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1、10申请公布号CN104059947A43申请公布日20140924CN104059947A21申请号201410253792322申请日20140603C12P13/0020060171申请人重庆海巨农业发展有限公司地址408500重庆市武隆县巷口镇芙蓉中路42号81申请人重庆大学72发明人刘庆海万玉萍颜李秀冯琳周小华54发明名称一种制备高纯度萝卜硫素的方法57摘要一种制备高纯度萝卜硫素的方法，具体涉及从萝卜籽中提取萝卜硫素的方法。本发明以风干萝卜籽为原料，经破碎、脱脂、水解、树脂初分离、反渗透浓缩、制备分离及冷冻干燥，制备出纯度高达98以上的产品。本发明操作简便，设备简单，反应条件温和，节。
2、约能源，生产成本低，便于推广应用。对使用后的甲醇废液进行回收处理，还对使用后的树脂进行了再生处理，产生的杂质还能再利用，因而生产安全、绿色无污染，是节能减排的生产方法。采用本发明方法制备出的萝卜硫素产品，可广泛应用于医药、保健品等行业中。51INTCL权利要求书3页说明书9页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书9页10申请公布号CN104059947ACN104059947A1/3页21一种制备高纯度萝卜硫素的方法，其特征在于具体方法步骤如下1制备脱脂萝卜籽粉取水分含量低于4的风干萝卜籽，先用破碎机破碎，再用2060目的不锈钢筛网进行筛分，分别收集过筛者和未过筛。
3、者，对于未过筛的萝卜籽粉，返回破碎机进行再次破碎，对于过筛的萝卜籽粉，置于超临界二氧化碳的萃取器的萃取釜中，在温度为3035、压力2530MPA的条件下进行萃取1H2H，然后将荷载萝卜籽油脂的超临界二氧化碳泵至分离釜中，降低压力至35MPA，使超临界二氧化碳气化，与萝卜籽油脂分离，分别收集气化的二氧化碳、脱二氧化碳萝卜籽油脂粗品和脱脂萝卜籽粉，对收集的气化二氧化碳，再次冷冻至05并再次加压至2530MPA；2制备硫代葡萄糖苷提取液第1步完成后，将第1步收集的部分脱脂萝卜籽粉，分散于甲醇中，在7075的温度下进行第一次提取4060MIN，脱脂萝卜籽粉质量与甲醇体积之比为1G69ML，第一次提取完。
4、成后进行抽滤，分别收集第一次滤过液和滤渣，对于收集的第一次滤渣，投入到甲醇中进行第二次提取，提取条件与第一次相同，第二次提取完成后进行抽滤，分别收集第二次滤过液和滤渣，对于收集的第二次滤渣，送入脱溶剂釜中，进行脱甲醇处理，对于收集的第二次提取液，与收集的第一次提取液合并后进行真空浓缩，直至浓缩液成膏状时止，所用浓缩真空度为006009MPA、温度为4045，浓缩完成后，分别收集膏状浓缩物和甲醇，对于收集的甲醇，返回甲醇贮罐，用于再次提取硫代葡萄糖苷，对于收集的膏状浓缩物，用蒸馏水溶解，膏状浓缩物质量与蒸馏水体积之比为1G36ML，溶解完成后，将溶解液置于萃取釜中，加入乙酸乙酯进行萃取处理102。
5、0MIN，溶解液与乙酸乙酯体积之比为1ML16ML，萃取完成后，分别收集萃取相和萃余相，对收集的萃取相，进行精馏回收乙酸乙酯；3制备萝卜硫素粗提液第2步完成后，先将第1步收集的另一部分脱脂萝卜籽粉分散于PH5060的柠檬酸柠檬酸三钠缓冲溶液中，搅拌均匀，脱脂萝卜籽粉质量与PH5060的柠檬酸柠檬酸三钠缓冲溶液体积之比为1G612ML，再加入第2步收集的硫代葡萄糖苷提取液，加入的硫代葡萄糖苷提取液体积与脱脂萝卜籽粉质量之比为1ML1020G，混合均匀后就获得制备萝卜硫素粗提液酶水解体系，然后在2535、40120R/MIN的搅拌速度下避光水解510H，水解完成后，进行过滤，分别收集滤过液和滤渣，。
6、对收集的滤渣，分散于温度为2535的蒸馏水中，蒸馏水体积与滤渣质量之比为1020ML1G，在40120R/MIN的搅拌速度下避光洗涤2030MIN，接着进行过滤，分别收集洗涤滤过液和滤渣，对收集的洗涤液，与收集的水解滤过液合并，用稀盐酸调节PH至24后离心，离心机转速为1000016000R/MIN，分别收集离心清液和离心沉淀，对收集的离心清液，泵入脱气罐中，在真空度为006009MPA、温度为1035的条件下，保持2040MIN，脱去液体中的氧气，然后充入0103MPA的高纯度氮气，保持2040MIN，即制备出萝卜硫素粗提液；4制备脱氧充氮甲醇水洗脱液分别配制甲醇体积浓度为515、6080的。
7、甲醇水溶液，再分别移入脱气罐中，在真空度为006009MPA、温度为1035的条件下，保持2040MIN，脱去其中的氧权利要求书CN104059947A2/3页3气，然后充入0103MPA的高纯度氮气，保持2040MIN，即制备出脱氧充氮甲醇水洗脱液；5制备萝卜硫素初步纯化浓缩液第3步完成之后，将第3步制备出的萝卜硫素粗提液泵入活化SP850或聚酰胺吸附树脂柱，吸附其中的萝卜硫素，萝卜硫素粗提液体积与SP850或聚酰胺吸附树脂的体积比为1ML1530ML，以流速为510BV/H通过SP850或聚酰胺吸附树脂柱，吸附完成后收集荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱和脱附萝卜硫素的过柱溶液，对。
8、于收集的脱附萝卜硫素的过柱溶液，进行生化处理，达标后排放，对于收集的荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，先用2BV、甲醇体积浓度为515的脱氧充氮甲醇水洗脱液、以36BV/H的流速洗涤夹杂于树脂间的杂质，分别收集甲醇洗涤液和洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，对收集的甲醇洗涤液，减压蒸馏回收甲醇后进行生化处理，达标后排放，对收集的洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，泵入甲醇积浓度为6080的脱氧充氮甲醇水洗脱液以36BV/H的流速洗脱被吸附的萝卜硫素，直至甲醇体积浓度为6080的脱氧充氮甲醇水洗脱液的耗量达到SP850或聚酰胺吸附树脂柱体。
9、积的510BV时止，分别收集荷载萝卜硫素的洗脱液和脱附萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，对于收集的脱附萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，进行再生处理，对于收集的荷载萝卜硫素的甲醇洗脱液，泵入反渗透器中，在压力低于04MPA下进行反渗透浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素的质量浓度达到2030时为止，分别收集反渗透截留液和滤过液，对于收集的反渗透截留液，泵入真空浓缩机中，在真空度为006009MPA、温度为3045的条件下，进行真空浓缩，直至浓缩液无甲醇味时为止，就制备出萝卜硫素初步纯化浓缩液，对于收集的反渗透滤过液，进行减压蒸馏回收甲醇后进行生化处理，达标后排放；6制备高纯度萝卜硫素冻干物第。
10、5步完成后，先将第5步制备的萝卜硫素初步纯化浓缩液通过022UM微孔过滤膜过滤，再泵入以反相C18硅胶为填料的制备型液相色谱柱中，萝卜硫素初步纯化浓缩液体积与C18硅胶填料质量之比为1ML5080G，接着控制色谱条件进行制备分离萝卜硫素，具体的色谱条件为检测波长为245NM，柱温为25，流速为10MLMIN1；A组分为甲醇，B组分为超纯水，梯度洗脱程序为在0MIN15MIN区间，流动相中的A组分由5上升至25，B组分由95下降至75，在15MIN75MIN区间，流动相中的A组分由25上升至65，B组分由75下降至35，收集3741MIN区间的洗脱液，在3545下进行真空浓缩，直至浓缩液中萝卜硫。
11、素质量浓度达到3050时，就制备出萝卜硫素浓缩液，将该萝卜硫素浓缩液置于冻干机中，在2545PA真空度、5060温度下，进行冷冻干燥2436H，就制备出纯度为98以上的萝卜硫素，经核磁共振、液质联机和旋光仪分析鉴定，所制备出的萝卜硫素的化学结构为1异硫氰酸4甲磺酰基2烯丁烷；7制备再生树脂柱向第5步收集的脱附了萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱泵入34BV的无水甲醇，以25BV/H的流速洗脱树脂吸附的杂质，分别收集洗脱液和脱附杂质的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，对收集的甲醇洗脱液，减压蒸馏回收甲醇后分别收集甲醇和浓缩液，对于收集的甲醇进行脱水处理，制备出无水甲醇，对于收集的洗脱杂质的SP8。
12、50或聚酰胺吸附权利要求书CN104059947A3/3页4树脂柱，用12BV的蒸馏水以25BV/H的流速洗涤，分别收集经该蒸馏水洗涤的SP850或聚酰胺吸附树脂柱和洗涤液，对收集的蒸馏水洗涤后的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，即为再生树脂柱，可再次用于纯化萝卜硫素粗提液，对于收集的洗涤液，可用于配制脱氧充氮甲醇水洗脱液。权利要求书CN104059947A1/9页5一种制备高纯度萝卜硫素的方法一、技术领域0001本发明属于萝卜硫素分离制备的技术领域，具体涉及从萝卜籽中提取萝卜硫素的方法。二、背景技术0002硫代葡萄糖苷是十字花科蔬菜中的一种芥子苷，在硫代葡萄糖苷酶或酸的催化下，芥子苷水解，生成萝。
13、卜硫素等异硫氰酸酯和葡萄糖。科学研究发现，萝卜硫素的化学名为1异硫氰酸4甲磺酰基丁烷或1异硫氰酸4甲磺酰基2烯丁烷，是迄今为止蔬菜中发现的最强抗癌成分之一，它可诱导机体产生II型解毒酶，该酶能防止致癌物质破坏健康细胞内的遗传因子，所以，从十字花科蔬菜中分离纯化1异硫氰酸4甲磺酰基丁烷或1异硫氰酸4甲磺酰基2烯丁烷具有重要的科学价值和广阔的市场前景。0003目前，从十字花科蔬菜中提取萝卜硫素的方法有申请号为2009100981976、名称为“一种萝卜硫素的提取方法”的发明专利，该专利公开的方法是用干燥西兰花种子或新鲜西兰花球为原料，粉碎加入水，调节PH4145，加入粗芥子硫苷酸酶水解后冷冻干燥成。
14、粉末；加入丙酮，浸提，过滤，将滤液真空浓缩成萝卜硫素粗品；然后将其通过硅胶柱层析，用乙酸乙酯和乙醇的混合液梯度洗脱，收集馏分，真空浓缩；用甲醇溶解，再经02UM微孔滤膜过滤后，用C18硅胶装柱，采用甲醇水梯度洗脱，收集萝卜硫素馏分，真空干燥，得到萝卜硫素。该方法存在的主要问题是1未对种子进行脱脂，由于油脂的阻挡，西兰花种子中的芥子苷和芥子硫苷酸酶难以有效接触，导致萝卜硫素的生成率低；2未对提取的芥子硫苷酸酶进行固定化，游离酶的半衰期短，易失活；3使用的有机溶剂丙酮致酶蛋白变性能力强，导致芥子硫苷酸酶大量变性而失活。因此，该方法导致原料利用率低、萝卜硫素生成率低，丙酮回收率低而污染环境，生产成本。
15、高，缺乏竞争力。食品工业科技2012年第33卷第4期8082页刊登的论文“高效液相色谱法测定西兰花中萝卜硫素的研究”，该论文公开的提取萝卜硫素的方法是西兰花种子在无光照条件下发芽48H，冷冻干燥成粉末，加入正己烷脱脂并挥发脱除溶剂后，在加入去离子水混合均匀，水浴处理2H，再加入氯化钠并用等体积乙酸乙酯萃取3次，收集、合并萃取液，用旋蒸器减压蒸馏，除去乙酸乙酯，直至残留液呈黄油状液体时止。接着用10的乙腈溶解残留液，然后用045UM的微孔滤膜过滤，最后用旋蒸器减压蒸馏，除去滤过液中的乙腈和水，获得萝卜硫素。该方法存在的主要问题是1水解时未调节到硫代葡萄糖苷酶所需的最佳PH值，导致硫代葡萄糖苷酶的。
16、活力低，萝卜硫素产率低；2使用有机溶剂乙酸乙酯和乙腈，两种溶剂均易挥发，异味重，有毒性，空气污染严重；因此，该方法生产的萝卜硫素成本也高，同样缺乏竞争力。三、发明内容0004本发明的目的是针对现有制备萝卜硫素的方法的不足之处，提供一种制备高纯度萝卜硫素的新方法，该方法具有充分利用资源，萝卜硫素生成率高、操作简单、溶剂可反复回收利用、产品纯度高达98以上，绿色无污染等特点。说明书CN104059947A2/9页60005本发明的原理是萝卜籽油脂含量高达45，超临界CO2在适当条件下具有与油脂类似的密度，依据相似相溶原理，可溶解萝卜籽中的油脂，因此用超临界CO2可提取萝卜籽中的油脂，获得脱脂萝卜籽。
17、；萝卜籽中含有硫代葡萄糖苷及硫代葡萄糖苷酶，它们在细胞中处于分隔状态，当细胞被破坏时，硫代葡萄糖苷酶和硫代葡萄糖苷接触，即催化硫代葡萄糖苷水解生成萝卜硫素等异硫氰酸酯和葡萄糖；酶被底物饱和方能发挥最大催化效率，向脱脂萝卜籽水解体系中加入硫代葡萄糖苷，使游离硫代葡萄糖苷酶被饱和而发挥最大催化效率，显著增加萝卜硫素的生成量；1异硫氰酸4甲磺酰基2烯丁烷的烯键既可加氢还原成1异硫氰酸4甲磺酰基丁烷，也可氧化甚至断键，且前者的生物学活性比后者强12倍，因此获得前者比后者更具价值。将脱脂萝卜籽水解体系进行真空脱气并充入氮气，可显著降低其中的氧气，将显著降低1异硫氰酸4甲磺酰基2烯丁烷的氧化；1异硫氰酸4。
18、甲磺酰基2烯丁烷的2烯基丁烷基为非极性，可与非极性树脂形成疏水相互作用，可用非极性吸附树脂对其进行吸附，将其与极性杂质分离；除去极性杂质的1异硫氰酸4甲磺酰基2烯丁烷经反渗透浓缩，除去甲醇后再进入制备型液相色谱，由于该物质的结构与其它非极性杂质的差异，它们在反相C18硅胶上的吸附力不同，因此可用适当的洗脱液进行洗脱，由于制备型液相色谱的塔板数极高，分离效率高，因此可将其它杂质一一分离，制备出高纯度的萝卜硫素，即1异硫氰酸4甲磺酰基2烯丁烷；将制备出的高纯度1异硫氰酸4甲磺酰基2烯丁烷进行反渗透浓缩，除去其中的甲醇和部分水，即可获得浓缩液，最后将该浓缩液进行冷冻干燥，除去水分，就制备出纯度高达9。
19、8以上的萝卜硫素，即1异硫氰酸4甲磺酰基2烯丁烷。0006本发明的目的是这样实现的一种制备高纯度萝卜硫素的方法，以风干萝卜籽为原料，经破碎、脱脂、水解、树脂初分离、反渗透浓缩、制备分离及冷冻干燥，制备出纯度高达98以上的萝卜硫素，即1异硫氰酸4甲磺酰基2烯丁烷。其具体的工艺步骤如下00071制备脱脂萝卜籽粉0008取水分含量低于4的风干萝卜籽，先用破碎机破碎，再用2060目的不锈钢筛网进行筛分，分别收集过筛者和未过筛者。对于未过筛的萝卜籽粉，返回破碎机进行再次破碎；对于过筛的萝卜籽粉，置于超临界二氧化碳的萃取器的萃取釜中，在温度为3035、压力2530MPA的条件下进行萃取1H2H，然后将荷载。
20、萝卜籽油脂的超临界二氧化碳泵至分离釜中，降低压力至35MPA，使超临界二氧化碳气化，与萝卜籽油脂分离。分别收集气化的二氧化碳、脱二氧化碳萝卜籽油脂粗品和脱脂萝卜籽粉，对收集的气化二氧化碳，再次冷冻至05并再次加压至2530MPA，可再次用于提取萝卜籽油脂；对于收集的脱二氧化碳萝卜籽油脂粗品，用于制备精制萝卜籽油；对于收集的脱脂萝卜籽粉，分成两部分，一部分用于制备硫代葡萄糖苷提取液，另一部分用于制备萝卜硫素粗提液。00092制备硫代葡萄糖苷提取液0010第1步完成后，将第1步收集的部分脱脂萝卜籽粉，分散于甲醇中，在7075的温度下进行第一次提取4060MIN，脱脂萝卜籽粉质量G与甲醇体积ML之比。
21、为169。第一次提取完成后进行抽滤，分别收集第一次滤过液和滤渣。对于收集的第一次滤渣，投入到甲醇中进行第二次提取，提取条件与第一次相同。第二次提取完成后进行抽说明书CN104059947A3/9页7滤，分别收集第二次滤过液和滤渣。对于收集的第二次滤渣，送入脱溶剂釜中，进行脱甲醇处理后可用作家畜饲料添加剂；对于收集的第二次提取液，与收集的第一次提取液合并后进行真空浓缩，直至浓缩液成膏状时止，所用浓缩真空度为006009MPA、温度为4045。浓缩完成后，分别收集膏状浓缩物和甲醇，对于收集的甲醇，返回甲醇贮罐，用于再次提取硫代葡萄糖苷；对于收集的膏状浓缩物，用蒸馏水溶解，膏状浓缩物质量G与蒸馏水体。
22、积ML之比为136。溶解完成后，将溶解液置于萃取釜中，加入乙酸乙酯进行萃取处理1020MIN，溶解液与乙酸乙酯体积之比为1ML16ML。萃取完成后，分别收集萃取相和萃余相，对收集的萃取相，进行精馏回收乙酸乙酯；对收集的萃余相，即为硫代葡萄糖苷提取液，用于制备萝卜硫素提取液。00113制备萝卜硫素粗提液0012第2步完成后，先将第1步收集的另一部分脱脂萝卜籽粉分散于PH5060的柠檬酸柠檬酸三钠缓冲溶液中，搅拌均匀，脱脂萝卜籽粉质量G与PH5060的柠檬酸柠檬酸三钠缓冲溶液体积ML之比为1612，再加入第2步收集的硫代葡萄糖苷提取液，加入的硫代葡萄糖苷提取液体积ML与脱脂萝卜籽粉质量G之比为11。
23、020，混合均匀后就获得制备萝卜硫素粗提液酶水解体系。然后在2535、40120R/MIN的搅拌速度下避光水解510H。水解完成后，进行过滤，分别收集滤过液和滤渣。对收集的滤渣，分散于温度为2535的蒸馏水中，蒸馏水体积ML与滤渣质量G之比为10201，在40120R/MIN的搅拌速度下避光洗涤2030MIN，接着进行过滤，分别收集洗涤滤过液和滤渣。对收集的洗涤滤渣，干燥后用做家畜饲料添加剂；对收集的洗涤液，与收集的水解滤过液合并，用稀盐酸调节PH至24后离心，离心机转速为1000016000R/MIN。分别收集离心清液和离心沉淀，对收集的离心沉淀，干燥后做饲料添加剂；对收集的离心清液，泵入脱。
24、气罐中，在真空度为006009MPA、温度为1035的条件下，保持2040MIN，脱去液体中的氧气。然后充入0103MPA的高纯度氮气，保持2040MIN，即制备出萝卜硫素粗提液，用于制备初步纯化萝卜硫素浓缩液。00134制备脱氧充氮甲醇水洗脱液0014分别配制甲醇体积浓度为515、6080的甲醇水溶液，再分别移入脱气罐中，在真空度为006009MPA、温度为1035的条件下，保持2040MIN，脱去其中的氧气。然后充入0103MPA的高纯度氮气，保持2040MIN，即制备出脱氧充氮甲醇水洗脱液，用于制备萝卜硫素初步纯化浓缩液。00155制备萝卜硫素初步纯化浓缩液0016第3步完成之后，将第3。
25、步制备出的萝卜硫素粗提液泵入活化SP850或聚酰胺吸附树脂柱，吸附其中的萝卜硫素，萝卜硫素粗提液体积ML与SP850或聚酰胺吸附树脂的体积ML比为11530，以流速为510BV/H通过SP850或聚酰胺吸附树脂柱。吸附完成后收集荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱和脱附萝卜硫素的过柱溶液，对于收集的脱附萝卜硫素的过柱溶液，进行生化处理，达标后排放；对于收集的荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，先用2BV、甲醇体积浓度为515的脱氧充氮甲醇水洗脱液、以36BV/H的流速洗涤夹杂于树脂间的杂质，分别收集甲醇洗涤液和洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，对收集的甲。
26、醇洗涤液，减压蒸馏回收甲醇后进行生化处理，达标后排放；回收的甲醇可用于再次配制甲醇积浓度为515或60说明书CN104059947A4/9页880的脱氧充氮甲醇水洗脱液。对收集的洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，泵入甲醇积浓度为6080的脱氧充氮甲醇水洗脱液以36BV/H的流速洗脱被吸附的萝卜硫素，直至甲醇体积浓度为6080的脱氧充氮甲醇水洗脱液的耗量达到SP850或聚酰胺吸附树脂柱体积ML的510BV时止。分别收集荷载萝卜硫素的洗脱液和脱附萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，对于收集的脱附萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，进行再生处理；对于收集的荷载萝卜硫。
27、素的甲醇洗脱液，泵入反渗透器中，在压力低于04MPA下进行反渗透浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素的质量浓度达到2030时为止。分别收集反渗透截留液和滤过液，对于收集的反渗透截留液，泵入真空浓缩机中，在真空度为006009MPA、温度为3045的条件下，进行真空浓缩，直至浓缩液无甲醇味时为止，就制备出萝卜硫素初步纯化浓缩液，用于制备高纯度萝卜硫素冻干物。对于收集的反渗透滤过液，进行减压蒸馏回收甲醇后进行生化处理，达标后排放；对于回收的甲醇，可用于再次配制甲醇体积浓度为515或6080的脱氧充氮甲醇水洗脱液。00176制备高纯度萝卜硫素冻干物0018第5步完成后，先将第5步制备的萝卜硫素初步纯化浓缩液通。
28、过022UM微孔过滤膜过滤，再泵入以反相C18硅胶为填料的制备型液相色谱柱中，萝卜硫素初步纯化浓缩液体积ML与C18硅胶填料质量G之比为15080。接着控制色谱条件进行制备分离萝卜硫素，具体的色谱条件为检测波长为245NM，柱温为25，流速为10MLMIN1；A组分为甲醇，B组分为超纯水；梯度洗脱程序为在0MIN15MIN区间，流动相中的A组分由5上升至25，B组分由95下降至75；在15MIN75MIN区间，流动相中的A组分由25上升至65，B组分由75下降至35。收集3741MIN区间的洗脱液，在3545下进行真空浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素质量浓度达到3050时，就制备出萝卜硫素浓缩液。将。
29、该萝卜硫素浓缩液置于冻干机中，在2545PA真空度、5060温度下，进行冷冻干燥2436H，就制备出纯度为98以上的萝卜硫素。经核磁共振、液质联机和旋光仪分析鉴定，所制备出的萝卜硫素的化学结构为1异硫氰酸4甲磺酰基2烯丁烷。00197制备再生树脂柱0020向第5步收集的脱附萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱泵入34BV的无水甲醇，以25BV/H的流速洗脱树脂吸附的杂质，分别收集洗脱液和脱附杂质的SP850或聚酰胺吸附树脂柱。对收集的甲醇洗脱液，含有异硫氰酸酯类物质，减压蒸馏回收甲醇后分别收集甲醇和浓缩液，对于收集的甲醇，进行脱水处理，制备出无水甲醇，可再次用于洗脱脱附萝卜硫素的SP850或。
30、聚酰胺吸附树脂柱，制备再生树脂；对于收集的浓缩液，用于配制异硫氰酸酯类生物农药。对于收集的洗脱杂质的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，用12BV的蒸馏水以25BV/H的流速洗涤，分别收集经该蒸馏水洗涤的SP850或聚酰胺吸附树脂柱和洗涤液，对收集的蒸馏水洗涤的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，即为再生树脂柱，可再次用于纯化萝卜硫素粗提液；对于收集的洗涤液，可用于配制脱氧充氮甲醇水洗脱液。0021本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果00221本发明方法在生产过程中使用破碎、脱脂、水解、树脂初分离、反渗透浓缩、制备分离及冷冻干燥等简单工艺，操作简便，设备简单，反应条件温和，节约能源，生产成本低，便于推。
31、广应用。说明书CN104059947A5/9页900232本发明方法在生产过程中，先对萝卜籽粉进行超临界二氧化碳脱脂后再水解，硫代葡萄糖苷和硫代葡萄糖苷酶可以得到充分而有效的接触，从而产物的生成率大大提高，而且在水解时加入了底物硫代葡萄糖苷，采用脱氧充氮甲醇水作洗脱液，进一步提高了产物的生成率。00243本发明方法在生产过程中，通过树脂进行初分离、反渗透浓缩、液相制备及真空浓缩的纯化步骤，其中由于制备型液相色谱的塔板数极高，每米的塔板数在20000以上，分离效率高，因此制备出的产物纯度极高，达98以上。00254本发明在生产过程中，使用超临界二氧化碳对萝卜籽粉末脱脂，对使用后的甲醇废液进行回收。
32、处理，还对使用后的树脂进行了再生处理，这使得生产过程安全、绿色无污染。0026本发明方法是节能减排、安全生产且成本低，便于推广应用的理想的方法。采用本发明方法制备出的萝卜硫素，即1异硫氰酸4甲磺酰基2烯丁烷产品，可广泛应用于医药、保健品行业中，有防癌抗癌等功能。四、具体实施方式0027下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。0028实施例10029一种制备高纯度萝卜硫素的方法，具体方法步骤如下00301制备脱脂萝卜籽粉0031取水分含量低于4的风干萝卜籽，先用破碎机破碎，再用20目的不锈钢筛网进行筛分，分别收集过筛者和未过筛者。对于未过筛的萝卜籽粉，返回破碎机进行再次破碎；对于过筛的萝卜籽粉，。
33、置于超临界二氧化碳的萃取器的萃取釜中，在温度为30、压力25MPA的条件下进行萃取1H，然后将荷载萝卜籽油脂的超临界二氧化碳泵至分离釜中，降低压力至3MPA，使超临界二氧化碳气化，与萝卜籽油脂分离。分别收集气化的二氧化碳、脱二氧化碳萝卜籽油脂粗品和脱脂萝卜籽粉，对收集的气化二氧化碳，再次冷冻至0并再次加压至25MPA，可再次用于提取萝卜籽油脂；对于收集的脱二氧化碳萝卜籽油脂粗品，用于制备精制萝卜籽油；对于收集的脱脂萝卜籽粉，分成两部分，一部分用于制备硫代葡萄糖苷提取液，另一部分用于制备萝卜硫素粗提液。00322制备硫代葡萄糖苷提取液0033第1步完成后，将第1步收集的部分脱脂萝卜籽粉，分散于甲。
34、醇中，在70的温度下进行第一次提取40MIN，脱脂萝卜籽粉质量G与甲醇体积ML之比为16。第一次提取完成后进行抽滤，分别收集第一次滤过液和滤渣。对于收集的第一次滤渣，投入到甲醇中进行第二次提取，提取条件与第一次相同。第二次提取完成后进行抽滤，分别收集第二次滤过液和滤渣。对于收集的第二次滤渣，送入脱溶剂釜中，进行脱甲醇处理后可用作家畜饲料添加剂；对于收集的第二次提取液，与收集的第一次提取液合并后进行真空浓缩，直至浓缩液成膏状时止，所用浓缩真空度为006MPA、温度为40。浓缩完成后，分别收集膏状浓缩物和甲醇，对于收集的甲醇，返回甲醇贮罐，用于再次提取硫代葡萄糖苷；对于收集的膏状浓缩物，用蒸馏水溶。
35、解，膏状浓缩物质量G与蒸馏水体积ML之比为13。溶解完成后，将溶解液置于萃取釜中，加入乙酸乙酯进行萃取处理10MIN，溶解液与乙酸乙酯体积之说明书CN104059947A6/9页10比为1ML1ML。萃取完成后，分别收集萃取相和萃余相，对收集的萃取相，进行精馏回收乙酸乙酯；对收集的萃余相，即为硫代葡萄糖苷提取液，用于制备萝卜硫素提取液。00343制备萝卜硫素粗提液0035第2步完成后，先将第1步收集的另一部分脱脂萝卜籽粉分散于PH50的柠檬酸柠檬酸三钠缓冲溶液中，搅拌均匀，脱脂萝卜籽粉质量G与PH5060的柠檬酸柠檬酸三钠缓冲溶液体积ML之比为16，再加入第2步收集的硫代葡萄糖苷提取液，加入的。
36、硫代葡萄糖苷提取液体积ML与脱脂萝卜籽粉质量G之比为110，混合均匀后就获得制备萝卜硫素粗提液酶水解体系。然后在25、40R/MIN的搅拌速度下避光水解10H。水解完成后，进行过滤，分别收集滤过液和滤渣。对收集的滤渣，分散于温度为25的蒸馏水中，蒸馏水体积ML与滤渣质量G之比为101，在40R/MIN的搅拌速度下避光洗涤30MIN，接着进行过滤，分别收集洗涤滤过液和滤渣。对收集的洗涤滤渣，干燥后用做家畜饲料添加剂；对收集的洗涤液，与收集的水解滤过液合并，用稀盐酸调节PH至2后离心，离心机转速为10000R/MIN。分别收集离心清液和离心沉淀，对收集的离心沉淀，干燥后做饲料添加剂；对收集的离心清。
37、液，泵入脱气罐中，在真空度为006MPA、温度为10的条件下，保持20MIN，脱去液体中的氧气。然后充入012MPA的高纯度氮气，保持20MIN，即制备出萝卜硫素粗提液，用于制备初步纯化萝卜硫素浓缩液。00364制备脱氧充氮甲醇水洗脱液0037分别配制甲醇体积浓度为5、60的甲醇水溶液，再分别移入脱气罐中，在真空度为006MPA、温度为10的条件下，保持20MIN，脱去其中的氧气。然后充入012MPA的高纯度氮气，保持20MIN，即制备出脱氧充氮甲醇水洗脱液，用于制备萝卜硫素初步纯化浓缩液。00385制备萝卜硫素初步纯化浓缩液0039第3步完成之后，将第3步制备出的萝卜硫素粗提液泵入活化SP8。
38、50吸附树脂柱，吸附其中的萝卜硫素，萝卜硫素粗提液体积ML与SP850吸附树脂的体积ML比为115，以流速为5BV/H通过SP850吸附树脂柱。吸附完成后收集荷载萝卜硫素的SP850吸附树脂柱和脱附萝卜硫素的过柱溶液，对于收集的脱附萝卜硫素的过柱溶液，进行生化处理，达标后排放；对于收集的荷载萝卜硫素的SP850吸附树脂柱，先用2BV、甲醇体积浓度为5的脱氧充氮甲醇水洗脱液、以3BV/H的流速洗涤夹杂于树脂间的杂质，分别收集甲醇洗涤液和洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的SP850吸附树脂柱，对收集的甲醇洗涤液，减压蒸馏回收甲醇后进行生化处理，达标后排放；回收的甲醇可用于再次配制甲醇积浓度为5或60的。
39、脱氧充氮甲醇水洗脱液。对收集的洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的SP850吸附树脂柱，泵入甲醇积浓度为60的脱氧充氮甲醇水洗脱液以3BV/H的流速洗脱被吸附的萝卜硫素，直至甲醇体积浓度为60的脱氧充氮甲醇水洗脱液的耗量达到SP850吸附树脂柱体积ML的5BV时止。分别收集荷载萝卜硫素的洗脱液和脱附萝卜硫素的SP850吸附树脂柱，对于收集的脱附萝卜硫素的SP850吸附树脂柱，进行再生处理；对于收集的荷载萝卜硫素的甲醇洗脱液，泵入反渗透器中，在压力低于04MPA下进行反渗透浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素的质量浓度达到20时为止。分别收集反渗透截留液和滤过液，对于收集的反渗透截留液，泵入真空浓缩机中，在真空。
40、度为006MPA、温度为30的条件下，进行真空浓缩，直至浓缩液无甲醇味时为止，就制备出萝卜硫素初步纯化浓缩液，用说明书CN104059947A107/9页11于制备高纯度萝卜硫素冻干物。对于收集的反渗透滤过液，进行减压蒸馏回收甲醇后进行生化处理，达标后排放；对于回收的甲醇，可用于再次配制甲醇体积浓度为5或60的脱氧充氮甲醇水洗脱液。00406制备高纯度萝卜硫素冻干物0041第5步完成后，先将第5步制备的萝卜硫素初步纯化浓缩液通过022UM微孔过滤膜过滤，再泵入以反相C18硅胶为填料的制备型液相色谱柱中，萝卜硫素初步纯化浓缩液体积ML与C18硅胶填料质量G之比为150。接着控制色谱条件进行制备分。
41、离萝卜硫素，具体的色谱条件为检测波长为245NM，柱温为25，流速为10MLMIN1；A组分为甲醇，B组分为超纯水；梯度洗脱程序为在0MIN15MIN区间，流动相中的A组分由5上升至25，B组分由95下降至75；在15MIN75MIN区间，流动相中的A组分由25上升至65，B组分由75下降至35。收集3741MIN区间的洗脱液，在35下进行真空浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素质量浓度达到30时，就制备出萝卜硫素浓缩液。将该萝卜硫素浓缩液置于冻干机中，在25PA真空度、60温度下，进行冷冻干燥24H，就制备出纯度为98以上的萝卜硫素。经核磁共振、液质联机和旋光仪分析鉴定，所制备出的萝卜硫素的化学结构为。
42、1异硫氰酸4甲磺酰基2烯丁烷。00427制备再生树脂柱0043向第5步收集的脱附萝卜硫素的SP850吸附树脂柱泵入3BV的无水甲醇，以2BV/H的流速洗脱树脂吸附的杂质，分别收集洗脱液和脱附杂质的SP850吸附树脂柱。对收集的甲醇洗脱液，含有异硫氰酸酯类物质，减压蒸馏回收甲醇后分别收集甲醇和浓缩液，对于收集的甲醇，进行脱水处理，制备出无水甲醇，可再次用于洗脱脱附萝卜硫素的SP850吸附树脂柱，制备再生树脂；对于收集的浓缩液，用于配制异硫氰酸酯类生物农药。对于收集的洗脱杂质的SP850吸附树脂柱，用1BV的蒸馏水以2BV/H的流速洗涤，分别收集经该蒸馏水洗涤的SP850吸附树脂柱和洗涤液，对收集。
43、的蒸馏水洗涤的SP850吸附树脂柱，即为再生树脂柱，可再次用于纯化萝卜硫素粗提液；对于收集的洗涤液，可用于配制脱氧充氮甲醇水洗脱液。0044实施例20045一种制备高纯度萝卜硫素的方法，具体方法步骤如下00461制备脱脂萝卜籽粉0047同实施例1，其中用40目的不锈钢筛网进行筛分破碎后的萝卜籽。在温度为33、压力28MPA的条件下进行萃取15H。降低压力至4MPA，使超临界二氧化碳气化，与萝卜籽油脂分离。对收集的气化二氧化碳，再次冷冻至3并再次加压至28MPA。00482制备硫代葡萄糖苷提取液0049同实施例1，其中在73的温度下进行第一次提取50MIN，脱脂萝卜籽粉质量G与甲醇体积ML之比为。
44、17。浓缩真空度为008MPA、温度为43。膏状浓缩物质量G与蒸馏水体积ML之比为15。乙酸乙酯进行萃取处理15MIN，溶解液与乙酸乙酯体积之比为1ML5ML。00503制备萝卜硫素粗提液0051同实施例1，其中脱脂萝卜籽粉分散于PH55的柠檬酸柠檬酸三钠缓冲溶液中，脱脂萝卜籽粉质量G与PH55的柠檬酸柠檬酸三钠缓冲溶液体积ML之比为说明书CN104059947A118/9页1219。硫代葡萄糖苷提取液体积ML与脱脂萝卜籽粉质量G之比为115。在30、80R/MIN的搅拌速度下避光水解7H。对收集的滤渣，分散于温度为30的蒸馏水中，蒸馏水体积ML与滤渣质量G之比为151，在80R/MIN的搅拌。
45、速度下避光洗涤25MIN。对收集的洗涤液，与收集的水解滤过液合并，用稀盐酸调节PH至3后离心，离心机转速为13000R/MIN。对收集的离心清液，泵入脱气罐中，在真空度为007MPA、温度为25的条件下，保持30MIN。然后充入02MPA的高纯度氮气，保持30MIN。00524制备脱氧充氮甲醇水洗脱液0053同实施例1，其中分别配制甲醇体积浓度为10、70的甲醇水溶液，再分别移入脱气罐中，在真空度为008MPA、温度为25的条件下，保持30MIN。然后充入02MPA的高纯度氮气，保持30MIN。00545制备萝卜硫素初步纯化浓缩液0055同实施例1，其中将第3步制备出的萝卜硫素粗提液泵入活化聚。
46、酰胺吸附树脂柱，萝卜硫素粗提液体积ML与聚酰胺吸附树脂的体积ML比为120，以流速为7BV/H通过聚酰胺吸附树脂柱。对于收集的荷载萝卜硫素的聚酰胺吸附树脂柱，先用2BV、甲醇体积浓度为10的脱氧充氮甲醇水洗脱液、以4BV/H的流速洗涤夹杂于树脂间的杂质，对收集的洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的聚酰胺吸附树脂柱，泵入甲醇积浓度为70的脱氧充氮甲醇水洗脱液以4BV/H的流速洗脱被吸附的萝卜硫素，直至甲醇体积浓度为70的脱氧充氮甲醇水洗脱液的耗量达到聚酰胺吸附树脂柱体积ML的7BV时止。对于收集的荷载萝卜硫素的甲醇洗脱液，反渗透浓缩至浓缩液中萝卜硫素的质量浓度达到25时为止。反渗透截留液，泵入真空浓缩。
47、机中，在真空度为007MPA、温度为40的条件下，进行真空浓缩。00566制备高纯度萝卜硫素冻干物0057同实施例1，其中萝卜硫素初步纯化浓缩液体积ML与C18硅胶填料质量G之比为165。对收集3741MIN区间的洗脱液，在40下进行真空浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素质量浓度达到50时。将该萝卜硫素浓缩液置于冻干机中，在真空度35PA、55温度下，进行冷冻干燥30H。00587制备再生树脂柱0059同实施例1，向第5步收集的脱附萝卜硫素的聚酰胺吸附树脂柱泵入35BV的无水甲醇，以3BV/H的流速洗脱树脂吸附的杂质，对于收集的洗脱杂质的聚酰胺吸附树脂柱，用15BV的蒸馏水以3BV/H的流速洗涤。00。
48、60实施例30061一种制备高纯度萝卜硫素的方法，具体方法步骤如下00621制备脱脂萝卜籽粉0063同实施例1，其中用60目的不锈钢筛网进行筛分破碎后的萝卜籽。在温度为35、压力30MPA的条件下进行萃取2H。降低压力至5MPA，使超临界二氧化碳气化，与萝卜籽油脂分离。对收集的气化二氧化碳，再次冷冻至5并再次加压至30MPA。00642制备硫代葡萄糖苷提取液0065同实施例1，其中在75的温度下进行第一次提取60MIN，脱脂萝卜籽粉质量G与甲醇体积ML之比为19。浓缩真空度为009MPA、温度为45。膏状浓缩物质量G说明书CN104059947A129/9页13与蒸馏水体积ML之比为16。乙酸乙酯进行萃取处理20MIN，溶解液与乙酸乙酯体积之比为1ML6ML。00663制备萝卜硫素粗提液0067同实施例1，其中脱脂萝卜籽粉分散于PH60的柠檬酸柠檬酸三钠缓冲溶液中，脱脂萝卜籽粉质量G与PH60的柠檬酸柠檬酸三钠缓冲溶液体积ML之比为112。硫代葡萄糖苷提取液体积ML与脱脂萝卜籽粉质量G之比为120。在35、120R/MIN的搅拌速度下避光水解5H。对收集的滤渣，分散于温度为35的蒸馏水中，蒸馏水体积ML与滤渣质量G之比为201，在120R/MIN的搅拌速度下避光洗涤20MIN。对收集的洗涤液，与收集的水解滤过液合并，用稀盐酸调节PH至4后离心，离心机转速为。