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1、10申请公布号CN104195129A43申请公布日20141210CN104195129A21申请号201410364753022申请日20140728C12N11/14200601C02F3/00200601C02F101/3820060171申请人华中师范大学地址430079湖北省武汉市洪山区珞瑜路152号72发明人冯玲玲杜丹万坚李俊肖闪白柳74专利代理机构北京润平知识产权代理有限公司11283代理人李婉婉金迪54发明名称一种固定化的藻毒素降解酶及其制备方法和应用57摘要本发明公开了一种固定化的藻毒素降解酶的制备方法，该方法包括1在第一溶剂存在下，用羧基活化剂将氧化石墨烯活化后固液分离，。
2、得到活化后的氧化石墨烯；2在第二溶剂存在下，将步骤1中得到的活化后的氧化石墨烯与功能化的四氧化三铁纳米粒子进行接触后固液分离，得到固相载体；3将藻毒素降解酶负载在固相载体上。本发明还提供了由上述方法制得的固定化的藻毒素降解酶，以及上述固定化的藻毒素降解酶在藻毒素降解中的应用。通过本发明的方法，能够低成本地将藻毒素降解酶制备成固定化的藻毒素降解酶，提高藻毒素降解酶的重复利用次数以及该酶的环境耐受性，且其反应过程可以严格控制、藻毒素的降解率高。51INTCL权利要求书2页说明书11页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书11页附图1页10申请公布号CN1041。
3、95129ACN104195129A1/2页21一种固定化的藻毒素降解酶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤1在第一溶剂存在下，用羧基活化剂将氧化石墨烯活化后固液分离，得到活化后的氧化石墨烯；2在第二溶剂存在下，将步骤1中得到的活化后的氧化石墨烯与功能化的四氧化三铁纳米粒子进行接触后固液分离，得到固相载体；3将藻毒素降解酶负载在所述固相载体上，其中，所述功能化的四氧化三铁纳米粒子为氨基功能化的四氧化三铁纳米粒子、羧基功能化的四氧化三铁纳米粒子、叠氮基功能化的四氧化三铁纳米粒子和巯基功能化的四氧化三铁纳米粒子中的一种或多种；所述氧化石墨烯和所述功能化的四氧化三铁纳米粒子的重量比为1201。。
4、2根据权利要求1所述的方法，其中，所述氧化石墨烯和功能化的四氧化三铁纳米粒子的重量比为2101，更优选为361。3根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1中，所述氧化石墨烯和羧基活化剂的重量比为110100，优选为13040。4根据权利要求13中任意一项所述的方法，其中，所述羧基活化剂为N羟基琥珀酰亚胺与1乙基33二甲基氨基丙基碳酰二亚胺和/或N,N二环己基碳二亚胺的组合。5根据权利要求4所述的方法，其中，所述羧基活性剂由3050重量的N羟基琥珀酰亚胺与5070重量的1乙基33二甲基氨基丙基碳酰二亚胺和/或N,N二环己基碳二亚胺组成；优选地，所述石墨烯功能基团活性剂由3050重量的N羟基琥珀酰亚。
5、胺和5070重量的1乙基33二甲基氨基丙基碳酰二亚胺或N,N二环己基碳二亚胺组成；更优选地，所述羧基活性剂由3050重量的N羟基琥珀酰亚胺和5070重量的1乙基33二甲基氨基丙基碳酰二亚胺组成。6根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1中，所述第一溶剂为磷酸钠缓冲溶液、磷酸缓冲溶液或2吗啉乙磺酸缓冲溶液；所述活化的条件包括PH为37，温度为2080，时间为2060MIN。7根据权利要求1或6所述的方法，其中，步骤2中，所述第二溶剂为磷酸钠缓冲溶液或磷酸缓冲溶液；所述接触的条件包括PH为58，温度为2080，时间为320H。8根据权利要求1所述的方法，其中，所述功能化的四氧化三铁纳米粒子为氨基功能。
6、化的四氧化三铁纳米粒子和/或羧基功能化的四氧化三铁纳米粒子。9根据权利要求1或8所述的方法，其中，所述功能化的四氧化三铁纳米粒子的粒度为50300NM，优选为90200NM。10根据权利要求1所述的方法，其中，所述氧化石墨烯的粒度为110M，优选为15M。11根据权利要求1所述的方法，其中，所述藻毒素降解酶为MLRA、MLRB、MLRC和MLRD中一种或多种。12一种由权利要求111中任意一项所述的方法制得的固定化的藻毒素降解酶。13根据权利要求12所述的固定化的藻毒素降解酶，其中，以所述固定化的藻毒素降解酶的总量为基准，所述藻毒素降解酶的含量为1重量以上，优选为16重量。权利要求书CN104。
7、195129A2/2页314一种权利要求12或13所述的固定化的藻毒素降解酶在降解藻毒素中的应用。15根据权利要求14所述的应用，其中，所述降解的条件包括PH为658，温度为2080，时间为2120MIN；优选地，所述降解的条件包括PH为6575，温度为3060，时间为1060MIN；更优选地，所述降解的条件包括PH为775，温度为3060，时间为3060MIN。16根据权利要求14所述的应用，其中，所述藻毒素为MCLR、MCYR和MCRR中一种或多种。权利要求书CN104195129A1/11页4一种固定化的藻毒素降解酶及其制备方法和应用技术领域0001本发明涉及一种固定化的藻毒素降解酶及其。
8、制备方法和应用。背景技术0002藻毒素MICROCYSTINS,MCS是一类环状七肽化合物，其结构如下述式1所示。目前已发现有67种藻毒素，这些藻毒素是根据环状结构中2、3、4和7位的氨基酸残基不同来划分的。蓝藻门中的浮丝藻属PLANKTOTHRIX、束丝藻属APHANIZOMENON、微囊藻属MICROCYSTIS中的某些种类都能产生此类毒素。0003MCS污染会导致水体动物的死亡，饮用被藻毒素污染的水可诱发人、畜、禽等肝损伤、导致肝癌等，可见，MCS危害严重，直接威胁人类的健康和生存。最常见的MCS包括MCLR、MCRR、MCYR等，其中MCLR的环状结构中2和4位的氨基酸残基分别为赖氨酸。
9、残基L和精氨酸残基R，MCRR的环状结构中2和4位的氨基酸残基都为精氨酸残基R，MCYR的环状结构中2和4位的氨基酸残基分别为酪氨酸残基L和精氨酸残基R。00040005近年来，由于各地水体富营养化程度的提高，蓝藻水华现象频繁爆发，这些生长或死亡的蓝藻会释放出大量的藻毒素，对人类和环境造成的危害日益严重。MCS的去毒或解毒显得尤为迫切。同时由于人们生活水平的提高，对水体治理的安全性、有效性提出了更高的要求。0006生物降解酶可以降解藻毒素，使其转变为低毒、无毒的小分子物质，具有专一性、高效性且不会产生有毒物质等特点从而备受关注。生物酶降解藻毒素无疑是目前有效、安全解除藻毒素对水体的污染问题的最。
10、优方法之一。0007然而游离的藻毒素降解酶存在重复利用次数少、反应过程难以控制、酶的稳定性低且成本高的缺陷。发明内容0008本发明的目的在于克服游离的藻毒素降解酶存在的上述缺陷，提供一种重复利用说明书CN104195129A2/11页5次数多、反应过程容易控制、酶的稳定性高且成本低的固定化的藻毒素降解酶及其制备方法，以及该固定化的藻毒素降解酶在降解藻毒素中的应用。0009为此，本发明提供一种固定化的藻毒素降解酶的制备方法，其中，该方法包括以下步骤00101在第一溶剂存在下，用羧基活化剂将氧化石墨烯活化后固液分离，得到活化后的氧化石墨烯；00112在第二溶剂存在下，将步骤1中得到的活化后的氧化石。
11、墨烯与功能化的四氧化三铁纳米粒子进行接触后固液分离，得到固相载体；00123将藻毒素降解酶负载在所述固相载体上，0013其中，所述功能化的四氧化三铁纳米粒子为氨基功能化的四氧化三铁纳米粒子、羧基功能化的四氧化三铁纳米粒子、叠氮基功能化的四氧化三铁纳米粒子和巯基功能化的四氧化三铁纳米粒子中的一种或多种；所述氧化石墨烯和所述功能化的四氧化三铁纳米粒子的重量比为1201。0014本发明还提供了由上述方法制得的固定化的藻毒素降解酶。0015本发明还提供了上述固定化的藻毒素降解酶在降解藻毒素中的应用。0016通过本发明的方法，能够低成本地将藻毒素降解酶制备成固定化的藻毒素降解酶，并且在将上述制备得到的固。
12、定化的藻毒素降解酶用于降解藻毒素时，特别是用于降解MCLR、MCYR和MCRR中一种或多种时，能够提高藻毒素降解酶的重复利用次数以及该酶的环境耐受性，使得所得的固定化的藻毒素降解酶可以在较长时间内重复利用，且其反应过程可以严格控制、藻毒素的降解率高。0017本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明0018附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中0019图1是制备例1所得的纯化MLRA酶的SDSPAGE图。具体实施方式0020以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解。
13、的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。0021本发明提供一种固定化的藻毒素降解酶的制备方法，其中，该方法包括以下步骤00221在第一溶剂存在下，用羧基活化剂将氧化石墨烯活化后固液分离，得到活化后的氧化石墨烯；00232在第二溶剂存在下，将步骤1中得到的活化后的氧化石墨烯与功能化的四氧化三铁纳米粒子进行接触后固液分离，得到固相载体；00243将藻毒素降解酶负载在所述固相载体上，0025其中，所述功能化的四氧化三铁纳米粒子为氨基功能化的四氧化三铁纳米粒子、羧基功能化的四氧化三铁纳米粒子、叠氮基功能化的四氧化三铁纳米粒子和巯基功能化的说明书CN104195129A。
14、3/11页6四氧化三铁纳米粒子中的一种或多种；所述氧化石墨烯和所述功能化的四氧化三铁纳米粒子的重量比为1201。0026在本发明中，所述藻毒素降解酶可以通过以下方法制备而得0027具体而言，以MLRA藻毒素降解酶的制备方法为例，该方法主要可以包括以下步骤00281将MLRA编码序列构建到原核表达载体PMALC2X上得到表达MLRA的载体PMALMLRA；00292将PMALMLRA转化到大肠杆菌例如TB1、DH5中得到MLRA的表达菌；00303将MLRA的表达菌用IPTG诱导表达，收集诱导表达后的菌体，破碎后利用PMALC2X上的融合蛋白表达标签麦芽糖结合蛋白MBP，相对分子量42500纯化。
15、得到高纯高效的藻毒素降解酶。0031虽然该方法仅记载了编码获得MLRA酶的方法，但是本发明还可以采用该方法来编码获得其他的藻毒素降解酶，例如MLRB、MLRC、MLRD酶等。0032在本发明中，步骤1为在第一溶剂存在下，用羧基活化剂将氧化石墨烯活化后固液分离，得到活化后的氧化石墨烯。在该步骤中，所述羧基活化剂用于将氧化石墨烯上的羧基进行活化，以便在步骤2中与功能化的四氧化三铁纳米粒子结合。0033在本发明中，所述氧化石墨烯可以是市售品，也可以通过本领域常规的氧化石墨烯的制备方法来制得，例如通过HUMMERS法HUMMERSWS,OFFEMANRE,PREPARATIONOFGRAPHITICO。
16、XIDE,JAMCHEMSOC,1958,801339、机械剥离法MECHANICALCLEAVAGENOVOSELOVKS,GEIMAK,MOROZOVSV,ETALELECTRICFIELDEFFECTINATOMICALLYTHINCARBONFILMS,SCIENCE,2004,306666669、晶体外延生长法、化学法CHEMICALEXFOLIATIONSTAUDENMAIERL,VERFAHRENZURDARSTELLUNGDERGRAPHITSAURE,BERDTSHCHEMGES,1898,3114811499等方法来制得。优选情况下，所述氧化石墨烯的粒度为110M，更优选为。
17、15M。0034在本发明中，所述羧基活化剂可以为N羟基琥珀酰亚胺NHS、1乙基33二甲基氨基丙基碳酰二亚胺EDC和N,N二环己基碳二亚胺DCC中的一种或多种，特别优选为N羟基琥珀酰亚胺NHS与1乙基33二甲基氨基丙基碳酰二亚胺EDC和/或N,N二环己基碳二亚胺DCC的组合，即，特别优选地，所述羧基活化剂可以为NHS和EDC的组合，也可以为NHS和DCC的组合，还可以为NHS、EDC和DCC的组合。更优选地，所述羧基活化剂为N羟基琥珀酰亚胺NHS和1乙基33二甲基氨基丙基碳酰二亚胺EDC的组合。0035根据本发明，步骤1中，所述羧基活化剂的用量只要能够充分将氧化石墨烯表面的羧基活化即可。优选情况。
18、下，所述氧化石墨烯和羧基活化剂的重量比为110100，更优选为13040。当所述氧化石墨烯和羧基活化剂的重量比在上述范围内，特别是更为优选的范围内时，能够更好地活化氧化石墨烯上的羧基官能团，使得活化后的氧化石墨烯更易与功能化的四氧化三铁纳米粒子结合，从而有利于藻毒素降解酶的负载。0036在本发明的一个优选的实施方式中，所述羧基活性剂由3050重量的N羟基琥珀酰亚胺NHS与5070重量的1乙基33二甲基氨基丙基碳酰二亚胺EDC和/或N,N二环己基碳二亚胺DCC组成对于所述羧基活化剂为NHS、EDC和DCC组合说明书CN104195129A4/11页7的情况，NHS的含量为3050重量，EDC的含。
19、量为3040重量，DCC的含量为1040重量。更优选地，所述羧基活性剂由3050重量的N羟基琥珀酰亚胺NHS和5070重量的1乙基33二甲基氨基丙基碳酰二亚胺EDC或N,N二环己基碳二亚胺DCC组成；更进一步优选地，所述羧基活性剂由3050重量的N羟基琥珀酰亚胺NHS和5070重量的1乙基33二甲基氨基丙基碳酰二亚胺EDC组成。当在本发明中采用这样组成的羧基活化剂时，可以获得更好活化氧化石墨烯功能基团，提高与功能化的四氧化三铁纳米粒子，从而更好地克服氧化石墨烯功能基团低结合效率的缺陷。0037根据本发明，所述活化在第一溶剂存在下进行，也就是说，所述活化是在第一溶剂中进行的。具体而言，可以按照以。
20、下方式进行。00381在水中充分分散氧化石墨烯后，再将氧化石墨烯的水分散液与溶解了羧基活化剂的第一溶剂进行混合的方式；00392将氧化石墨烯充分分散于第一溶剂中后，再在第一溶剂中加入羧基活化剂的方式。0040从提高氧化石墨烯与功能化的四氧化三铁纳米粒子及酶结合效率的方面去考虑，优选第1种方式。0041作为将氧化石墨烯充分分散的方法可以采用本领域所公知的各种方法，例如可以是在室温下超声分散24H。0042另外，在第1种方式中，通过在水中充分分散氧化石墨烯，作为水的用量，没有特别的限定，例如相对于每1MG氧化石墨烯，水的用量为052ML。0043作为所述第一溶剂可以为磷酸钠缓冲溶液PBS、磷酸缓冲。
21、溶液PB或2吗啉乙磺酸缓冲溶液MES2吗啉乙磺酸和NAOH构成的缓冲溶液，特别优选采用2吗啉乙磺酸缓冲溶液。0044在本发明中，优选情况下，所述活化的条件包括PH为37，温度为2080，时间为2060MIN。更优选地，所述活化的条件包括PH为47，温度为3040，时间为2040MIN。本领域技术人员可以理解的是，通过适当地使用上述缓冲溶液，可以将PH值控制在上述范围内。0045在本发明中，作为第一溶剂的用量没有特别的限定，只要能够将羧基活化剂充分溶解即可。例如相对于羧基活化剂10MG，可以使用015ML，优选为011ML。0046根据本发明，优选的情况下，在步骤1中，所述固液分离可以采用本领域。
22、所公知的各种方法来进行，例如可以为离心或过滤。0047根据本发明，优选的情况下，该方法还包括将步骤1得到的活化后的氧化石墨烯进行洗涤，以除去少量含在活化后的氧化石墨烯中的杂质例如羧基活化剂。所述洗涤所使用的溶剂，只要是对活化后的氧化石墨烯为惰性对羧基活化剂溶解度大且对活化后的氧化石墨烯溶解度小或不溶解的溶剂即可。作为这样的溶剂可以举出PBS缓冲溶液PH774。0048在本发明中，步骤2为在第二溶剂存在下，将步骤1中得到的活化后的氧化石墨烯与功能化的四氧化三铁纳米粒子进行接触后固液分离，得到固相载体。其中，将活化后的氧化石墨烯与功能化的四氧化三铁纳米粒子进行接触，使得氧化石墨烯能够和功能化的四氧。
23、化三铁纳米粒子结合为一体，所得的固相载体为一种磁性氧化石墨烯复合固化材说明书CN104195129A5/11页8料，使用该材料用于负载藻毒素降解酶来获得本发明的固定化的藻毒素降解酶。0049在本发明中，优选情况下，所述氧化石墨烯和功能化的四氧化三铁纳米粒子的重量比为2101，更优选为361。当所述氧化石墨烯和所述功能化的四氧化三铁纳米粒子的重量比小于1/1时，将存在氧化石墨烯剩余的羧基较少不利于所形成的固定化材料与酶的结合；而当所述氧化石墨烯和所述功能化的四氧化三铁纳米粒子的重量比大于20/1时，使得在通过磁性吸附去除固定化的藻毒素降解酶时，由于磁性四氧化铁纳米粒子的量较少，使得磁性吸附分离不。
24、彻底。本发明通过使所述氧化石墨烯和所述功能化的四氧化三铁纳米粒子的重量比为1201优选为2101，更优选为361时，获得的磁性氧化石墨烯复合固化材料，既可使得藻毒素降解酶与其的结合强度更强，又可使得去除固定化的藻毒素降解酶时磁性分离效果更好，有利于本发明的固定化的藻毒素降解酶在降解藻毒素的应用中时稳定性和重复使用率的提高。0050优选情况下，所述功能化的四氧化三铁纳米粒子为氨基功能化的四氧化三铁纳米粒子和/或羧基功能化的四氧化三铁纳米粒子。0051在本发明中，所述功能化的四氧化三铁纳米粒子可以为市售品，也可以通过本领域常规的方法来制得，例如通过共沉淀法、水热合成法CHENXINGHYDROTH。
25、ERMALSYNTHESISANDSUPERPARAMAGNETICBEHAVIORSOFASERIESOFFERRITENANOPARTICLESJCHINESEJOURNALOFINORGANICCHEMISTRY,20025460464等方法来制得。优选情况下，所述功能化的四氧化三铁纳米粒子的粒度为50300NM，更优选为90200NM，更进一步优选为90110NM。0052在本发明中，所述接触在第二溶剂存在下进行，也就是说，所述接触是在第二溶剂中进行的。具体而言，可以采用先将步骤1所得的活化后的氧化石墨烯充分分散到第二溶剂中，再加入所述功能化的四氧化三铁纳米粒子的方式。0053作为将活。
26、化后的氧化石墨烯充分分散的方法可以采用本领域所公知的各种方法，例如可以是在室温下超声分散2060MIN。0054作为所述第二溶剂可以为磷酸钠缓冲溶液PBS或磷酸缓冲溶液PB。0055在本发明中，优选情况下，所述接触的条件包括PH为58，温度为2080，时间为320H。更优选地，所述接触的条件包括PH为68，温度为2040，时间为613H。其中，本领域技术人员可以理解的是，通过适当地使用作为缓冲溶液的第二溶剂，可以将PH值控制在上述范围内。0056在本发明中，对第二溶剂的用量并没有特别的限定，只要能够将活化后的氧化石墨烯充分分散即可。例如相对于1MG氧化石墨烯，可以使用15ML的第二溶剂，优选为。
27、14ML。0057在本发明中，经过步骤1的处理后，氧化石墨烯基本上不损失，在本发明中，可默认活化后的氧化石墨烯的量依旧等于原始采用的氧化石墨烯的量。0058在本发明中，优选情况下，该方法还包括将步骤2所得固相载体进行洗涤，以除去多余的羧基活性剂及功能化的四氧化三铁纳米粒子。所述洗涤的方式例如可以为采用水洗涤36次。0059在本发明中，步骤3为将藻毒素降解酶负载在所述固相载体上，即可得到本发明的固定化的藻毒素降解酶。将在所述固相载体上负载藻毒素降解酶的方法可以为本领说明书CN104195129A6/11页9域常规的固定化酶的制备中负载的方法，例如静电吸附法、化学键结合法、包埋法及交联法等，本发明。
28、优选采用的静电吸附法包括以下步骤先确定藻毒素降解酶在指定PH下所带的电荷比如PH6，MLRA带正电荷，然后使磁性氧化石墨烯复合固化材料带上与藻毒素降解酶相反的电荷。0060在本发明中，由于将活化后的氧化石墨烯与带磁性的功能化的四氧化三铁纳米粒子结合，使得所得的磁性氧化石墨烯复合固化材料既可以在不影响藻毒素降解酶活性的情况下又具有磁性分离功能。0061本发明还提供了由上述方法制得的固定化的藻毒素降解酶。0062为了获得更好的藻毒素的降解效果，优选情况下，以所述固定化的藻毒素降解酶的总量为基准，所述藻毒素降解酶的含量为1重量以上，例如所述藻毒素降解酶的含量为16重量。在本发明中，当所述藻毒素降解酶。
29、的含量小于1重量时，将存在固定化的酶催化效率低，固定化材料难以充分利用的问题；一般情况下，在达到固定化材料最大结合量的情况下，固定化材料结合的藻毒素降解酶的含量越高越好。而根据本发明的一种优选的实施方式，以所述固定化的藻毒素降解酶的总量为基准，所述藻毒素降解酶的含量为16重量。根据本发明的另一种优选的实施方式，以所述固定化的藻毒素降解酶的总量为基准，所述藻毒素降解酶的含量为245重量。0063本发明还提供了上述固定化的藻毒素降解酶在降解藻毒素中的应用。0064尽管所述固定化的藻毒素降解酶对所要降解的藻毒素并没有特别的限定，可以为本领域常见的藻毒素。但是本发明中，所述固定化的藻毒素降解酶特别优选。
30、用于降解的藻毒素为MCLR、MCYR和MCRR中一种或多种。在本发明的一种优选实施方式中，对MCLR、MCYR和MCRR中一种或多种的降解，本发明的固定化的藻毒素降解酶的活性可以达到80以上，甚至是90以上。0065尽管本发明对所述固定化的藻毒素降解酶的降解条件并没有特别的限定，可以根据游离的藻毒素降解酶的性质进行调整。但是，本发明的发明人经过深入研究发现，当所述降解的条件包括PH为658，温度为2080，时间为2120MIN时，本发明的固定化的藻毒素降解酶具有更高的稳定性和环境耐受性，因此可以在较高温度下对藻毒素进行降解，并且在重复多次使用后仍然能够具有较高的降解活性，因此，采用本发明的固定。
31、化的藻毒素降解酶对藻毒素进行降解，在获得以上诸多优良的降解效果的同时也可以获得低成本的经济效益。而为了提高降解效率，更优选地，所述降解的条件包括PH为6575，温度为3060，时间为1060MIN。更进一步优选为，所述降解的条件包括PH为775，温度为3060，时间为3060MIN。0066以下将通过实施例对本发明进行详细描述。0067以下实施例、对比例、应用例和应用对比例中，采用HPLC分析藻毒素的量HPLC安捷伦1200LC，柱子为ECLIPSEXDBC18色谱柱46MM15MM，并计算酶的活性。其具体方法为取190LPBSPH75与10L藻毒素MCLR10G/ML混合液来测量降解前的藻毒。
32、素的出峰面积和出峰时间，再对降解后并离心的上清液中的藻毒素的量进行HPLC分析，确定降解后产物中剩余的藻毒素的出峰面积和出峰面积，并通过下述公式计算得出酶的活性。0068固定化的藻毒素降解酶的活性或游离的藻毒素降解酶的活性为100剩余的说明书CN104195129A7/11页10藻毒素的出峰面积/降解前的藻毒素的出峰面积100。0069以下实施例、对比例、应用例和应用对比例中，LB培养基为胰蛋白胨10G/L、酵母提取物5G/L、NACL10G/L、氨苄青霉素30MG/L。0070制备例10071本制备例用于说明藻毒素降解酶的制备方法。0072将MLRA编码序列ACCESSIONNUMBERAF。
33、411068构建到原核表达载体PMALC2X上插入BAMH和HIND酶切位点之间得到表达MLRA的表达载体PMALC2XMLRA，具体构建方法参见分子克隆实验指南第三版J萨姆布鲁克等人，科学出版社，2002第1章和第15章。0073将制得的感受态DH5从冰箱中拿出放于冰上冻融，加入10L连接产物表达载体PMALC2XMLRA，将EP管重置于冰中30MIN，然后放入到42的水浴中，放置90S，再放入冰中，静置5MIN。每管加入600L的LB培养基，在摇床中37、180RPM培养70MIN；然后4000RPM离心，取600L上清，将沉淀轻轻混匀，涂在含氨苄青霉素30MG/L的LB平板上，在37恒温。
34、箱中培养15H。0074将上步平板上长出的单菌落，于含氨苄青霉素30MG/L的LB培养基20ML的烧瓶中，37、220RPM培养16H，进行活化。将活化后的菌送去英潍捷基上海贸易有限公司进行测序，测序序列结果显示载入的MLRA片段长度为1008BP，在NCBI中通过BLAST进行比对，比对一致，表明MLRA表达菌构建成功。0075将通过上述方法成功构建的含有MLRA表达载体的菌株活化于20MLLB培养基的烧瓶中37、220RPM培养16H，取活化后的菌液按1体积的接种量接种于500MLLB培养基中，当菌液的OD600为10时，加入05ML的05MMIPTG诱导剂，在22下诱导8小时。然后用高速。
35、冷冻离心机J26XP，BECKMAN12000RPM、4离心收集诱导后的菌。0076将收集的细菌沉淀放在冰上冻融，用30ML柱平衡缓冲液36MMKH2PO4，18MMK2HPO4，200MMKCL悬浮细菌，超声破碎运行3秒，停3秒，180个循环至溶液变为半透明状态为止，然后用高速冷冻离心机J26XP，BECKMAN12000RPM，4离心40MIN，取上清用045M的滤膜过滤。0077将过滤好的上清用再生好的MBP柱树脂4结合2H，2H后将粗酶与树脂的混合液倒入空柱中，待其全部加入柱子中后用柱平衡缓冲液36MMKH2PO4，18MMK2HPO4，200MMKCL冲洗树脂使杂蛋白从树脂上脱落下来。
36、，用考马斯亮蓝来检验杂蛋白的量，待考马斯亮蓝不显色后说明杂蛋白已基本洗干净。最后在树脂中加入5ML洗脱缓冲液036G麦芽糖，柱平衡缓冲液100ML，然后用一干净浓缩管收集目的蛋白同样用考马斯亮蓝检验目的蛋白的量。在4下4000RPM离心，浓缩蛋白直至蛋白浓度达到1MG/ML以上，该蛋白用于后续藻毒素降解酶的固定化。获得纯化藻毒素降解酶的SDSPAGE检测结果662KDA的蛋白为MLRA酶如图1所示，图1中，1为MARKER，2为纯化获得的MLRA；其中，蛋白MARKER是购买的市售品，含有各种不同大小的蛋白，可以指示蛋白的大小；根据蛋白MARKER指示，在6602KDA的那条带处有目的蛋白ML。
37、RA，这与根据氨基酸序列预测的MLRA大小一致。0078实施例10079本实施例用于说明本发明的固定化的藻毒素降解酶及其制备方法。0080将2MGGO5M，购自南京先丰纳米材料科技有限公司，XF002加入到2ML水中，说明书CN104195129A108/11页11在100W，25的条件下超声分散3H，得到GO溶液。将20MG的EDC购自上海共价化学科技有限公司和10MG的NHS购自武汉楚诚正茂科技工程有限公司溶解于1ML的MESPH52中并加入到上述GO溶液中，在30下接触30MIN，然后固液分离，将所得固相用PBSPH7清洗3次。用2MLPBSPH74将该清洗后的固相分散，加入04MG的氨。
38、基功能化的四氧化三铁纳米粒子100NM，购自天津倍思乐色谱技术开发中心牌号3611，在25下接触12H，然后固液分离，将所得固相用水洗4次。0081将该水洗后的固相与制备例1所得的1ML的1MG/L的MLRA酶，在磷酸缓冲体系中PH6、30下接触1H，然后固液分离，所得的固相用磷酸缓冲清洗3次，即得到固定化的藻毒素降解酶，其中，MLRA酶的含量为42重量。0082实施例20083本实施例用于说明本发明的固定化的藻毒素降解酶及其制备方法。0084将2MGGO1M，购自南京先丰纳米材料科技有限公司，XF002加入到2ML水中，在100W，25的条件下超声分散3H，得到GO溶液。将40MG的EDC购。
39、自上海共价化学科技有限公司和30MG的NHS购自武汉楚诚正茂科技工程有限公司溶解于15ML的MESPH4中并加入到上述GO溶液中，在40下接触25MIN，然后固液分离，将所得固相用PBSPH74清洗3次。用4MLPBSPH8将该清洗后的固相分散，加入06MG的羧基功能化的四氧化三铁纳米粒子100NM，购自天津倍思乐色谱技术开发中心牌号3612，在40下接触6H，然后固液分离，将所得固相用水洗4次。0085将该水洗后的固相与制备例1所得的1ML的1MG/L的MLRA酶，在磷酸缓冲体系中PH6、30下接触1H，然后固液分离，所得的固相用磷酸缓冲清洗3次，即得到固定化的藻毒素降解酶，其中，MLRA酶。
40、的含量为44重量。0086实施例30087将2MGGO3M，购自南京先丰纳米材料科技有限公司，XF002加入到4ML水中，在100W，25的条件下超声分散3H，得到GO溶液。将37MG的EDC购自上海共价化学科技有限公司和30MG的NHS购自武汉楚诚正茂科技工程有限公司溶解于1ML的MESPH6中并加入到上述GO溶液中，在50下接触40MIN，然后固液分离，将所得固相用PBSPH74清洗3次。用25MLPBSPH65将该清洗后的固相分散，加入035MG的氨基功能化的四氧化三铁纳米粒子200NM，购自天津倍思乐色谱技术开发中心牌号3611，在30下接触10H，然后固液分离，将所得固相用水洗4次。。
41、0088将该水洗后的固相与制备例1所得的1ML的1MG/L的MLRA酶，在磷酸缓冲体系中PH6、30下接触1H，然后固液分离，所得的固相用磷酸缓冲清洗3次，即得到固定化的藻毒素降解酶，其中，MLRA酶的含量为45重量。0089实施例40090本实施例用于说明本发明的固定化的藻毒素降解酶及其制备方法。0091根据实施例1所述的方法，所不同的是，氨基功能化的四氧化三铁纳米粒子的用量为01MG，所得固定化的藻毒素降解酶中，MLRA酶的含量为31重量。0092实施例50093本实施例用于说明本发明的固定化的藻毒素降解酶及其制备方法。0094根据实施例1所述的方法，所不同的是，在不加入EDC来制得固定化。
42、的藻毒素降解说明书CN104195129A119/11页12酶，其中，MLRA酶的含量为28重量。0095对比例10096根据实施例1所述的方法，所不同的是，氨基功能化的四氧化三铁纳米粒子的用量为15MG，所得固定化的藻毒素降解酶中，MLRA酶的含量为08重量。0097对比例20098根据实施例1所述的方法，所不同的是，氨基功能化的四氧化三铁纳米粒子的用量为007MG，所得固定化的藻毒素降解酶中，MLRA酶的含量为06重量。0099应用例10100向182LPBSPH75中加入10L藻毒素MCLR10G/ML，并分别加入8G的实施例15和对比例12所得的固定化的藻毒素降解酶，在40下接触30M。
43、IN，然后离心，所得上清液进行HPLC分析，其固定化的藻毒素降解酶的活性分别见表1所示。0101表101020103应用例20104根据应用例1所述的方法，所不同的是，对藻毒素MCRR进行降解，所得上清液进行HPLC分析，其固定化的藻毒素降解酶的活性分别见表2所示。0105表201060107应用例30108根据应用例1所述的方法，所不同的是，仅针对实施例1所得的固定化的藻毒素降解酶和05G的游离的藻毒素降解酶MLRA，分别在PH为5、6、65、7、75、8下进行藻毒素MCLR的降解测试，实施例1的固定化的藻毒素降解酶的活性和游离的MLRA藻毒素降解酶的活性分别见表3所示。0109表30110。
44、说明书CN104195129A1210/11页130111应用例40112根据应用实施例1所述的方法，所不同的是，仅针对实施例1所得的固定化的藻毒素降解酶和05G的游离的MLRA藻毒素降解酶，分别在20、30、40、50、60、70、80下进行藻毒素MCLR的降解测试，实施例1的固定化的藻毒素降解酶的活性和游离的MLRA藻毒素降解酶的活性分别见表4所示。0113表401140115应用例50116根据应用实施例1所述的方法，所不同的是，仅针对实施例1所得的固定化的藻毒素降解酶，分别在10、20、30、40、60、80、100、120MIN下进行藻毒素MCLR的降解测试，实施例1的固定化的藻毒素。
45、降解酶的活性见表5所示。0117表501180119应用例60120根据应用实施例1所述的方法，将实施例1、对比例1和2的固定化的藻毒素降解酶在按照应用实施例1的方法进行初次降解藻毒素后，将离心所得固体继续作为固定化的藻毒素降解酶分别再根据应用实施例1的方法循环使用7次对藻毒素进行降解，其循环使用7次的藻毒素降解酶的活性分别见下表6所示。说明书CN104195129A1311/11页140121表601220123以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。0124另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。0125此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。说明书CN104195129A141/1页15图1说明书附图CN104195129A15。