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1、10申请公布号CN104072632A43申请公布日20141001CN104072632A21申请号201410337687822申请日20140715C08B37/0020060171申请人江苏阜丰生物科技有限公司地址211600江苏省淮安市金湖县神华大道188号72发明人徐玲徐国华王文风王英燕杨亚威秦建丽张芙蓉74专利代理机构南京天华专利代理有限责任公司32218代理人傅婷婷徐冬涛54发明名称一种高效提取深层液态发酵生产灰树花菌丝体多糖的方法57摘要本发明公开了一种高效提取深层液态发酵生产灰树花菌丝体多糖的方法，该方法是将灰树花发酵液分离的菌丝体通过超声波和复合酶解进行处理、分离得到灰树。
2、花多糖。本发明改变了传统的多糖“水提醇沉”的提取方式，提高了灰树花多糖的提取收率和产品品质，减少了生产中纯化水用量和能源消耗，增加了经济效益。51INTCL权利要求书1页说明书4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页10申请公布号CN104072632ACN104072632A1/1页21一种灰树花菌丝体多糖的提取方法，其特征在于该方法包括下述步骤1分离将灰树花发酵液经分离，得到灰树花上清液和湿菌丝体；2超声处理向步骤1所得的湿菌丝体中加入步骤1所得25倍质量的灰树花上清液进行稀释，搅拌均匀后进行超声处理1040MIN，得到超声处理液；3复合酶解将步骤2所得。
3、超声处理液调节PH值为47，控制温度3070，然后向其加入相当于干菌丝体重量023的纤维素酶、和023的蛋白酶，进行酶解14H，得到酶解液；4分离、浓缩将步骤3所得的酶解液进行分离，将分离所得到的上清液经低温浓缩，得到浓缩比重为125140的浓缩浆；5醇沉、烘干加入浓缩浆重量35倍量的95酒精，用酒精计检测混合液酒精度为6580V/V，静置26H，将沉淀物进行真空烘干；烘干至干燥物水分含量为38，即得菌丝体多糖提取物。2根据权利要求1所述的灰树花菌丝体多糖的提取方法，其特征在于所述的分离为离心分离，转速为15005000RPM。3根据权利要求1所述的灰树花菌丝体多糖的提取方法，其特征在于所述的。
4、纤维素酶的单位酶活为15000/G25000/G，所述的蛋白酶的单位酶活为47000/G53000/G。4根据权利要求1所述的灰树花菌丝体多糖的提取方法，其特征在于所述的低温浓缩过程均要求控制温度不高于75，真空度不低于0085MPA。5根据权利要求1所述的灰树花菌丝体多糖的提取方法，其特征在于所述的真空烘干的温度5075，真空度不低于0085MPA。权利要求书CN104072632A1/4页3一种高效提取深层液态发酵生产灰树花菌丝体多糖的方法技术领域0001本发明属于微生物技术领域，具体是一种高效提取深层液态发酵生产灰树花菌丝体多糖的方法。背景技术0002灰树花GRIFOLAFRONDOSA。
5、DICKSFRSFGRAY隶属担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、树花菌属，又名贝叶多孔菌、千佛菌、栗子菌、云蕈、莲花菌等，日本称之为舞茸，美国称之为林鸡。其肉质脆嫩，味如鸡丝，能烹调成多种美味佳肴，且含有多种生理活性物质，是一种极具开发和研究价值的食、药兼用蕈菌。0003灰树花多糖是灰树花众多生物活性物质中最主要的一类活性成分，它系从灰树花的子实体或菌丝体与发酵液中分离得到的一类富含1，6及1，3糖苷键的真菌多糖。研究表明，灰树花多糖具有非常广泛的生物学活性，在抗肿瘤、降血糖、抗肝炎、抗HIV艾滋病病毒以及改善免疫系统功能等方面均有很好的作用；并且在某些方面如抗肿瘤作用，灰树花多糖具有明。
6、显高于其它食药用真菌多糖的医疗效果，同时还具有用药方便如口服有效的优越性，为此，人们对灰树花多糖的研究兴趣愈来愈浓，不断有关于其生物活性及药理功能的动物实验和临床研究报道产生，众多科研工作者也都积极投入到其制备、结构分析、构效关系及生物活性等相关性质的研究中去，使灰树花多糖的相关性质研究已成为当前该领域的研究热点之一。0004我国从80年代初开始对其进行人工栽培驯化，90年代开始商品化生产，发展势头强劲。但是，灰树花子实体的人工栽培周期长、占地面积大、受自然气候条件的影响大、且暴露在环境中易被杂菌污染，大规模的人工栽培难以推广。而天然灰树花子实体产量有限，难以满足灰树花及其系列产品的市场需求，。
7、故目前已倾向于利用不受自然条件限制的、可大规模工业化生产的液态深层发酵技术来培养灰树花菌丝体。0005目前国内已有院校展开深层液态发酵生产灰树花的研究，都是以获得灰树花的菌丝体为主要目标展开研究的，而目前国内关于液态发酵生产灰树花的功效成分多糖的相关报道较少。目前关于真菌类原料多糖的提取工艺多为传统的水提醇沉法，即向干燥后的菌丝体加入820倍重量的水，控制温度80100浸泡24H，静止12H，然后反复浸提23次，然后合并上清液进行浓缩，再用5085的酒精进行醇沉，最终烘干即可得到粗多糖。此工艺的缺点是需加入大量水长时间进行浸提，并且为提高收率需反复浸提23次，操作周期较长、劳动强度偏大，并且多。
8、糖的提取收率多在23，产品成本比较昂贵。并且分离的上清液作为废液直接弃液排掉，增加了治污成本。发明内容0006本发明的目的是为了解决传统多糖的水提醇沉的技术瓶颈，采用此发明能够快速、高效生产出灰树花多糖。0007为了实现上述目的，本发明主要按照下述步骤进行说明书CN104072632A2/4页40008本发明的高效提取深层液态发酵生产灰树花菌丝体多糖的方法包括下述步骤00091分离将灰树花发酵液经分离，得到灰树花上清液和湿菌丝体；00102超声处理向步骤1所得的湿菌丝体中加入步骤1所得25倍质量的灰树花上清液进行稀释，搅拌均匀后进行超声处理1040MIN，得到超声处理液；上清液的添加主要是作为。
9、水溶性溶液来进行提取菌丝体中的多糖，添加量偏少，提取不完全，收率偏低，并且在超声过程中容易温度偏高，影响设备使用；若添加过多，后期处理需消耗大量的能源，成本偏高；00113复合酶解将步骤2所得超声处理液调节PH值为47，控制温度3070，然后向其加入相当于干菌丝体重量023的纤维素酶、和023的蛋白酶，进行酶解14H，得到酶解液；00124分离、浓缩将步骤3所得的酶解液进行分离，将分离所得到的上清液经低温浓缩，得到浓缩比重为12514050热测的浓缩浆；00135醇沉、烘干加入浓缩浆重量35倍量的95酒精，用酒精计检测混合液酒精度为6580V/V，静置26H，将沉淀物进行真空烘干；烘干至干燥物。
10、水分含量为38，即得菌丝体多糖提取物。0014其中，步骤1、4所述的分离为离心分离，采用三足离心机或高速离心机等离心设备进行，转速为15005000RPM。0015步骤2超声所用的设备为超声波细胞粉碎机，其他同等超声设备均可；超声的功率为0525KW。0016步骤3所述的纤维素酶的单位酶活为15000/G25000/G，所述的蛋白酶的单位酶活为47000/G53000/G。0017所述的低温浓缩过程均要求控制温度不高于75，真空度不低于0085MPA。0018所述的真空烘干的温度5075，真空度不低于0085MPA。0019本发明中醇沉次数越多，多糖的含量越高。真空烘干采用的真空干燥箱，本发明。
11、提取的多糖含量在3060。0020本发明具有以下几个突出的优点0021传统的工艺是至少用菌丝体干重的20倍的纯化水进行稀释，而本工艺采用上清液进行稀释，并且添加量只为菌丝体干重的25倍；具有以下优点1、本发明利用上清液替代纯化水进行稀释，减少了废液排放，减少了治污成本；2、因上清液中含部分胞外多糖，作为溶液稀释时，其中所含的多糖也可被回收利用。3、用上清液替代纯化水，节约了纯化水，降低生产成本。0022本发明提取路线简洁，节约了大量的能源消耗因减少了纯化水的加入量，相应的在后期的分离、浓缩等工序减少了大量的电、蒸汽能源的消耗。0023缩短了操作周期，减少了劳动强度本发明改变了传统的多次浸提，采。
12、用一次短时间处理，是传统处理时间的1/31/6，减轻了工人的劳动强度。0024提高了提取收率传统的水提多糖的提取收率在23，此发明用超声和酶解加剧了菌丝体胞内产物的溶出度，本发明提取多糖收率在47，比传统工艺提升了1倍多。0025提升了产品品质因本发明采用超声和复合酶解处理菌丝体，将部分菌丝体的蛋白降解成可溶性的小分子物质，减少了在醇沉过程中杂质蛋白的含量，提升了多糖的产品说明书CN104072632A3/4页5品种，采用本发明提取多糖含量多在40以上，比传统工艺提升了30以上。0026采用本发明可根据市场需求和产品标准，制得不同含量的高品质的多糖，多糖含量可在3060。具体实施方式0027以。
13、下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。本发明使用于普遍的灰树花菌，其来源不受实施例的限制，实施例中使用的菌种编号为CGMCCNO4179的灰树花菌种仅是为了举例说明本发明的技术方案。0028实施例10029本发明高效提取深层液态发酵生产灰树花菌丝体多糖的方法按下述步骤进行00301、灰树花发酵液的制备灰树花菌种购买于中科院微生物研究所其菌种编号为CGMCCNO4179。将活化好的灰树花摇瓶菌株按接种量10接种于种子培养基10L，其中种子培养基组成为葡萄糖18、蛋白胨05、黄豆饼粉1、磷酸二氢钾03、七水硫酸镁015、豆油00。
14、2，调节PH值55，通风比为103VVM，罐压003MPA，2628振荡培养7天即得灰树花种子液；将种子液按接种量15接入发酵培养基50L，其中发酵培养基组成为葡萄糖25、蛋白胨03、黄豆饼粉15、磷酸二氢钾02、七水硫酸镁02、豆油003，调节PH值55；通风比为105VVM，罐压003MPA，2628培养6天，发酵至发酵液有菌球大量增加，滤液浑浊；还原糖降至最低03并略有波动；镜检菌丝细碎，无杂菌污染，即得灰树花发酵液。其中上述培养基组成中的“”均表示G/100ML。00312、灰树花发酵液分离取上述灰树花发酵液10KG通过高速离心机2000RPM进行分离，得到灰树花上清液液935KG和0。
15、65KG的湿菌丝体含水量为80。00323、超声处理向步骤2所得的065KG湿菌丝体中加入235KG的灰树花上清液进行稀释，搅拌均匀后进行15KW超声处理20MIN，得到超声处理液3KG。00334、复合酶解将步骤3所得超声处理液调节PH值为55，在水浴控制温度45，然后向其缓慢加入纤维素酶21G购自枣庄杰诺生物酶有限公司，单位酶活20000/G，下同、蛋白酶19G购自枣庄杰诺生物酶有限公司，单位酶活50000/G，下同并不断搅拌，搅拌均匀后计时进行酶解2H，得到酶解液。00345、分离、浓缩将步骤4所得的酶解液用高速离心机4000RPM进行分离，将分离所得到的上清液25KG用旋转蒸发仪低温浓。
16、缩，浓缩过程均要求控制温度不高于75，真空度不低于0085MPA，得到浓缩比重为1350热测的浓缩浆65G。00356、醇沉、烘干向65G浓缩浆的中加入250ML的95酒精，用酒精计检测混合液酒精度72V/V，缓慢搅拌均匀后静置2H，将底部沉淀物分离用真空干燥箱进行烘干，温度60，真空度009MPA；烘干1H得灰树花菌丝体多糖提取物165G。检测水分含量为37，多糖含量为44，多糖提取收率为558。0036本发明中的多糖提取收率是按干菌粉计算的，即多糖提取收率灰树花菌丝体多糖提取物质量多糖含量/湿菌丝体质量1湿菌丝体含水量1000037实施例20038本发明高效提取深层液态发酵生产灰树花菌丝体。
17、多糖的方法按下述步骤进行说明书CN104072632A4/4页600391、灰树花发酵液的制备灰树花菌种购买于中科院微生物研究所其菌种编号为CGMCCNO4179。将活化好的灰树花摇瓶菌株按接种量14V/V接种于种子培养基20L，其中种子培养基组成为葡萄糖20、蛋白胨03、黄豆饼粉1、磷酸二氢钾03、七水硫酸镁015、豆油002，调节PH值55，通风比为103VVM，罐压003MPA，2628振荡培养7天即得灰树花种子液；将种子液按接种量18V/V接入发酵培养基100L，其中发酵培养基组成为葡萄糖25、蛋白胨05、黄豆饼粉15、磷酸二氢钾02、七水硫酸镁02、豆油003，调节PH值55；通风比。
18、为105VVM，罐压003MPA，2628培养5天，发酵至发酵液有菌球大量增加，滤液浑浊；还原糖降至最低03并略有波动；镜检菌丝细碎，无杂菌污染，即得灰树花发酵液。其中上述培养基组成中的“”均表示G/100ML。00402、灰树花发酵液分离取上述灰树花发酵液20KG通过高速离心机2000RPM进行分离，得到灰树花上清液液187KG和13KG的湿菌丝体含水量为78。00413、超声处理向步骤2所得的13KG湿菌丝体中加入37KG的灰树花上清液进行稀释，搅拌均匀后进行20KW0042超声处理30MIN，得到超声处理液5KG。00434、复合酶解将步骤3所得超声处理液调节PH值为50，在水浴控制温度。
19、55，然后向其缓慢加入纤维素酶45G购自枣庄杰诺生物酶有限公司，单位酶活20000/G，下同、蛋白酶42G购自枣庄杰诺生物酶有限公司，单位酶活50000/G，下同并不断搅拌，搅拌均匀后计时进行酶解2H，得到酶解液。00445、分离、浓缩将步骤4所得的酶解液用高速离心机4000RPM进行分离，将分离所得到的上清液38KG用旋转蒸发仪低温浓缩，浓缩过程均要求控制温度不高于75，真空度不低于0085MPA，得到浓缩比重为1450热测的浓缩浆120G。00456、醇沉、烘干向120G浓缩浆的中加入400ML的95酒精，用酒精计检测混合液酒精度73V/V，缓慢搅拌均匀后静置25H，将底部沉淀物分离用真空干燥箱进行烘干，温度60，真空度009MPA；烘干1H得灰树花菌丝体多糖提取物385G。检测水分含量为33，多糖含量为41，多糖提取收率为552。说明书CN104072632A。