解和亲和层析得到GLP1多肽或其类似物。本发明达到了多肽大规模高效表达、多肽释放工艺步骤少。

3、、条件温和、生产成本低的目的，适合工业化生产。51INTCL权利要求书2页说明书10页序列表5页附图8页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书10页序列表5页附图8页10申请公布号CN104098702ACN104098702A1/2页21一种GLP1多肽或其类似物的MFH融合蛋白，其特征在于结构式为MFHDPH6E7PEP；其中，MFH为蛋白融合载体；DP为L天冬氨酸L脯氨酸序列；H6为组氨酸标签，序列为L组氨酸1L组氨酸2L组氨酸3组氨酸4L组氨酸5L组氨酸6；E7为专一性蛋白酶切位点，其序列为L谷氨酸1L天冬氨酸2L亮氨酸3L酪氨酸4L苯丙氨酸5L谷氨酰胺6。

4、LX，X为除脯氨酸以外的任意L型氨基酸；PEP为GLP1多肽或其类似物，GLP1的类似物包括R34，GLP1多肽和R34的氨基酸序列分别如SEQIDNO1和2所示。2权利要求1所述的GLP1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤（1）将编码DPH6E7PEP的DNA序列连接到PMFH质粒上构建GLP1多肽或其类似物的原核表达质粒PMFHPEP；（2）将PMFHPEP质粒转化到大肠杆菌BL21中得到表达融合蛋白MFHDPH6E7PEP的工程菌；（3）融合蛋白表达将表达MFHDPH6E7PEP的工程菌培养至菌液OD600达到0910时，添加诱导剂IPTG或乳糖继续发酵6小。

5、时以上，融合蛋白表达在包涵体中。3根据权利要求2所述的GLP1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的制备方法，其特征在于诱导剂为IPTG时，融合蛋白表达的方法为将表达融合蛋白MFHDPH6E7PEP的工程菌接种于LB中，37培养到OD600值达到0910时，添加诱导剂IPTG，终浓度为063MM，继续发酵1012小时；诱导剂为乳糖时，融合蛋白表达的方法为将表达融合蛋白MFHDPH6E7PEP的工程菌接种于发酵培养基中，37培养到OD600值达到0910时，加入诱导前补液；1小时后，先后再加入乳糖诱导液、乳糖后补料液，继续发酵培养816小时；发酵培养基为葡萄糖5G/L、酵母浸膏15G/L、酪蛋白水解物。

6、20G/L、氯化钠5G/L、硫酸铵1G/L、磷酸氢二钾5G/L、磷酸二氢钾2G/L、柠檬酸1G/L、硫酸镁05G/L，微量元素溶液1ML/L，用去离子水配制初始PH6580；微量元素溶液为硫酸亚铁32G/L、氯化亚锰1G/L、硝酸钴15G/L、氯化钙1G/L、氯化铜00505G/L、硫酸锌04G/L、硼酸03G/L和钼酸钠0842G/L溶于1MOL/L盐酸中；诱导前补液为葡萄糖300G/L、硫酸镁12G/L、氯化铵45G/L，用去离子水配制；乳糖诱导液为乳糖180G/L、酵母浸膏180G/L、硫酸镁7G/L，用去离子水配制；诱导后补料液为甘油300G/L、乳糖75G/L、硫酸镁7G/L，用去离。

7、子水配制。4根据权利要求2所述的GLP1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的制备方法，其特征在于还包括乙醇沉淀纯化，乙醇沉淀纯化包括如下步骤（1）离心收集上述诱导表达的菌体，再用含6M尿素的PBS缓冲液重悬菌体后进行破碎，离心收集总蛋白上清液；（2）往总蛋白上清液中加入等体积乙醇沉淀28小时，离心弃沉淀获取一次乙醇上清液；（3）往一次乙醇上清液中加入等体积乙醇第二次沉淀812小时，离心弃上清液，沉淀为纯化的GLP1多肽或其类似物的MFH融合蛋白。5根据权利要求4所述的GLP1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的制备方法，其特征权利要求书CN104098702A2/2页3在于所述的乙醇沉淀纯化包括如下步。

8、骤（1）50006000转/分离心1530MIN收集诱导表达的菌体，用含6M尿素的PBS缓冲液重悬菌体，搅拌30分钟，重悬液经超声波短暂预处理1分钟，再经高压均质机处理破粹细胞，细胞破粹液经12000转/分离心2030分钟，获取总蛋白上清液；（2）往总蛋白上清液中加入等体积乙醇于20沉淀28小时，12000转/分离心2030分钟，弃沉淀获取一次乙醇上清液；（3）往一次乙醇上清液中加入等体积乙醇于20第二次沉淀812小时，12000转/分离心2030分钟，弃上清液，沉淀为纯化的GLP1多肽或其类似物的MFH融合蛋白。6一种制备GLP1多肽或其类似物的方法，其特征在于包括如下步骤（1）将纯化的GL。

9、P1多肽或其类似物的MFH融合蛋白溶解于5060甲酸溶液，4550保温3656小时至水解完全；（2）旋蒸浓缩甲酸水解液，调PH值至7580，加入尿素、咪唑和PBS使体系为含6M尿素和5MM咪唑的PH7580的1PBS溶液，离心去沉淀，上清液含带组氨酸标签的多肽PH6E7PEP；（3）上清液用NINTA亲和层析纯化，用含6M尿素的磷酸缓冲液洗涤35次，再用不含尿素的磷酸缓冲液洗涤35次，最后用含150MM咪唑的磷酸缓冲液洗脱；（4）往洗脱液中加E7蛋白酶水解38小时，蛋白酶水解液用磷酸缓冲液透析812小时，直接上样NINTA柱去除蛋白酶和组氨酸标签，流出液为多肽盐溶液；（5）调节多肽盐酸液PH值。

10、至35以下，SEPPAKC18反相树酯层析柱用含2醋酸或甲酸的10乙腈溶液预处理；酸化后的多肽盐溶液上样预处理过的SEPPAKC18反相树酯层析柱，用含2醋酸或甲酸的10乙腈溶液洗涤除盐，洗涤体积为柱体积的35倍；用含50的乙腈溶液洗脱，洗脱体积为柱体积的23倍；洗脱液经过旋蒸浓缩，冻干，得到初纯化的目的多肽；或将纯化的GLP1多肽或其类似物的MFH融合蛋白用TRISHCL溶液稀释溶解后，直接用E7蛋白酶水解制备GLP1多肽或其类似物。7根据权利要求6所述的制备GLP1多肽或其类似物的方法，其特征在于步骤（4）中所述的E7蛋白酶为如SEQIDNO3所示的TEV蛋白酶或该TEV蛋白酶变种S219。

11、A、G148L或L33A，带组氨酸标签；E7蛋白酶的加入量为05MGE7/MG多肽。8根据权利要求6所述的制备GLP1多肽或其类似物的方法，其特征在于还包括利用C18反相层析柱对初纯化的多肽进行精制，具体包括如下步骤初纯化的GLP1多肽或其类似物用含2醋酸或甲酸的10乙腈溶液溶解和过滤，C18反相层析柱用含2醋酸或甲酸的10乙腈溶液预处理；肽溶液上样预处理过的C18反相层析柱，用1070线性梯度洗脱，收集目标多肽组分，旋蒸浓缩，冻干。9权利要求1所述的融合蛋白、权利要求25任一项所述的融合蛋白的制备方法或权利要求68任一项所述的制备GLP1多肽或其类似物的方法在制备治疗2型糖尿病多肽药物制剂中。

12、的应用。10根据权利要求9所述的应用，其特征在于在制备利拉鲁肽前体多肽或利拉鲁肽中的应用。权利要求书CN104098702A1/10页4一种利用MFH融合蛋白制备GLP1多肽或其类似物方法和应用技术领域0001本发明属于生物技术领域，涉及重组多肽的制备，具体涉及一种利用MFH融合蛋白制备GLP1多肽或其类似物方法和应用。背景技术0002多肽是一类重要的生物分子，由小于80个氨基酸连接起来、呈一定空间结构的一类化合物。多肽参与生物体内各种细胞的生化反应过程，是人体最重要的功能调节剂之一。作为生物体内各种细胞功能的生物活性物质，多肽涉及到激素、神经、细胞生长和生殖等各个领域。与小分子化学药相比，多。

13、肽类药物往往更为安全、副作用更小，很少引起严重的免疫反应。多肽类物质分子结构小、易改造、易合成，已广泛应用于医药、食品、保健品、化妆品、生物材料、生物农药等众多领域，其中在医药行业应用领域主要包括多肽疫苗、多肽诊断试剂、多肽芯片、多肽药物等产品。随着化学和生命科学的进步，近年来多肽类药物的研发和上市出现了逐步加速的趋势。多肽类药物主要用于治疗癌症、代谢类疾病、心血管疾病和传染性疾病，内分泌类疾病、血液病和疼痛缓解等众多方向也都可应用多肽类药物。0003多肽药物的制备目前主要有化学合成、基因重组和从动植物组织细胞中提取三种方法。化学合成法中的固相多肽合成技术免去了液相多肽合成法过程中的纯化步骤，。

14、便于自动化操作，对多肽药物的规模发展起到了极大地推进作用。但是，对长度大于30个氨基酸的多肽，化学合成法有一定的困难，主要是产率低和成本高。在化学合成多肽药物快速成长之际，基因重组表达制备多肽药物也引起业内关注。与化学合成相比，基因重组方式更适于长肽的制备；而且随着技术的进步，以基因重组方式生产多肽药物的成本也在不断降低。化学合成和基因重组表达将在很长一段时间内成为互为补充的多肽药物生产方式。0004重组生产多肽拥有化学合成许多优点，包括产量高，成本低，易于规模化和减少对环境的污染。常用于重组多肽表达的宿主细胞有大肠杆菌、枯草杆菌和酵母菌等。由于在细胞内多肽的稳定性差，直接表达通常导致低收率，。

15、事实上表达在宿主细胞中的肽被内源性蛋白酶很快降解，由宿主细胞同化。为了克服这个问题，多肽通常以融合蛋白的形式表达。作为融合蛋白的一部分，肽可被定向到特定的细胞区室或以包涵体形式实现高产量表达和避免被细胞蛋白酶降解。0005用于多肽表达的融合载体已有许多已经商业化。例如GE公司的GST融合蛋白，NEB公司的MBP融合蛋白等为较大融合蛋白载体，NOVAGEN公司的KSI为较小的融合蛋白，都已经商品化，在多肽制备方面的逐渐得到广泛应用。另外，GB1US8221998和MFHUS7390639等较小的融合蛋白更具有产率高的优点。因此，裂解融合蛋白，有效释放多肽为重组多肽生产的一个重要关键技术。利用目前。

16、的化学裂解、蛋白酶水解融合蛋白小规模制备多肽小于20毫克较成功。但直接用于工业化生产临床需求多肽产品，仍不成功，如化学裂解法释放方法，易产生杂质多肽，严重影响后续纯化过程，而且，专一性较好的化学试剂溴化氰具有剧毒，工艺条件要求高，不适合工业化应用。酶法水解要求融合蛋白水说明书CN104098702A2/10页5溶性高，融合蛋白多是包涵体，无法直接溶于蛋白酶水解缓冲液。而且酶法水解需要专一的氨基酸序列。酶法水解工业化生产所需蛋白酶酶用量大，直接影响生产成本。目前广泛使用的专一性蛋白酶，如凝血酶、肠激酶、FACTORXA来源单一，生产条件苛刻，产量低，无法满足工业化应用。虽然TEV蛋白酶可以大规模。

17、发酵制备，但同许多蛋白酶一样，水解产物仍然残留多余氨基酸。发明内容0006本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用MFH融合蛋白制备GLP1多肽或其类似物方法和应用。0007本发明的目的通过下述技术方案实现0008一种GLP1多肽或其类似物的MFH融合蛋白，其结构式为MFHDPH6E7PEP。其中，MFH为蛋白融合载体；DP为L天冬氨酸L脯氨酸序列；H6为组氨酸标签，序列为L组氨酸1L组氨酸2L组氨酸3组氨酸4L组氨酸5L组氨酸6；E7为专一性蛋白酶切位点，其序列为L谷氨酸1L天冬氨酸2L亮氨酸3L酪氨酸4L苯丙氨酸5L谷氨酰胺6LX，X为除脯氨酸以外的任意L型氨基酸；PEP为G。

18、LP1多肽或其类似物，GLP1多肽氨基酸序列见图1B及SEQIDNO1，GLP1的类似物为R34，即GLP1的第34位赖氨酸置换成精氨酸，其氨基酸序列见图2B及SEQIDNO2。0009本发明在融合蛋白载体MFH与目标多肽PEP之间以甲酸水解、亲和层析标签和蛋白酶氨基酸序列连接DPH6E7，整合了“融合蛋白甲酸水解、蛋白酶水解和亲和层析”优点，避免融合蛋白单一释放多肽工艺中融合蛋白不溶和多杂质的缺点。甲酸水解位点DP直接连接与融合蛋白载体之后，有利于多肽释放，释放的多肽易于溶于缓冲液，有利于后期蛋白酶水解工艺。0010上述GLP1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的制备方法为采用PMFH质粒在宿主。

19、菌中表达，具体包括如下步骤00111将编码DPH6E7PEP的DNA序列连接到PMFH质粒上构建GLP1多肽或其类似物的原核表达质粒PMFHPEP。00122将PMFHPEP质粒转化到大肠杆菌BL21中得到表达融合蛋白MFHDPH6E7PEP的工程菌。00133融合蛋白表达将表达MFHDPH6E7PEP的工程菌培养至菌液OD600达到0910时，添加诱导剂IPTG或乳糖继续发酵6小时以上，融合蛋白表达在包涵体中。0014其中，诱导剂为IPTG时，融合蛋白表达的方法优选为将表达融合蛋白MFHDPH6E7PEP的工程菌接种于LB中，37培养到OD600值达到0910时，添加诱导剂IPTG，终浓度为。

20、063MM，继续发酵1012小时。0015诱导剂为乳糖时，融合蛋白表达的方法优选为将表达融合蛋白MFHDPH6E7PEP的工程菌接种于发酵培养基中，37培养到OD600值达到0910时，加入诱导前补液；1小时后，先后再加入乳糖诱导液、乳糖后补料液，继续发酵培养816小时。发酵培养基为葡萄糖5G/L、酵母浸膏15G/L、酪蛋白水解物20G/L、氯化钠5G/L、硫酸铵1G/L、磷酸氢二钾5G/L、磷酸二氢钾2G/L、柠檬酸1G/L、硫酸镁05G/L，微量元素溶液1ML/L，用去离子水配制初始PH6580；微量元素溶液为硫酸亚铁32G/L、氯化亚锰说明书CN104098702A3/10页61G/L、。

21、硝酸钴15G/L、氯化钙1G/L、氯化铜00505G/L、硫酸锌04G/L、硼酸03G/L和钼酸钠0842G/L溶于1MOL/L盐酸中。诱导前补液为葡萄糖300G/L、硫酸镁12G/L、氯化铵45G/L，用去离子水配制；乳糖诱导液为乳糖180G/L、酵母浸膏180G/L、硫酸镁7G/L，用去离子水配制；诱导后补料液为甘油300G/L、乳糖75G/L、硫酸镁7G/L，用去离子水配制。0016所述的GLP1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的制备方法还包括乙醇沉淀纯化，乙醇沉淀纯化具体包括如下步骤00171离心收集上述诱导表达的菌体，再用含6M尿素的PBS重悬菌体后进行破碎，离心收集总蛋白上清液。00。

22、182往总蛋白上清液中加入等体积乙醇沉淀28小时，离心弃沉淀获取一次乙醇上清液。00193往一次乙醇上清液中加入等体积乙醇第二次沉淀812小时，离心弃上清液，沉淀为纯化的GLP1多肽或其类似物的MFH融合蛋白。0020更优选的，所述的乙醇沉淀纯化包括如下步骤0021150006000转/分离心1530MIN收集诱导表达的菌体，用含6M尿素的PBS重悬菌体，搅拌30分钟，重悬液经超声波短暂预处理1分钟，再经高压均质机处理破碎细胞，细胞破碎液经12000转/分离心2030分钟，获取总蛋白上清液。00222往总蛋白上清液中加入等体积乙醇于20沉淀28小时，12000转/分离心2030分钟，弃沉淀获取。

23、一次乙醇上清液。00233往一次乙醇上清液中加入等体积乙醇于20第二次沉淀812小时，12000转/分离心2030分钟，弃上清液，沉淀为纯化的GLP1多肽或其类似物的MFH融合蛋白。0024一种制备GLP1多肽或其类似物的方法为利用甲酸和蛋白酶水解上述GLP1多肽或其类似物的MFH融合蛋白，具体包括如下步骤00251将纯化的GLP1多肽或其类似物的MFH融合蛋白溶解于5060甲酸溶液，4550保温3656小时至水解完全。00262旋蒸浓缩甲酸水解液，调PH值至7580，加入尿素、咪唑和PBS使体系为含6M尿素和5MM咪唑的PH7580的1PBS溶液，离心去沉淀，上清液含带组氨酸标签的多肽PH6。

24、E7PEP。00273上清液用NINTA亲和层析纯化，用含6M尿素的磷酸缓冲液洗涤35次，再用不含尿素的磷酸缓冲液洗涤35次，最后用含150MM咪唑的磷酸缓冲液洗脱。00284往洗脱液中加E7蛋白酶水解38小时，蛋白酶水解液用磷酸缓冲液透析812小时，直接上样NINTA柱去除蛋白酶和组氨酸标签，流出液为多肽盐溶液。所述的E7蛋白酶优选为如SEQIDNO3所示的TEV蛋白酶或该TEV蛋白酶变种S219A、G148L或L33A，E7蛋白酶带组氨酸标签；E7蛋白酶的加入量优选为05MGE7/MG多肽。00295调节多肽盐酸液PH值至35以下，SEPPAKC18反相树酯层析柱用含2醋酸或甲酸的10乙腈。

25、溶液预处理；酸化后的多肽盐溶液上样预处理过的SEPPAKC18反相树酯层析柱，用含2醋酸或甲酸的10乙腈溶液洗涤除盐，洗涤体积为柱体积的35倍；用含50的乙腈溶液洗脱，洗脱体积为柱体积的23倍；洗脱液经过旋蒸浓缩，冻干，得到初纯化的目的多肽。说明书CN104098702A4/10页70030或将纯化的GLP1多肽或其类似物的MFH融合蛋白用TRISHCL溶液稀释溶解后，直接用E7蛋白酶水解制备GLP1多肽或其类似物。0031通过上述方法得到初纯化的GLP1多肽或其类似物纯度在90以上，再利用C18反相层析柱对多肽产品进行精制可以得到纯度为99以上GLP1多肽或其类似物。利用C18反相层析柱对多。

26、肽产品进行精制的方法优选为初纯化的GLP1多肽或其类似物用含2醋酸或甲酸的10乙腈溶液溶解和过滤，C18反相层析柱用含2醋酸或甲酸的10乙腈溶液预处理；肽溶液上样预处理过的C18反相层析柱，用1070线性梯度洗脱，收集目标多肽组分，旋蒸浓缩，冻干。0032GLP1及其类似物能与GLP1受体结合，促进胰岛素的分泌，具有治疗2型糖尿病的功效，不会对病人产生毒副作用。0033通过上述方法，每100克MHFDPH6E7GLP1融合蛋白可制得1013克纯度为99以上的GLP1多肽产品；GLP1多肽可用于制备临床上治疗2型糖尿病多肽药物制剂。0034每100克MHFDPH6E7R34融合蛋白可制得1114。

27、克纯度为99以上的R34多肽产品；R34为临床上治疗2型糖尿病多肽药物制剂利拉鲁肽前体多肽。0035将MHFDPH6E7R34融合蛋白用甲酸水解得到的PH6E7R34可以直接进行脂化修饰，然后用E7蛋白酶水解除去组氨酸标签，经SEPPAKC18反相树酯层析柱初纯化和C18反相层析柱精制后生成利拉鲁肽。每100克MHFDPH6E7R34融合蛋白可制得911克纯度为99以上的利拉鲁肽。动物模型研究表明，本发明提供的利拉鲁肽具有治疗糖尿病的效果。0036本发明创造了一种整合“融合蛋白甲酸水解、专一性蛋白酶水解和亲和层析”多肽释放方法，达到了多肽大规模高效表达、多肽释放工艺步骤少、较低生产成本的目的。。

28、0037与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于00381现有融合蛋白水解需要使用溴化氰，虽然溴化氰专一性强，但具有剧毒，不适合工业化生产管理，本发明有机结合甲酸水解和专一性蛋白酶水解，条件温和，适合工业化生产。00392本发明提供的利用融合蛋白方法制备多肽方法纯化步骤简单。00403本发明提供的工艺方法多肽产品回收率高。00414本发明提供的方法过程中，中间体可以进行化学修饰，不影响蛋白酶水解工艺和产品纯化。附图说明0042图1是用于MFHDPH6E7GLP1融合蛋白表达的质粒PMFHGLP1图谱A和GLP1氨基酸序列B。0043图2是用于MFHDPH6E7R34融合蛋白表达的质粒PMFH。

29、R34质粒图谱A和R34氨基酸序列B。0044图3是DPH6E7GLP1的DNA序列。0045图4是DPH6E7R34的DNA序列。0046图5是重组菌IPTG诱导浓度对融合蛋白MFHDPH6E7GLP1表达的影响。说明书CN104098702A5/10页8M蛋白质分子量标准，1空载体，2无载体细胞；38样品的IPTG浓度依次为02MM、04MM、06MM、08MM、10MM和12MM。0047图6是重组菌IPTG诱导时间对融合蛋白MFHDPH6E7GLP1表达的影响。M蛋白质分子量标准，1空载体，2无载体细胞；39样品的诱导时间依次为1H、2H、3H、4H、5H、6H和8H。0048图7是重。

30、组菌乳糖诱导融合蛋白MFHDPH6E7R34表达。M蛋白质分子量标准，1空载体，2无载体细胞；36发酵8、10、12、16小时的样品。0049图8是SDSPAGE胶分析乙醇沉淀纯化融合蛋白。M蛋白质分子量标准。1第一次乙醇沉淀，2第二次乙醇沉淀，3第二次乙醇沉淀后上清液。0050图9是融合蛋白MFHDPH6GLP1部分甲酸水解分析。0051图10融合蛋白MFHDPH6E7R34甲酸水解时间进程分析。1分子量标准；210为融合蛋白甲酸水解6、12、18、24、30、36、42、50和56小时的样品。0052图11是HPLC纯化GLP1色谱图，箭头之间所指部分为收集样品。0053图12是HPLC纯。

31、化R34色谱图，箭头之间所指部分为收集样品。0054图13是融合蛋白MFHDPH6E7R34经复性后可以经E7蛋白酶水解直接制备R34多肽。从左到右分子量标准，融合蛋白E7酶水解0、30分钟、1小时、2小时、3小时的样品。0055图14是制备利拉鲁肽的工艺过程图。具体实施方式0056以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。0057实施例1融合蛋白MFHDPH6E7GLP1和MFHDPH6E7R34载体构建和表达0058选用大肠杆菌偏爱的密码子设计引物，采用重叠延伸PCR方法，以质粒PCMFHGLP模板HJ。

32、LI，CXZHOUANDJZSU,CHEMICALLIGATIONANDCLEAVAGEONSOLIDSUPPORTFACILITATERECOMBINANTPEPTIDEPURICATION。PROTEINEXPRESSIONANDPURICATION50,238246,2006，分别扩增和构建出编码DPH6E7GLP1和DPH6E7R34融合蛋白的DNA序列，然后，二个GLP1衍生物肽的DNA序列经ECORI和BAMHI双酶切后，插入预先用ECORI和BAMHI双酶切的高效表达载体PMFHMCSHJLI，CXZHOUANDJZSU,PROTEINEXPRESSIONANDPURICATIO。

33、N50,238246,2006中，构建成GLP1和其衍生物肽的原核表达重组质粒PMFHGLP1图1和PMFHR34图2，再把重组质粒分别转入表达菌大肠杆菌BL21DE3中得到表达融合蛋白MFHDPH6E7GLP1和MFHDPH6E7R34的工程菌。0059DPH6E7GLP1的DNA序列如图3及SEQIDNO4所示。用于扩增DPH6E7GLP1的PCR引物为正向引物15GCGGAATTCGACCCGGGCCATCACCATCACCATCACGAAAACCTGTAC3，正向引物25CATCACGAAAACCTGTACTTCCAGCACGCTGAAGGTACCTTC3；反向引物为通用引物PTRC反。

34、向引物GE公司。PCR反应体系10PCR缓冲液5L，质粒模板50PG，正向引物110M，正向引物210M，反向引物20M，DNTP混合物025MM/种，PFUDNA聚合酶15单位，反应体积50L。PCR反应条件为1955分钟，1个循环；29530秒，5530秒，7230秒，30个循环；说明书CN104098702A6/10页937210分钟，1个循环。0060DPH6E7R34的DNA序列如图4及SEQIDNO5所示。用于扩增DPH6E7R34的PCR引物为正向引物15GCGGAATTCGACCCGGGCCATCACCATCACCATCACGAAAACCTGTAC3，正向引物25CATCACG。

35、AAAACCTGTACTTCCAGCACGCTGAAGGTACCTTC3；反向引物为5CGCGGATCCTTAGCCACGACCACGAACCAGCCAAGCGATAAA3。PCR反应体系10PCR缓冲液5L，质粒模板50PG，正向引物110M，正向引物210M，反向引物20M，DNTP混合物025MM/种，PFUDNA聚合酶15单位，反应体积50L。PCR反应条件为1955分钟，1个循环；29530秒，5530秒，7230秒，30个循环；37210分钟，1个循环。0061采用化转法进行质粒转化。首先取1微升质粒加入到50微升DH5感受态细胞中，将混合物置于冰上30分钟。30分钟后将混合物取出。

36、，在42水浴90秒，中途勿摇动试管。水浴后将混合物放置在冰上12分钟，取2个EP管37水浴预热SOC培养基，将800微升SOC加入到这2个EP管中，然后转置摇床在37下以200RPM转速摇45分钟。45分钟后涂布平板，标记后放到37的培养箱中保存。0062将表达融合蛋白MFHDPH6E7GLP1、MFHDPH6E7R34的工程菌进行活化，依次制备一级种子和二级种子；将二级种子接种于发酵培养基中，37培养到OD600值达到0910时，添加诱导剂IPTG，终浓度为063MM，继续发酵1012小时。一级种子和二级种子培养基和发酵培养基均为LB培养基，其组成如下酵母浸出膏5G/L、蛋白胨10G/L、氯。

37、化钠10G/L，用去离子水配制，氨苄青霉素100G/ML，初始PH75。0063融合蛋白MFHDPH6E7GLP1、MFHDPH6E7R34在BL21中经IPTG诱导，大量表达于包涵体中。通过实验确定37，08MMIPTG诱导表达6小时为工程菌的最佳发酵条件，在此条件下诱导表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的3545图56。0064实施例2利用乳糖诱导工程菌生产融合蛋白的发酵方法0065本发明还确定利用乳糖作为诱导剂诱导融合蛋白的表达。因为乳糖自身不能诱导LAC启动子的启动，它需要经过半乳糖苷酶的作用转化为异乳糖后才起诱导剂的作用。本发明通过种子培养和设计发酵培养基的条件，使得工程菌能表达出目的融合。

38、蛋白。具体步骤如下00661将表达融合蛋白MFHDPH6E7GLP1、MFHDPH6E7R34的BL21从平板上挑取单菌落至5毫升含氨苄LB培养基，200转/分、37，摇瓶培养1216小时。LB培养基的组成如下酵母浸膏5G/L、酪蛋白水解物10G/L、氯化钠10G/L，初始PH6580。00672培养后取1毫升菌液，加到50毫升含氨苄LB培养基中，200转/分、37，摇瓶培养68小时。00683将培养后的50ML含氨苄LB培养基添加到50升含氨苄新鲜发酵培养基中，37，200转/分摇瓶培养。00694当OD600达到10左右时，添加40毫升诱导前补液到发酵培养基。诱导前补液组成为葡萄糖300G。

39、/L、硫酸镁12G/L、氯化铵45G/L，用去离子水配制。0070发酵培养基组成葡萄糖5G/L、酵母浸膏15G/L、酪蛋白水解物20G/L、氯化钠5G/L、硫酸铵1G/L、磷酸氢二钾5G/L、磷酸二氢钾2G/L、柠檬酸1G/L、硫酸镁05G/L，微量元素溶液1ML/L，用去离子水配制，氨苄青霉素100G/ML，初始PH6580。说明书CN104098702A7/10页100071微量元素溶液的组成硫酸亚铁32G/L、氯化亚锰1G/L、硝酸钴15G/L、氯化钙1G/L、氯化铜00505G/L、硫酸锌04G/L、硼酸03G/L和钼酸钠0842G/L溶于1MOL/L盐酸中，微量元素溶液过滤除菌。00。

40、7251小时后，将40毫升乳糖诱导液全部倒入发酵培养基，加完后立刻将40毫升乳糖后补料液全部倒入发酵培养基。所述的乳糖诱导液的组成为乳糖180G/L、酵母浸膏180G/L、硫酸镁7G/L，用去离子水配制。诱导后补料液的组成为甘油300G/L、乳糖75G/L、硫酸镁7G/L，用去离子水配制。00738继续发酵培养816小时。最后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过观察条带强度来确定目的蛋白的含量图7。如图7所示，在此条件下诱导表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的35以上。0074实施例3融合蛋白乙醇沉淀纯化0075本发明确认利用乙醇沉淀法可以有效地纯化融合蛋白。将上述通过乳糖诱导融合蛋白表达的菌体500。

41、06000转/分离心1530MIN收集，室温下利用PBS含6M尿素重悬菌体，搅拌30分钟，重悬液经超声波短暂预处理1分钟，再经高压均质机处理破碎细胞，细胞破碎液经12000转/分离心2030分钟，获取总蛋白上清液，上清液经乙醇沉淀28小时11体积比；20，12000转/分高速离心去沉淀20，二次上清液再经乙醇沉淀812小时11体积比；20。12000转/分离心收集沉淀，二次离心沉淀既为融合蛋白，纯度在85以上，产率为300克菌体制得100克融合蛋白沉淀图8。0076实施例4TEV蛋白酶变种和特性0077本发明提供通过改良TEVPROTEASETEV蛋白酶活性中心及周围氨基酸变化，以拓扩该蛋白酶。

42、对底物识别序列，尤其是扩展蛋白酶对底物P1和P2位点识别能力和酶切效率。0078TEVPROTEASETEV蛋白酶是来源于烟草蚀纹病毒TEV的NLA蛋白酶27KDA的蛋白酶活性结构域，其氨基酸序列如SEQIDNO3所示，经过设计后的蛋白酶与天然TEV蛋白酶相比其稳定性更好，可用大肠杆菌以MBP融合蛋白进行表达KAPUST,RBANDWAUGH,DS1999，ESCHERICHIACOLIMALTOSEBINDINGPROTEINISUNCOMMONLYEFFECTIVEATPROMOTINGTHESOLUBILITYOFPOLYPEPTIDESTOWHICHITISFUSEDPROTEINSC。

43、I816681674，表达过程中，TEV蛋白酶可以自我专一性剪切，除去MBP融合载体。此蛋白酶被用来切除纯化后融合蛋白的亲和标签。TEV蛋白酶具有很强的位点特异性，能够识别EXXYXQG/S七氨基酸序列，最常用序列的是GLUASNLEUTYRPHEGLNGLY或ENLYFQG，其切割位点在谷氨酰胺和甘氨酸或丝氨酸之间即P1和P1之间。在PH70、30时可达到最佳活性，但在PH5585和430的广泛范围内TEV蛋白酶皆有活性，因此，可根据目的蛋白的性质选择反应条件。由于重组TEV蛋白酶自身带有组氨酸标签，切割后也很容易利用其N端的亲和标签将TEV蛋白酶清除，也可以从固定在树脂上的融合蛋白切除掉目。

44、的蛋白。0079本发明通过随机PCR方法，改变TEV蛋白酶WT，氨基酸序列如SEQIDNO3所示活性中心周围氨基酸性质，通过筛选，获取对底物P1氨基酸序列识别广谱的蛋白酶变种。如表2所示，G147L和L32A蛋白酶变种对P1的识别氨基酸显著拓宽，除脯氨酸P外，对其他氨基酸的效率都在85以上。说明书CN104098702A108/10页110080本发明制备GLP1和R34多肽所用的E7蛋白酶为表1中任一种TEV蛋白酶。本发明筛选的E7蛋白酶可用于其他重组多肽和蛋白的制备。0081表1几种蛋白酶变种对P1氨基酸的识别能力和酶切效率以P1为对照0082P1GSAMCNHYKDQFTWRLEIVPW。

45、T100100100908584807572706868656260585856450S219A100100100918591908985868786876260586056550G148L100100100999796959293919695988991908788860L33A1001001009997959693959293949688878885888500083注WT为TEVPROTEASE；S219A为WT的第219个氨基酸由丝氨酸S突变为丙氨酸A；G148L为WT的第148个氨基酸由甘氨酸G突变为亮氨酸L；L33A为WT的第33个氨基酸由亮氨酸L突变为丙氨酸A。0084实施例5G。

46、LP1和GLP1变种R34制备0085将实施例3乙醇沉淀纯化的融合蛋白MFHDPH6E7GLP1溶入终浓度为5070V/V的甲酸50克融合蛋白溶入250毫升浓度为60甲酸中，在4550水浴避光水解24小时，水解完成后用旋转蒸发仪抽去绝大部分甲酸，取少量部分水解后的蛋白混合物跑TRICINESDSPAGE电泳，如图9所示，融合蛋白MFHDPH6E7GLP1有较高的水解效率，24小时内水解效率可达75。45水浴避光水解继续水解到48小时，水解效率达98图10，经质谱检查验证水解完全。甲酸水解液经过旋蒸浓缩至80毫升，先用固体NAOH调节溶液PH值至6065，再用NAOH溶液调节溶液PH值至7580。

47、之间，添加尿素使其在200毫升的体系中的终浓度为6M，再添加20毫升10PBS缓冲液既磷酸缓冲液，PH80母液，再添加05毫升2M咪唑母液，加水至终体积到200毫升，检查PH值在7085范围，离心去除沉淀。上清液主要成分为PH6E7GLP1多肽。0086上清液直接用于NINTA亲和层析纯化。上清液上样到NINTA亲和层析柱，用含6M尿素的磷酸缓冲液PH80洗涤35次，用SDSPAGE方法检测不含杂质。然后用不含尿素的磷酸缓冲液PH80洗涤35次除去尿素。最后用含150MM咪唑的磷酸缓冲液PH80洗脱，洗脱体积为柱体积的45倍。0087洗脱液直接用E7蛋白酶水解。在洗脱液中加入E7蛋白酶L33A。

48、，加入量为05MGE7/MG多肽。室温放置8小时，随后蛋白酶水解液利用磷酸缓冲液透析12小时，直接上样NINTA柱去除蛋白酶和组氨酸标签，流出液为多肽盐溶液，主要成分为GLP1多肽。0088多肽盐溶液利用SEPPAKC18反相树酯层析柱除去盐类杂质，同时对GLP1多肽样品进行初步纯化。利用醋酸、甲酸或盐酸调节多肽盐溶液PH值至35以下，SEPPAKC18反相树酯层析柱预先用10的乙腈溶液含2醋酸或甲酸预处理。酸化后的多肽盐溶液上样预处理过的SEPPAKC18反相树酯层析柱，用10的乙腈溶液含2醋酸或甲酸洗涤除盐，洗涤体积为柱体积的35倍。用含50的乙腈溶液洗脱，洗脱体积为柱体积的23倍。含GL。

49、P1样品洗脱液经过旋蒸浓缩，冻干，经质谱仪分析检测纯度为90以上。说明书CN104098702A119/10页120089初步纯化的GLP1多肽样品可以用HPLC进一步纯化。初步纯化的多肽样品用10的乙腈溶液含2醋酸或甲酸溶解和过滤。C18反相层析柱用10的乙腈溶液含2醋酸或甲酸预处理。多肽样品溶液上样预处理过的C18反相层析柱，用1070乙腈线性梯度洗脱60分钟，收集主峰图11，即目标多肽GLP1组分，旋蒸浓缩，冻干，经质谱仪分析检测纯度为99以上。0090每100克MHFDPH6E7GLP1融合蛋白经上述纯化工艺可制得1013克纯度为99以上的多肽产品。0091上述工艺过程也同样适用于GLP1多肽变种K34R定义为R34的生产。R34为临床上治疗2型糖尿病多肽药物制剂利拉鲁肽前体多肽，为GLP1的第34位赖氨酸置换成精氨酸。经本发明所述纯化工艺，每100克MHFDPH6E7R34。