基于肠上皮细胞对35NM的纳米银生物安全性的评价方法.pdf

本发明基于肠上皮细胞对35nm的纳米银生物安全性的评价方法选取人结肠癌上皮细胞Caco-2细胞株作为研究对象，采用细胞毒性较强的纳米氧化锌（26.21nm）为阳性对照，不加入纳米材料的正常细胞为空白对照，通过AO/EB双染法、WST-1法初步探究究纳米材料的细胞毒性。使用氧化应激的方法，通过检测Caco-2细胞内ROS、SOD、GSH释放量的影响，来探讨纳米银对细胞的氧化损伤作用及可能机制。实验结果表明，35.48nm的银粒子在低剂量（<50µg/ml）时对肠上皮细胞的活性没有影响，不会造成氧化应激损伤；在染毒剂量为75µg/ml和100µg/ml对肠上皮细胞（Caco-2）的毒性存在剂量-效应和时间-效应，并对细胞造成了程度较弱的氧化应激损伤。

1.  一种基于肠上皮细胞对35.48nm的纳米银生物安全性的评价方法，其特征在于包括如下步骤：
1）细胞培养：将人结肠癌上皮细胞Caco-2细胞株加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在培养箱内培养，细胞生长2~3 d换1次液，取对数生长期细胞进行后续实验；
2）细胞传代：Caco-2细胞贴壁生长，经过3~4 d，细胞生长至单层80%~95%时，弃掉上清液，用适量PBS轻轻冲洗，弃掉废液，加入0.25%胰蛋白酶进行消化3-5 min，在倒置显微镜下观察到细胞刚刚变圆时，加入少量10%胎牛血清的DMEM培养基终止细胞消化过程，用吸管吸取培养基，轻轻吹打使细胞不再贴壁，将细胞悬液转移到新的培养瓶中，并加入适量培养基，放入培养箱中培养3-4 d后，进行下一次传代培养；
3）将纳米银和纳米氧化锌粉末分散在无血清的DMEM培养基中，制成不同浓度的纳米银、纳米氧化锌悬液，放入4 ℃冰箱中备用，因为这两种纳米材料易发生团聚，使得该分散体系不稳定，因此每次使用前，需使用超声波细胞破碎仪使纳米材料解聚；
4）通过AO/EB双染法、WST-1法进行细胞毒性分析，使用氧化应激法，通过Caco-2细胞内ROS、SOD、GSH水平检测，来分析纳米银对细胞的氧化损伤作用及可能机制。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4）中所述AO/EB双染法包括如下步骤：将Caco-2细胞种在6孔细胞培养板中，培养1-2天，每孔中细胞长满80%以后，分别与10 μg/ml、25 μg/ml、 50 μg/ml、 75 μg/ml和100 μg /ml的纳米银和纳米氧化锌接触培养24 h, 纳米材料浓度为0的孔为阳性对照组，加入含有吖啶橙和溴化乙锭的 PBS，染色3分钟，染色结束后用加入适量PBS洗脱1-2次，用荧光倒置显微镜检测染色结果，并拍照保存。

3.  如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4）中所述WST-1法包括如下步骤：选择对数期的细胞传代，将细胞培养在96孔细胞培养板中，每孔加入200 μl相同的细胞悬液，使用96孔板时弃用周围一圈，在外围一圈加无菌水或PBS, 并将96孔板置于靠近水源的地方，以减小水分蒸发造成的误差，细胞培养1-2天，当细胞量达到大约10000个/孔时，分别加入10 μg/ml、25 μg/ml、 50 μg/ml、 75 μg/ml和100 μg /ml的纳米银和纳米氧化锌，纳米材料浓度为0的孔为阳性对照组，每个样品有4个重复孔，与细胞接触培养12 h，24 h，36 h后，分别用WST-1试剂盒进行细胞增值测定，按试剂盒说明书配制WST-1溶液，每孔加入20 μlWST-1溶液，使用加了相应量细胞培养液和WST-1溶液，但没有加入细胞的孔作为空白对照，在细胞培养箱中孵育2 h后取出，把96孔板置于摇床上摇动1分钟，使其颜色均匀，注意不能起泡，否则会影响准确度，在450nm波长处测定吸光度，根据吸光值计算细胞活性，通过spss数据分析软件计算差异显著性，细胞存活率的计算公式如下： 
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4.    如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4）中细胞内ROS水平检测方法包括如下步骤：选择对数期的细胞进行传代培养，将所得的细胞悬液加在96孔板中，每孔加入200 μl相同的细胞悬液，使用96孔板时弃用周围一圈，在外围一圈加无菌水或PBS, 并将96孔板置于靠近水源的地方，以减小水分蒸发造成的误差，细胞培养1-2天，当细胞量达到大约10000个/孔时，分别加入10 μg/ml、25 μg/ml、 50 μg/ml、 75 μg/ml和100 μg /ml的纳米银和纳米氧化锌,另设置两组阴性对照组，第一组阴性对照组在细胞培养孔中只加入细胞培养基，第二组阴性对照组在空白孔中只加入细胞培养基，每个样品有4个重复孔，与细胞接触培养24 h后，用ROS试剂盒检测活性氧水平，按照1:1000用无血清培养基培养液稀释DCFH-DA,使终浓度为10μmol/ml, 取出96孔板中细胞培养液，加入100 μl稀释好的DCFH-DA，使其盖住细胞，在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照，其余孔不加入Rosup，在37℃细胞培养箱内孵育20分钟，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分除去未进入细胞DCFH-DA，使用485nm的激发波长和525nm的发射波长，在酶标仪中检测荧光的强弱。

5.  如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4）中细胞内SOD和GSH水平检测方法包括如下步骤：
选取对数期生长状态良好的细胞进行传代，将相同浓度的细胞悬液加入25 cm² 的细胞培养瓶中，培养2-3天，细胞长满培养瓶细胞生长面的80%后，小心吸出细胞培养液，分别加入5ml的0，10, 25, 50, 75, 100μg/ml的纳米银和纳米氧化锌，其中0μg/ml为阳性对照组，接触培养24h后, 取出细胞，制成细胞悬液，加入PBS混匀后，在4°C 条件下4000 rpm离心4分钟，弃掉90%的上清液，再次加入PBS制成细胞悬液，重复离心步骤，弃掉大部分上清液，保留2ml上清液和细胞沉淀，在超声波细胞粉碎仪中进行超声，获得的悬液用于氧化应激法的进一步检测；
采用考马斯亮兰法测定蛋白含量，按试剂盒说明书具体步骤进行操作，测定595nm的吸光度，按以下公式计算蛋白含量：

采用超氧化物歧化酶测定试剂盒检测，按试剂盒说明书具体步骤进行操作，测定450nm的OD值，按以下公式计算SOD活性：
                         
采用谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒检测，按试剂盒说明书具体步骤进行操作，测定405nm的OD值，按以下公式计算GSH含量：  
                                                                              
使用SPSS 16.0软件对实验结果进行统计分析，对数据进行单因素方差分析，计算p < 0.05和p < 0.01的差异显著性。

6.      如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1）和步骤2）中培养箱内的培养条件为37 ℃、5% CO₂。

7.       如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3）中的超声条件为3 min，超3 s停2 s，功率300 w。

8.  如权利要求2所述的方法，其特征在于加入 300 μL含有100 μg /ml吖啶橙和 100 μg /ml溴化乙锭的 PBS。

9.  如权利要求5所述的方法，其特征在于在超声波细胞粉碎仪中进行超声2分05秒，超声条件为300w、超5s停10s。

基于肠上皮细胞对35nm的纳米银生物安全性的评价方法
技术领域
本发明属于食品安全领域，具体是一种基于肠上皮细胞对35.48nm的纳米银生物安全性的评价方法。    
背景技术
纳米银的抗菌性比常规银更强，微量纳米银可以产生很强的杀菌效应。纳米银凭借优异的抗菌性，在食品产业的应用越来越广泛，成为近年来研究的热点之一。但是，应用于食品领域的纳米银粒子能发生迁移，通过消化道侵入人体，并可能在深部蓄积。因此，纳米银的食品安全问题值得引起关注。
近年来，商品化纳米材料主要集中在银、碳、氧化锌、硅、二氧化钛和金等材料上，其中大部分纳米商品涉及金属银，占所有纳米材料制品的50%以上，呈现出逐年递增的趋势。
纳米技术使银的杀菌能力产生了质的飞跃，纳米银在很短的时间内，可以杀死650多种细菌，并且对细菌、霉菌及有害孢子的生长也会起到有效的抑制作用。Choi等研究了纳米银、银离子、氯化银胶体三种含银产品的抗菌性强度，得到了纳米银抗菌性最强的研究结果。
近年来，科研工作者，对纳米银的抗菌原理进行了系统的探究，通过研究纳米银在形态、结构、生理变化方面对微生物的影响，初步了解其抗菌规律，进一步从蛋白质和转录水平上研究其抗菌性，最终得到了纳米银抗菌的毒性机制。当纳米银与细菌接触时，会依附在细胞膜表面，通过与细胞外膜上蛋白、多糖等屏障物质的作用，破坏细胞膜的结构和功能，使细胞膜的电势和渗透性发丝变化，纳米银进入细胞后，造成了ATP大量水解。另外，纳米银在遇到含水的环境时，可以释放银离子进入细胞内，诱导其产生活性氧自由基，最终导致细胞氧化应激和细胞膜损伤，引发细胞凋亡和坏死。
食品及食品相关产品通过纳米添加剂来提高产品的加工性能、稳定性和功效性。纳米材料可以用于食品添加剂、食品包装等食品相关产品抗菌性能的优化。根据2011年伍德罗·威尔逊对纳米技术消费产品的统计，在消费类产品中银纳米粒子是最常用的纳米级别添加剂。
银离子抗菌剂不仅抗菌性好、不易产生抗药性，而且安全性高。银离子具有高反映活性，容易与一系列带负电荷的分子结合，包括无机阴离子、DNA分子、RNA分子和蛋白质。Shahverdi A R等的研究表明，纳米银在浓度低于2μg/ml时也能表现出抗菌性，并且，其对真菌和病毒也有杀伤力。 Sun R W Y等发现纳米银能够有效抑制细胞内病毒复制，减少与HIV相关的细胞凋亡。
目前，食品用纳米银已成为国内外研究的热点。纳米包装材料与传统的聚乙烯包装材料相比，具有较高的机械性能 优良的理化性能 加工性能以及较好的生态安全性。添加纳米银的包装材料在延长食品货架期上具有潜在应用。何强等发现，在保鲜包装材料中的纳米银能减少乙烯含量，提高保鲜效果。杨燕婷等发现，纳米材料能显著保持金针菇在贮藏过程中的感官品质和营养成分，可维持较低的膜透性和氧化程度，延缓金针菇的劣变。苏晶等利用新型纳米材料包装对柿果货架品质进行了研究，结果表明纳米材料能有效起到果蔬保鲜作用。Fernandez A 等研究了新开发的纤维素－银( cellulose － silver) 纳米粒混合材料在Piel de Sapo加工贮藏期间的抗菌活性，发现纤维素－银纳米复合材料被瓜汁浸渍时，释放出的银离子对于控制腐败微生物作用明显，微生物的滞后期被延长。此外，银的存在可延迟有切口瓜的衰老。
纳米材料可用于饮用水消毒，有研究报道，研制出了可以用于饮用水消毒的载银活性碳纤维。今年来，含纳米银的抗菌塑料逐渐受到人们的青睐，已经生产出含纳米银的食品保鲜膜（袋）、盆、罐、菜板、餐具等抗菌塑料制品。
认识和了解纳米材料的毒理学效应，不仅有助于纳米材料的广泛应用，改善人们的生活品质，而且对维持人类身体健康也非常重要。纳米材料在体内可能会导致难以预测的生物学反应。纳米材料与许多催化和氧化反应有关，并且可能诱导更强的细胞的毒性。
目前，随着纳米银的商业化和工业化生产，其在食品上（例如：抗菌包装材料）的应用越来越广泛，容易通过摄取、皮肤接触、呼吸吸入等途径进入人体，因此其对食品安全的潜在威胁开始逐渐引起人们的重视。我国香港食物环境卫生署食物安全中心报告指出，人体食入的纳米材料，经过肠道进入毛细血管，然后传送到肝脏或者进入淋巴系统。较小粒径的纳米粒子可以在体内的组织和器官积聚，甚至可以被个别细胞吸收。传统的ISO10993标准所规定生物安全性评价方法，主要对试验动物急性经口毒性、皮肤刺激、眼刺激、遗传毒性、皮肤过敏等进行常规毒理学检查。一些研究结果表明纳米银对生物体没有毒性。目前，纳米银毒性研究方法主要有动物实验和细胞试验。
纳米银可通过呼吸道、皮肤、消化道以及其它途径进入人体，具有潜在的毒性效应。经口摄入的银，经过肝脏的首过效应，被排泄到胆汁中，从而降低了纳米银在生物体组织中的系统分布。未被清除的银会沉积在肾小球基膜和肾小球膜以及肝脏的肝窦内皮细胞和Kupffer细胞中。Tang等对小鼠进行纳米银皮下注射，结果显示，纳米银可以以粒子的形式进入血液循环，进而分布在主要的器官中，如肾、脑、肝、脾、和肺中。在食品领域应用的小粒径纳米银，可通过消化道，进入血液和肝脏等器官，并在其他组织和器官内蓄积，当达到一定量后，会对人体产生肾毒性、神经毒、性肝毒性等毒性反应。
目前有关纳米银对细胞结构和功能的影响，以及纳米银与细胞相互作用的研究很少，可用于研究的细胞株体系主要有肺泡巨噬细胞、成纤维细胞、上皮细胞、血管平滑肌细胞、肾细胞、肝细胞、角化细胞以及人类癌细胞等。细胞是大多数生物体的基本单位，其变化大体上可反映生物机体功能与结构的变化，而当机体功能与结构未发生变化时，细胞功能与结构也可能发生改变。细胞毒理学主要是通过体外细胞技术手段研究环境中生物、化学和物理等多种污染物对细胞的损伤效应与规律，从而获得该物质的细胞毒效应、与剂量有关的暴露特征（如暴露时间、暴露途径、暴露频率）、毒作用机理等诸多信息。以细胞为研究对象进行纳米颗粒生物效应研究，主要是应用体外培养的细胞株对纳米颗粒进行毒效应监测，评价纳米颗粒对人体可能产生的危害。
纳米银作为食品用抗菌材料，应用前景广泛。但目前纳米银的安全性问题仍存在争议。目前纳米银的毒理学研究多为医药领域，研究对象为医用纳米银，研究方法多为动物实验和体外细胞培养，针对食品用纳米银安全性评价的研究很少。因此，针对为了解决纳米银在食品中应用所存在潜在安全性问题，迫切需要深入研究食品用纳米银的安全性。
纳米材料安全性研究可以采用体内和体外两种实验方法，两者各有利弊，虽然体外细胞实验模型不能模拟银在复杂动物体内所产生的效应，但是体外实验可以方便快捷地评价化学试剂的毒性，不受临床实验个体差异的限制，可以为进一步深入研究化学暴露的潜在危险打下基础。
随着纳米技术的发展，纳米材料的生产工艺越来越发达，进一步研究不同形状、大小纳米银的细胞毒性变化规律，结合物理化学方法，探究无毒或低毒性纳米银的生产方法。进一步建立和完善食品用纳米材料的体外安全性评价方法，探索高校准确的毒理学筛选方法。通过系统科学完善的纳米材料毒理学数据，使人们对纳米材料的安全性有一个全面清晰的认识，为纳米材料的广泛应用和纳米科学的进一步发展提供条件。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于肠上皮细胞对35.48nm的纳米银生物安全性的评价方法。
一种基于肠上皮细胞对35.48nm的纳米银生物安全性的评价方法，其特征在于包括如下步骤：
1）细胞培养：将人结肠癌上皮细胞Caco-2细胞株加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在培养箱内培养，细胞生长2~3 d换1次液，取对数生长期细胞进行后续实验；
2）细胞传代：Caco-2细胞贴壁生长，经过3~4 d，细胞生长至单层80%~95%时，弃掉上清液，用适量PBS轻轻冲洗，弃掉废液，加入0.25%胰蛋白酶进行消化3-5 min，在倒置显微镜下观察到细胞刚刚变圆时，加入少量10%胎牛血清的DMEM培养基终止细胞消化过程，用吸管吸取培养基，轻轻吹打使细胞不再贴壁，将细胞悬液转移到新的培养瓶中，并加入适量培养基，放入培养箱中培养3-4 d后，进行下一次传代培养；
3）将纳米银和纳米氧化锌粉末分散在无血清的DMEM培养基中，制成不同浓度的纳米银、纳米氧化锌悬液，放入4 ℃冰箱中备用，因为这两种纳米材料易发生团聚，使得该分散体系不稳定，因此每次使用前，需使用超声波细胞破碎仪使纳米材料解聚；
4）通过AO/EB双染法、WST-1法进行细胞毒性分析，使用氧化应激法，通过Caco-2细胞内ROS、SOD、GSH水平检测，来分析纳米银对细胞的氧化损伤作用及可能机制。
所述的方法，其特征在于步骤4）中所述AO/EB双染法包括如下步骤：将Caco-2细胞种在6孔细胞培养板中，培养1-2天，每孔中细胞长满80%以后，分别与10 μg/ml、25 μg/ml、 50 μg/ml、 75 μg/ml和100 μg /ml的纳米银和纳米氧化锌接触培养24 h, 纳米材料浓度为0的孔为阳性对照组，加入含有吖啶橙和溴化乙锭的 PBS，染色3分钟，染色结束后用加入适量PBS洗脱1-2次，用荧光倒置显微镜检测染色结果，并拍照保存。
所述的方法，其特征在于步骤4）中所述WST-1法包括如下步骤：选择对数期的细胞传代，将细胞培养在96孔细胞培养板中，每孔加入200 μl相同的细胞悬液，使用96孔板时弃用周围一圈，在外围一圈加无菌水或PBS, 并将96孔板置于靠近水源的地方，以减小水分蒸发造成的误差，细胞培养1-2天，当细胞量达到大约10000个/孔时，分别加入10 μg/ml、25 μg/ml、 50 μg/ml、 75 μg/ml和100 μg /ml的纳米银和纳米氧化锌，纳米材料浓度为0的孔为阳性对照组，每个样品有4个重复孔，与细胞接触培养12 h，24 h，36 h后，分别用WST-1试剂盒进行细胞增值测定，按试剂盒说明书配制WST-1溶液，每孔加入20 μlWST-1溶液，使用加了相应量细胞培养液和WST-1溶液，但没有加入细胞的孔作为空白对照，在细胞培养箱中孵育2 h后取出，把96孔板置于摇床上摇动1分钟，使其颜色均匀，注意不能起泡，否则会影响准确度，在450nm波长处测定吸光度，根据吸光值计算细胞活性，通过spss数据分析软件计算差异显著性，细胞存活率的计算公式如下： 
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    所述的方法，其特征在于步骤4）中细胞内ROS水平检测方法包括如下步骤：选择对数期的细胞进行传代培养，将所得的细胞悬液加在96孔板中，每孔加入200 μl相同的细胞悬液，使用96孔板时弃用周围一圈，在外围一圈加无菌水或PBS, 并将96孔板置于靠近水源的地方，以减小水分蒸发造成的误差，细胞培养1-2天，当细胞量达到大约10000个/孔时，分别加入10 μg/ml、25 μg/ml、 50 μg/ml、 75 μg/ml和100 μg /ml的纳米银和纳米氧化锌,另设置两组阴性对照组，第一组阴性对照组在细胞培养孔中只加入细胞培养基，第二组阴性对照组在空白孔中只加入细胞培养基，每个样品有4个重复孔，与细胞接触培养24 h后，用ROS试剂盒检测活性氧水平，按照1:1000用无血清培养基培养液稀释DCFH-DA,使终浓度为10μmol/ml, 取出96孔板中细胞培养液，加入100 μl稀释好的DCFH-DA，使其盖住细胞，在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照，其余孔不加入Rosup，在37℃细胞培养箱内孵育20分钟，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分除去未进入细胞DCFH-DA，使用485nm的激发波长和525nm的发射波长，在酶标仪中检测荧光的强弱。
所述的方法，其特征在于步骤4）中细胞内SOD和GSH水平检测方法包括如下步骤：
选取对数期生长状态良好的细胞进行传代，将相同浓度的细胞悬液加入25 cm² 的细胞培养瓶中，培养2-3天，细胞长满培养瓶细胞生长面的80%后，小心吸出细胞培养液，分别加入5ml的0，10, 25, 50, 75, 100μg/ml的纳米银和纳米氧化锌，其中0μg/ml为阳性对照组，接触培养24h后, 取出细胞，制成细胞悬液，加入PBS混匀后，在4°C 条件下4000 rpm离心4分钟，弃掉90%的上清液，再次加入PBS制成细胞悬液，重复离心步骤，弃掉大部分上清液，保留2ml上清液和细胞沉淀，在超声波细胞粉碎仪中进行超声，获得的悬液用于氧化应激法的进一步检测；
采用考马斯亮兰法测定蛋白含量，按试剂盒说明书具体步骤进行操作，测定595nm的吸光度，按以下公式计算蛋白含量：

采用超氧化物歧化酶测定试剂盒检测，按试剂盒说明书具体步骤进行操作，测定450nm的OD值，按以下公式计算SOD活性：
                           
采用谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒检测，按试剂盒说明书具体步骤进行操作，测定405nm的OD值，按以下公式计算GSH含量：  
                                                                              
使用SPSS 16.0软件对实验结果进行统计分析，对数据进行单因素方差分析，计算p < 0.05和p < 0.01的差异显著性。
    所述的方法，其特征在于步骤1）和步骤2）中培养箱内的培养条件为37 ℃、5% CO₂。
     所述的方法，其特征在于步骤3）中的超声条件为3 min，超3 s停2 s，功率300 w。
所述的方法，其特征在于加入 300 μL含有100 μg /ml吖啶橙和 100 μg /ml溴化乙锭的 PBS。
所述的方法，其特征在于在超声波细胞粉碎仪中进行超声2分05秒，超声条件为300w、超5s停10s。
本发明的一种基于肠上皮细胞对35.48nm的纳米银生物安全性的评价方法，对于探讨纳米银的肠道毒性具有一定的理论意义，并为食品用纳米银限量标准的制定提供参考，为进一步研究食品用纳米银的安全问题提供可靠的科学依据，为其它纳米材料的安全性评价提供参考。为纳米银的安全使用提供理论支撑。
附图说明
图1是纳米银（35.48nm）的形态图；
图2是纳米银（35.48nm）的粒径分布图；
图3是纳米氧化锌的形态图；
图4是纳米氧化锌的粒径分布图；
图5是Caco-2细胞与100μg /ml的纳米氧化锌接触培养24h后的形态图；
图6是Caco-2细胞与75 μg /ml的纳米氧化锌接触培养24h后的形态图；
图7是Caco-2细胞与50 μg /ml的纳米氧化锌接触培养24h后的形态图；
图8是Caco-2细胞与25 μg /ml的纳米氧化锌接触培养24h后的形态图；
图9是Caco-2细胞与100μg /ml的纳米银接触培养24h后的形态图；
图10是Caco-2细胞与50μg /ml的纳米银接触培养24h后的形态图；
图11是Caco-2细胞与25μg /ml的纳米银接触培养24h后的形态图；
图12是正常细胞形态图；
图13是纳米银与纳米氧化锌和Caco-2细胞接触培养12 h后细胞活性的变化情况图；
图14是纳米银与纳米氧化锌和Caco-2细胞接触培养24h后细胞活性的变化情况图；
图15是纳米银与纳米氧化锌和Caco-2细胞接触培养36h后细胞活性的变化情况图；
图16是纳米银与纳米氧化锌和Caco-2细胞接触培养24h后，细胞内ROS含量变化情况图；
图17是纳米银与纳米氧化锌和Caco-2细胞接触培养24h后，细胞内SOD含量变化情况图；
图18是纳米银与纳米氧化锌和Caco-2细胞接触培养24h后，细胞内GSH含量变化情况图。
具体实施方式
实验材料
人结肠癌上皮细胞（Caco-2）        中国科学院上海细胞生物研究所
纳米银（35.48 nm）粒子            秦皇岛太极环
纳米氧化锌                        秦皇岛太极环
DMEM培养基                      美国Hyclone公司
WST-1细胞增殖及毒性检验试剂盒     Beyotime（碧云天）
考马斯亮兰蛋白试剂盒               Beyotime（碧云天）
活性氧检测试剂盒（ROS）            Beyotime（碧云天）
磷酸盐缓冲液(PBS)                   美国Gibco公司
胎牛血清(FBS)                       杭州四季青
0.25％胰酶(Typsin)                    美国Hyclone公司
超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒           南京建成生物工程研究所
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)试剂盒       南京建成生物工程研究所
主要仪器
超声波清洗仪                   宁波市鄞州弗兰克超声机械设备厂
高速冷冻离心机                 美国热电公司
真空干燥箱                     上海美谱达仪器有限公司
超纯水系统                      Millipore公司
恒温数显水浴锅                  上海申源科学仪器有限公司
透射电镜                        日本JEOL公司
二氧化碳恒温培养箱              美国Thermo公司
酶标仪                          瑞士Tecan公司
倒置荧光显微镜                  德国Leica公司 
超声波细胞破碎仪                德国Microson公司
真空干燥箱超净工作台            苏州净化
Nano-S90纳米粒度分析            英国Malvan公司
实验方法
细胞培养及纳米材料预处理
细胞培养：将人结肠癌上皮细胞Caco-2细胞株加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在培养箱内培养（37 ℃、5% CO₂）。细胞生长2~3 d换1次液，取对数生长期细胞进行后续实验。
细胞传代：Caco-2细胞贴壁生长，经过3~4 d，细胞生长至单层80%~95%时，弃掉上清液，用适量PBS轻轻冲洗，弃掉废液，加入0.25%胰蛋白酶进行消化3-5 min，在倒置显微镜下观察到细胞刚刚变圆时，加入少量10%胎牛血清的DMEM培养基终止细胞消化过程，用吸管吸取培养基，轻轻吹打使细胞不再贴壁，将细胞悬液转移到新的培养瓶中，并加入适量培养基，放入培养箱中（37 ℃、5% CO²）培养3-4 d后，进行下一次传代培养。
将纳米银和纳米氧化锌粉末分散在无血清的DMEM培养基中，制成不同浓度的纳米银、纳米氧化锌悬液。放入4 ℃冰箱中备用。因为这两种纳米材料易发生团聚，使得该分散体系不稳定，因此每次使用前，需使用使用超声波细胞破碎仪使纳米材料解聚，超声条件为：3 min，超3 s停2 s,功率300 w。
纳米材料表征
通过透射电镜拍照，保存图像。
AO/EB双染
将Caco-2细胞种在6孔细胞培养板中，培养1-2天，每孔中细胞长满80%以后，分别与不同浓度的纳米银和纳米氧化锌(10 μg/ml、25 μg/ml、 50 μg/ml、 75 μg/ml和100 μg /ml)接触培养24 h, 纳米材料浓度为0的孔为阳性对照组），加入 300 μL含有100 μg /ml吖啶橙和 100 μg /ml溴化乙锭的 PBS，染色3分钟，染色结束后用加入适量PBS洗脱1-2次，用荧光倒置显微镜检测染色结果，并拍照保存。
WST-1法细胞毒性分析
为了检测细胞的增值活性，选择对数期的细胞传代，将细胞培养在96孔细胞培养板中，每孔加入200 μl相同的细胞悬液，使用96孔板时弃用周围一圈，在外围一圈加无菌水或PBS, 并将96孔板置于靠近水源的地方，以减小水分蒸发造成的误差。细胞培养1-2天，当细胞量达到大约10000个/孔时，分别加入10 μg/ml、25 μg/ml、 50 μg/ml、 75 μg/ml和100 μg /ml 的纳米银和纳米氧化锌（纳米材料浓度为0的孔为阳性对照组）,每个样品有4个重复孔，与细胞接触培养12 h，24 h，36 h后，分别用WST-1试剂盒进行细胞增值测定，按照说明书配制WST-1溶液，每孔加入20 μlWST-1溶液，使用加了相应量细胞培养液和WST-1溶液，但没有加入细胞的孔作为空白对照。在细胞培养箱中孵育2 h后取出，把96孔板置于摇床上摇动1分钟，使其颜色均匀，注意不能起泡，否则会影响准确度。在450nm波长处测定吸光度，根据吸光值计算细胞活性，通过spss数据分析软件计算差异显著性。细胞存活率的计算公式如下： 

氧化应激
细胞内ROS水平检测
为了检测细胞的活性氧水平（ROS），选择对数期的细胞进行传代培养，将所得的细胞悬液加在96孔板中，每孔加入200 μl相同的细胞悬液，使用96孔板时弃用周围一圈，在外围一圈加无菌水或PBS, 并将96孔板置于靠近水源的地方，以减小水分蒸发造成的误差。细胞培养1-2天，当细胞量达到大约10000个/孔时，分别加入10 μg/ml、25 μg/ml、 50 μg/ml、 75 μg/ml和100 μg /ml的纳米银和纳米氧化锌,另设置两组阴性对照组，第一组阴性对照组在细胞培养孔中只加入细胞培养基，第二组阴性对照组在空白孔中只加入细胞培养基，每个样品有4个重复孔，与细胞接触培养24 h后，用ROS试剂盒检测活性氧水平，按照1:1000用无血清培养基培养液稀释DCFH-DA,使终浓度为10μmol/ml, 取出96孔板中细胞培养液，加入100 μl稀释好的DCFH-DA，使其盖住细胞，在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照，其余孔不加入Rosup，在37℃细胞培养箱内孵育20分钟，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分除去未进入细胞DCFH-DA，使用485nm的激发波长和525nm的发射波长，在酶标仪中检测荧光的强弱。
SOD和GSH水平检测
选取对数期生长状态良好的细胞进行传代，将相同浓度的细胞悬液加入25 cm² 的细胞培养瓶中，培养2-3天，细胞长满培养瓶细胞生长面的80%后，小心吸出细胞培养液，分别加入5ml不同浓度的纳米银和纳米氧化锌（0，10, 25, 50, 75, 100μg/ml，其中0μg/ml为阳性对照组），接触培养24h后, 取出细胞，制成细胞悬液，加入PBS混匀后，在4°C 条件下  4000 rpm离心4分钟，弃掉90%的上清液，再次加入PBS制成细胞悬液，重复离心步骤，弃掉大部分上清液，保留2ml上清液和细胞沉淀，在超声波细胞粉碎仪中超声2分05秒，超声条件为:300w、超5s停10s，获得的悬液用于氧化应激实验的进一步检测。
采用考马斯亮兰法测定蛋白含量。按试剂盒说明书具体步骤进行操作，测定595nm的吸光度（OD），按以下公式计算蛋白含量：

采用超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒检测。按试剂盒说明书具体步骤进行操作，测定450nm的OD值，按以下公式计算SOD活性：
                             
采用谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)测定试剂盒检测。按试剂盒说明书具体步骤进行操作，测定405nm的OD值。按以下公式计算GSH含量：  
                                                                               
使用SPSS 16.0软件对实验结果进行统计分析，对数据进行单因素方差分析，计算p < 0.05和p < 0.01的差异显著性。
 
实验结果与讨论
纳米材料的形态和粒径分布
纳米银（35.48nm）的形态和粒径分布见图1和图2。
纳米氧化锌的形态和粒径分布见图3和图4。
AO/EB双染对细胞的影响
在AO/EB双染中，荧光下，吖啶橙 (AO)能够透过细胞膜，嵌入细胞核，与DNA结合，呈绿色荧光，溴乙锭 (EB)不能透过完整细胞膜，只能在细胞膜被破坏后，与DNA结合，呈红色荧光。
Caco-2细胞与10μg/ml、25μg/ml、 50μg/ml、 75μg/ml和100 μg /ml的纳米银和纳米氧化锌接触培养24h, 空白对照为仅加入培养基的细胞，图5—12是在荧光倒置显微镜200倍放大倍数下观察到的细胞形态。实验结果表明，与25μg/ml、 50μg/ml、 75μg/ml和100 μg /ml纳米氧化锌接触培养的Caco-2细胞大部分呈绿色，为正常的活细胞（图5、6、7、8可见），少量绿色细胞的结构发生变化，细胞核发出明亮的绿色荧光，呈现出新月形（如图5、6、7可见），是早期凋亡的细胞。同时出现了大量橙红色的细胞，有些细胞结构正常，为晚期凋亡的细胞（图5、6可见），大部分细胞轮廓模糊，为坏死细胞（图7、8可见），由以上结果可知剂量为25 μg/ml、 50 μg/ml、 75 μg/ml和100 μg /ml的纳米氧化锌，能够破坏细胞膜，导致Caco-2细胞凋亡和坏死，具有较强的细胞毒性。图5、6中细胞量较少，可能是纳米氧化锌导致细胞死亡，不再贴壁，漂浮在培养基中，在染毒和用PBS漂洗过程中流失。在由于拍照保存的视野随机选取，并且图5、6、7、8的细胞量有差异，所以不能用来判断纳米氧化锌对Caco-2细胞的毒性是否存在剂量-效应关系。与浓度大于50 μg /ml纳米氧银接触培养的Caco-2细胞大部分为结构正常，呈绿色，是正常生长的细胞，并且图10中活细胞量和细胞总量均大于图9，少量细胞结构被破坏，呈现出红色，为坏死细胞（见图9、10），另外还出现了少数细胞核固缩呈亮绿色的早期凋亡细胞（见图9），由以上结果可知剂量为50μg /ml 和100 μg /ml的纳米银，与细胞接触时，能够破坏细胞膜，导致Caco-2细胞凋亡和坏死，具有较强的细胞毒性。与25 μg /ml的纳米银接触培养24h的Caco-2细胞结构正常，呈现绿色荧光，为活细胞，与对照组细胞生长状况基本相同，极少量细胞呈现红色，为晚期凋亡细胞或坏死细胞。可知25 μg /ml的纳米银对细胞的生长基本没有影响，是安全的使用剂量。
 
WST-1法检测的细胞活性
WST-1法、CCK-8法、MTT（3-(4,5-二甲基噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）法均是通过比色法反应细胞代谢活性的强弱，WST-1法和CCK-8法是MTT的升级替代产品能产生水溶性的formazan（甲臜），线性范围更宽，实验结果稳定，灵敏度更高。实验原理是线粒体内的琥珀酸脱氢酶将MTT催化氧化成甲臜，甲臜是一种蓝色晶体，并且甲臜量与活细胞量和细胞代谢活性存在有一定联系，表现为正相关。
本发明通过WST-1法检测纳米银（35.48 nm）和纳米氧化锌对Caco-2细胞活性的影响。图13、14、15分别为纳米银与纳米氧化锌和Caco-2细胞接触培养12 h、24 h、36 h后，细胞活性的变化情况，横坐标为纳米材料的浓度，纵坐标为细胞的活性，纳米处理的细胞组为实验组，纳米材料浓度为0组的为对照组，显著性为实验组与对照组差异的显著性。对照组细胞活性为1，由图13可知，纳米氧化锌染毒剂量为50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml时细胞活性极显著下降；纳米银染毒剂量为100μg/ml时，细胞活性极显著下降。由图由图14可知，纳米氧化锌染毒剂量为25μg/ml时，细胞活性显著下降，染毒剂量为50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml时细胞活性极显著下降；纳米银染毒剂量为75μg/ml时，细胞活性显著下降，毒剂量为100 μg/ml时，细胞活性极显著下降。由图15可知，纳米氧化锌染毒剂量为10 μg/ml和25 μg/ml时，细胞活性显著下降，纳米氧化锌染毒剂量为50 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml时细胞活性极显著下降，并且在高剂量组(75 μg/ml 和100 μg/ml)细胞活性几乎为0；纳米银染毒剂量为75μg/ml和100μg/ml时，细胞活性极显著下降。结果表明，纳米氧化锌在染毒剂量小于100μg/ml时，对Caco-2细胞的毒性存在剂量-效应和时间-效应关系，而纳米银仅在染毒剂量75-100 μg/ml时，对Caco-2细胞的毒性表现出剂量-效应和时间-效应关系，在染毒剂量小于50 μg/ml,细胞活性在1左右波动，细胞活性正常，对细胞没有毒性。
 
细胞的氧化应激
氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时,体内高活性分子产生过多，使氧化系统和抗氧化系统失衡,导致导致组织损伤的过程。机体内存在酶抗氧化系统和非酶抗氧化系统两类。本发明通过检测细胞内的活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽(GSH) 含量来研究纳米银和纳米氧化锌对Caco-2细胞的氧化应激，探究纳米银对肠上皮细胞的安全性。其中SOD属于酶抗氧化系统，GSH属于非酶抗氧化系统。
图16、17、18分别为纳米银与纳米氧化锌和Caco-2细胞接触培养24h后，细胞内ROS、SOD和GSH含量的变化情况，横坐标为纳米材料的浓度，纵坐标分别为细胞内的ROS、SOD和GSH含量，纳米材料处理的细胞组为实验组，纳米材料浓度为0组的为对照组，显著性为实验组与对照组差异的显著性。由图16可知，纳米氧化锌染毒剂量为10 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml时细胞内ROS水平极显著上升，纳米银染毒剂量为10 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml时细胞内ROS水平显著上升，两中纳米材料均引起了细胞的氧化还原失衡。
由图17可知，纳米氧化锌染毒剂量为25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml时细胞内SOD含量极显著下降，并且随着纳米氧化锌浓度的升高，SOD含量下降。纳米银染毒剂量为10 μg/ml和25 μg/ml时细胞内SOD含量显著下降，染毒剂量为50 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml时细胞内SOD含量与对照相比，极显著下降，但是三者的SOD含量基本相同。
由图18可知，纳米氧化锌染毒剂量为10 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml时细胞内GSH含量极显著下降，并且随着纳米氧化锌浓度的升高，GSH含量下降。纳米银染毒剂量为10 μg/ml、25 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml时细胞内GSH含量显著上升，染毒剂量为50 μg/ml时细胞内GSH含量与对照相比，差异极显著。
综上，纳米氧化锌与细胞接触培养24 h后，随着纳米氧化锌浓度的升高，细胞内的ROS含量升高，SOD含量降低（10 μg/ml除外），GSH含量降低，并且与对照组的差异达到显著或极显著水平。结果表明纳米氧化锌对细胞造成了氧化应激损伤，打破了细胞内氧化还原平衡，导致了细胞的凋亡。然而，纳米银与细胞接触培养24 h后，随着纳米银浓度的升高，细胞内的ROS含量显著升高，SOD含量显著或极显著降低，GSH含量先升高（0-50 μg/ml），后降低（50-100 μg/ml），但是GSH含量高于对照，与其差异达到显著或极显著水平。结果表明，纳米银可以引起细胞内活性氧含量升高，打破氧化还原平衡，激活了细胞内的抗氧化系统，导致SOD含量下降，在纳米银剂量为0-50 μg/ml时，细胞内非酶抗氧化系统在清除活性氧上起到了关键作用，产生大量GSH来维持细胞内的氧化还原平衡，在纳米银剂量为50-100 μg/ml时，细胞产生GSH的能力下降，细胞内SOD含量较低，与对照差异极显著，可能的原因是，细胞遭到了不同程度的氧化应激损伤，但是与纳米氧化锌相比，GSH含量显著偏高，因此，推测纳米银对细胞的氧化应激损伤较弱。
本发明通过以上方法可以发现，35.48nm的银粒子在低剂量（<50μg/ml）时对肠上皮细胞的活性没有影响，不会造成氧化应激损伤；在染毒剂量为75μg/ml和100μg/ml对肠上皮细胞（Caco-2）的毒性存在剂量-效应和时间-效应，并对细胞造成了程度较弱的氧化应激损伤。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明的保护范围之内。