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1、10申请公布号CN104195174A43申请公布日20141210CN104195174A21申请号201410375784622申请日20140801C12N15/861200601C12N15/65200601C12Q1/70200601A61B6/0020060171申请人广东药学院地址510006广东省广州市大学城外环东路280号72发明人张巨峰罗霞74专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司44102代理人陈卫54发明名称一种监测溶瘤性腺病毒体内复制情况和范围的方法57摘要本发明属于分子标记技术领域，具体公开了一种监测溶瘤性腺病毒体内复制情况和范围的方法。本发明将标记基因HSV1T。
2、K整合到溶瘤性腺病毒的基因组内，得到携带HSV1TK基因的溶瘤性腺病毒，将病毒感染治疗受体，可以利用对HSV1TK成像的方法来间接反映溶瘤性腺病毒的表达情况和体内分布情况，从而实现非侵入和实时的监测溶瘤性腺病毒在体内复制和分布范围。另外，标记基因HSV1TK本身也是治疗基因，与溶瘤性腺病毒在肿瘤基因治疗中能起到协同杀伤肿瘤作用。51INTCL权利要求书1页说明书4页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图2页10申请公布号CN104195174ACN104195174A1/1页21一种监测溶瘤性腺病毒体内复制情况和范围的方法，其特征在于，将标记基因H。
3、SV1TK整合到溶瘤性腺病毒的基因组内，得到携带HSV1TK基因的溶瘤性腺病毒；病毒感染治疗受体，利用对HSV1TK体内分子成像的方法来间接反映溶瘤性腺病毒在治疗受体内的复制情况和体内分布情况。2根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体内分子成像的方法为GAMMA相机成像或SPECT成像。3根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记基因HSV1TK以FIAU为标记底物，且FIAU的集聚水平与HSV1TK基因表达水平成正比。权利要求书CN104195174A1/4页3一种监测溶瘤性腺病毒体内复制情况和范围的方法技术领域0001本发明涉及分子标记技术领域，更具体地，涉及一种监测溶瘤性腺病毒。
4、体内复制情况和范围的方法。背景技术0002腺病毒因具有感染效率高、宿主范围广、容纳量大、非整合性等特点而成为基因转移中最具前景的基因载体之一，并且被广泛地改造成各种类型的溶瘤性腺病毒，应用于肿瘤基因治疗的研究之中。溶瘤性腺病毒是能特异性感染肿瘤细胞并在肿瘤细胞中大量复制最终裂解肿瘤细胞，释放出来以感染更多肿瘤细胞的一类病毒，同时这些病毒因无法在正常细胞内复制而对正常细胞副作用小。溶瘤性腺病毒所携带的治疗基因，在病毒复制的同时，治疗基因拷贝数也相应增加，这样就使病毒溶瘤效应和基因治疗作用结合起来，即“病毒基因治疗”，起到治疗的协同效应。“病毒基因治疗”要想成熟的运用于临床，还要考虑病毒使用的安全。
5、性和评价治疗的有效性，即如何监测溶瘤性腺病毒在体内复制和播散情况。0003目前常规是通过取活检用免疫组化方法来检测溶瘤性腺病毒在体内复制情况和复制范围，但这种方法存在着明显的缺点（1）对机体造成损伤，也不能进行重复连续观察。（2）不能方便实时获得病毒在体内的分布和复制的信息。0004HSV1TK是一个被广泛研究的基因。不仅可用来对多种肿瘤的基因治疗。同时HSV1TK也是应用于分子成像较为成熟的“标记基因”。HSV1TK酶的三个常用“标记底物”是IUDR、GCV和FIAU，放射性标记底物可用于非侵入的分子成像。FIAU做为一个潜在的“标记底物”，是因为它是典型的2氟代核苷类似物，放射性标记的碘（。
6、I）或碳（C）能掺入分子中，可用GAMMA相机和SPECT成像。已有的研究表明，FIAU经放射性标记后，分子成像的稳定性优于IUDR或GCV。基于此，以HSV1TK基因做为“标记基因”，FIAU做为“标记底物”来进行体内分子成像。发明内容0005本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种监测溶瘤性腺病毒体内复制情况和范围的方法。所述方法能够实现非侵入和实时监测溶瘤性腺病毒复制、播散、分布情况。0006为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的。0007一种监测溶瘤性腺病毒体内复制情况和范围的方法，包括如下步骤将标记基因HSV1TK整合到溶瘤性腺病毒的基因组内，得到携带HSV1TK基因的溶。
7、瘤性腺病毒，病毒感染治疗受体，利用对HSV1TK体内分子成像的方法来间接反映溶瘤性腺病毒在治疗受体内的复制情况和体内分布情况。0008优选地，所述体内分子成像的方法为GAMMA相机成像或SPECT成像。0009优选地，所述标记基因HSV1TK以FIAU为标记底物，且FIAU的集聚水平与HSV1TK基因表达水平成正比。说明书CN104195174A2/4页40010用溶瘤性腺病毒携带标记基因HSV1TK，当溶瘤性腺病毒在体内复制的时候，所携带标记基因拷贝数也相应增加。由于基因拷贝数的增加和病毒的复制情况是成正比的，通过对目的基因分子成像，就能间接监测病毒在活体器官或组织中的位置和剂量，来反映病毒。
8、复制和体内播散情况。0011与现有技术相比，本发明具有以下有益效果本发明将标记基因HSV1TK整合到溶瘤性腺病毒的基因组内，得到携带HSV1TK基因的溶瘤性腺病毒，病毒感染治疗受体，可以利用对HSV1TK成像的方法来间接反映溶瘤性腺病毒的复制情况和体内分布情况，从而实现非侵入和实时的监测溶瘤性腺病毒在体内复制和分布范围。另外，标记基因HSV1TK本身也是治疗基因，与溶瘤性腺病毒在肿瘤基因治疗中能起到协同杀伤肿瘤作用。附图说明0012图1在NCIH460TK细胞株中，检测HSV1TKMRNA表达、前药GCV敏感性和FIAU集聚水平三者间的关系；（A）HSV1TKMRNA表达与前药GCV敏感性关系。
9、；（B）HSV1TKMRNA表达与FIAU集聚水平的关系；（C）FIAU集聚水平与前药GCV的关系。0013图2GAMMA相机体内成像方法监测HSV1TK基因的表达，其中，图A中箭头所示为NCIH460TK所成肿瘤，对侧为野生型NCIH460所成肿瘤；图B为静脉注射214CFIAU24小时后GAMMA相机成像；图C为静脉注射214CFIAU36小时后GAMMA相机成像。0014图3标记基因HSV1TK表达情况和溶瘤性腺病毒复制情况成线性关系。具体实施方式0015下面结合说明书附图和具体实施例来详细解释本发明，下列实施例并不能用于限定本发明所保护的范围。其中关于重组载体的构建、病毒感染细胞或动物。
10、的方法均为本领域常规的方法，另外实施例中没有详细描述的分子生物学方法都参考本领域分子生物学的常规操作来执行。0016实施例1本发明监测方法建立的依据一、细胞水平研究FIAU的集聚水平与HSV1TK基因表达水平成正比。00171、制备稳定转染HSV1TK基因的NCIH460细胞株转染前24H接种NCIH460细胞到6孔板中，转染当天当细胞密度达到6080时，用PCDNA31TK（携带HSV1TK基因的真核表达载体）转染NCIH460，转染方法按照转染试剂LIPOFECTAMINE2000操作方法进行。转染48H后用G418抗生素进行筛选，以1014天细胞全部死亡的G418浓度为最佳筛选浓度。用含。
11、维持浓度G418培养基维持细胞生长，直至筛选克隆可见为止。分离克隆放大培养并获得一定细胞数量后，用RTPCR和WESTERN方法鉴定，鉴定成功的细胞即是稳定转染了HSVTK基因的NCIH460细胞系。00182、筛选出稳定转染HSV1TK基因的NCIH460细胞株，命名为NCIH460TK。然后，评价在NCIH460TK中是否FIAU集聚水平与HSV1TK基因表达水平成正比，评价过程为了评价在NCIH460TK中是否FIAU集聚水平与HSV1TK基因表达水平成正比，从两方面做了检测1NCIH460TK对前药GCV的敏感性；2NCIH460TK中HSV1TK的MRNA表达水平。结果如图1所示，F。
12、IAU的集聚水平与HSV1TK基因表达水平以及对前药GCV的敏感性具有说明书CN104195174A3/4页5高度的一致性。说明在体外实验中，用HSV1TK做为“标记基因”，放射性标记的FIAU做为“标记底物”，能成功的反映出细胞中所转染的HSV1TK基因表达水平。体外实验为HSV1TK做为“标记基因”和FIAU做为“标记底物”的体内分子成像可行性奠定了良好的基础。0019二、小鼠动物体内研究标记基因的体内表达情况。0020用GAMMA相机方法体内成像检测HSV1TK基因的表达将步骤一的NCIH460TK细胞株接种裸鼠一侧皮下成瘤，对侧用野生型NCIH460成瘤做为对照。待肿瘤生长到直径为32。
13、06CM时，静脉注射50CI214CFIAU，用GAMMA相机分别于24、36小时后进行成像，显示出裸鼠体内分布和代谢示踪剂（如图2）。结果表明，在静脉注射214CFIAU24小时和36小时后，用NCIH460TK所成肿瘤区域有高水平的214CFIAU来源的放射活性。而野生型NCIH460所成肿瘤和鼠的其它器官没有显示大量放射活性。0021实施例2一种监测溶瘤性腺病毒体内复制情况和范围的方法，具体包括如下步骤1、将标记基因HSV1TK整合到溶瘤性腺病毒基因组内，得到携带HSV1TK基因的重组溶瘤性腺病毒，具体方法如下（1）穿梭质粒PDC311（HTERTE1A）（CMVTK）载体构建构建携带端。
14、粒酶启动子（HTERT调控E1A基因表达框和CMV启动子调控HSV1TK基因表达框的腺病毒穿梭质粒PDC311（HTERTE1A）（CMVTK）。0022（2）AD（HTERTE1A）（CMVTK）病毒的包装和鉴定采用ADMAXTM腺病毒系统包装腺病毒，重组穿梭质粒PDC311（HTERTE1A）（CMVTK）和腺病毒骨架质粒PBHGLOXE13CRE用脂质体LIPOFECTAMINE2000共转染包装细胞293，于转染后第5天经胰酶消化，接种到10CM培养盘中，继续培养一周，即可观察到局部细胞形态出现变圆漂起，随之形成典型的彗星状病变。待病变进一步扩大，大部分细胞变圆漂起时，收集细胞及其培养。
15、液，反复冻融三次后，作为原始病毒保存于80。从中取出少量用病毒空斑法筛选三轮，获得预定的毒株，命名为AD（HTERTE1A）（CMVTK）。采用WESTERNBLOT方法检测重组腺病毒所携带的外源基因E1A和HSV1TK蛋白表达情况。鉴定正确的病毒就是携带HTERT调控的E1A表达框和CMV启动子调控TK基因表达框的重组溶瘤性腺病毒。病毒的复制特性由HTERT所调控，可以选择性的在HTERT活性高的肿瘤细胞中进行复制，而在HTERT活性低的正常细胞中不复制。病毒所携带的HSVTK，在病毒复制的同时，HSV1TK基因的拷贝数也相应的增加。00232研究溶瘤性腺病毒体内分布和表达情况在裸鼠两前上肢。
16、和一侧后下肢接种野生型肿瘤细胞，另一侧后下肢接种携带标记基因HSV1TK的溶瘤性腺病毒作为阳性对照。待肿瘤生长直径达到306CM时。从静脉给予214CFIAU。并于给予214CFIAU后的4、24、36和48小时用GAMMA相机或SPECT成像，优化成像时间。在上述时间点体内成像后杀死裸鼠，并迅速剥取肿瘤，用滴度测定方法检测溶瘤性腺病毒的表达量和范围，和GAMMA相机和SPECT成像进行比较。0024检测结果4、24、36和48小时用GAMMA相机或SPECT成像结果显示NCIH460TK所成肿瘤区域有高水平的214CFIAU来源的放射活性，随着时间点的延长，放射活性也增强。用滴度测定和免疫组化的方法反映体内腺病毒复制情况和范围，显示随着时间点的增加，病毒复制也增加，与214CFIAU来源的放射活性增加成正比。病毒分布的范围都可以说明书CN104195174A4/4页6检测到214CFIAU来源的放射活性，结果见图3。从图3结果可知，标记基因”HSV1TK表达情况和溶瘤性腺病毒复制情况成线性关系。说明书CN104195174A1/2页7图1图2说明书附图CN104195174A2/2页8图3说明书附图CN104195174A。