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1、10申请公布号CN104059988A43申请公布日20140924CN104059988A21申请号201410321628122申请日20140708C12Q1/68200601G01N33/6820060171申请人杨承刚地址100080北京市海淀区中关村善缘街立方庭大厦301072发明人杨承刚常鹏孙锦云李红伟54发明名称一种标志基因CST1及其应用57摘要本发明涉及一种标志基因CST1及其应用。本发明对胆囊息肉和胆囊结石组织进行高通量转录组深度测序及生物信息学分析，筛选到1个在胆囊息肉中下调、胆囊结石中上调的基因，进一步采用荧光定量PCR进行经典的分子生物学实验验证，结果显示筛选得到的。
2、CST1基因可作为区别胆囊息肉和胆囊结石的特异性标记分子。本发明提供的标志基因可用于制备区别胆囊息肉和胆囊结石辅助诊断制剂中的应用，具有重要的临床应用价值。51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表2页10申请公布号CN104059988ACN104059988A1/1页21CST1基因作为特异性标记分子在制备区别胆囊息肉和胆囊结石的诊断剂的应用。2根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CST1基因在胆囊息肉组织中低表达，在胆囊结石组织中高表达。3根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断剂为能特异且定。
3、量鉴定CST1基因MRNA和/或CST1蛋白的试剂。4用于检测个体胆囊息肉和/或胆囊结石的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括A提供CST1蛋白的平均量的标准对照；B能特异且定量鉴定CST1蛋白的试剂。5根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂是能特异性结合CST1蛋白的抗体。6用于检测个体胆囊息肉和/或胆囊结石的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括A提供CST1基因MRNA平均量的标准对照；B能特异且定量鉴定CST1基因MRNA的试剂。7根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂是能与所述的CST1MRNA杂交的多核苷酸探针和/或能在扩增反应中特异性扩增部分或全长CST1基因片段的。
4、两条寡核苷酸引物。8根据权利要求6或7任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性寡核苷酸引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。9根据权利要求78任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的寡核苷酸引物为SEQIDNO1和SEQIDNO2。10根据权利要求49任意一项所述的试剂盒，其特征在于，PCR体系包括上游引物、下游引物、样品RNA；2ULTRALSYBRONESTEPRTQPCRBUFFER、SUPERENZYMEMIX、RNASEFREEWATER；荧光定量PCR程序4510MIN；955MIN预变性，接3040个循环9510S，6045S。权利要求书CN104059988。
5、A1/7页3一种标志基因CST1及其应用技术领域0001本发明涉及一种标志基因及其应用。具体地，本发明涉及一种标志基因CST1CYSTATINSN及其在制备区别胆囊息肉和胆囊结石辅助诊断制剂中的应用。背景技术0002胆囊结石CHOLELITHIASIS是我国的常见疾病之一，自然人群的患病率约10以上，可导致严重的后果，如重症胆道感染、梗阻性黄疽、胆源性胰腺炎，与胆道肿瘤亦密切相关，威胁着人们的身体健康。胆囊结石的形成原因复杂，按成分主要可分为3种胆石胆固醇类结石、胆色素结石、混合性结石。长期以来，许多学者致力于胆固醇性结石发病机理的研究。致石基因，遗传流行病学和动物模型的分子生物学研究显示，基。
6、因因素对胆囊结石的形成有重大影响；胆石病的遗传模式可能是多基因参与。0003胆囊息肉样病变POLYPOIDLESIONSOFTHEGALLBLADDER，PLG，并非是指某一单一的疾病，而是指向胆囊壁上向胆囊腔内突出或隆起的病变的统称，又称为胆囊隆起性病变APOPHYSISLESIONSOFTHEGALLBLADDER，ALG。包括肿瘤性和非肿瘤性病变，肿瘤性息肉包括腺瘤、平滑肌瘤、脂肪瘤、血管瘤、神经纤维瘤等，而非肿瘤性病变包括胆固醇息肉、炎性息肉、胆囊腺肌增生症等。胆囊息肉样病变在临床表现上无特异性，往往无症状或症状轻微，只有少数人可能有右上腹或上腹部不适、隐痛，或伴有消化道症状，因此目前。
7、对PLG的诊断主要依靠影像学，包括B超、CT和胆囊造影术等。以B超为首选，但尚不能在术前明确病变的性质。由于本组疾病包含良、恶性病变20余种，术前明确病变的性质困难，如何对待和处理胆囊息肉样病变，对手术治疗的时机选择，都是十分重要的问题。0004胆囊结石是胆囊癌重要的危险因素之一，但是结石是否胆囊腺瘤恶变的危险因素则存在争议。通过病理分析，发现胆囊息肉合并结石组比单纯息肉组的胆囊粘膜肠化生和不典型增生的发生率要高，前者为44，后者为103，胆囊结石是胆囊息肉恶变的高危险因素之一。此外，胆囊存在结石可能对术前息肉的超声检测产生影响。术前超声检测胆囊息肉的一般敏感度为3690，如果不合并胆囊结石，。
8、敏感性可达99。综上所述，胆囊结石可能是胆囊息肉恶变的危险因素之一，结石对术前超声检测也存在一定影响，造成恶变息肉的漏诊。在胆囊结石误诊为胆囊息肉12例病理分析现代中西医结合杂志，2003年8月，16451646页中也对误诊原因进行了分析，认为目前胆囊良性肿瘤术前鉴别诊断尚不完善，多靠影像学检查。B超检查时，其表现为在胆囊黏膜上出现强回声隆起性病变，不随患者体位变化而移位。病例由于结石较小，尚在早期形成阶段，无钙盐沉积，在声像学上不易和胆囊息肉鉴别。胆囊黏膜由于慢性炎症，黏液腺化生，分泌的黏液将小的结石牢固地黏附在黏膜上，不随体位变化而移动，是造成误诊的原因。由于结石多发造成临床上多发性息肉的。
9、错误诊断，因惧怕息肉恶变而行胆囊切除术，造成误治。0005因此，寻找可作为区别胆囊息肉和胆囊结石的特异性分子标记，弥补影像学的不足，提高临床诊断水平，已成为目前临床急需解决的难题。0006以高通量测序为核心的基因组学技术迅速发展，已广泛应用到生物医学的各个领说明书CN104059988A2/7页4域并取得突出进展，使我们对于疾病的分子与遗传学基础的认识达到了一个新的水平。这些研究成果对于阐明疾病的病因、解析疾病发生的分子机制、寻找疾病特异的生物标志物和药物靶点，进而提升疾病的预防、诊断和治疗水平具有重要意义。0007故而，本发明对7例胆囊结石样本和2例胆囊息肉样本进行了高通量转录组深度测序，随。
10、后进行了生物信息学分析，筛选到1个在胆囊息肉中下调、胆囊结石中上调的基因，进一步采用荧光定量PCR进行经典的分子生物学实验验证，结果显示筛选得到的CST1基因可作为区别胆囊息肉和胆囊结石的特异性标记分子。本发明提供的标志基因可用于制备区别胆囊息肉和胆囊结石辅助诊断制剂中的应用，具有重要的临床应用价值。发明内容0008本发明目的是提供了一个可以区别胆囊息肉和胆囊结石的标记基因CST1。0009本发明目的是提供了一种检测CST1基因表达水平的荧光定量PCR试剂盒。0010进一步，本发明还提供了一对检测CST1基因表达水平的荧光定量PCR引物。0011进一步，本发明还提供了一种检测CST1基因表达水。
11、平的荧光定量PCR试剂盒使用方法。0012本发明目的是提供CST1基因在制备区别胆囊息肉和胆囊结石辅助诊断制剂中的应用。0013本发明目的是提供了一种用于检测个体胆囊息肉和/或胆囊结石的试剂盒，所述试剂盒包括A提供CST1蛋白的平均量的标准对照；B能特异且定量鉴定CST1蛋白的试剂。0014进一步，所述试剂是能特异性结合CST1蛋白的抗体。0015为实现上述目的，本发明对7例胆囊结石样本和2例胆囊息肉样本进行了高通量转录组深度测序，高通量转录组深度测序后，为了更好的理解差异表达基因的功能，发现在胆囊结石与胆囊息肉组之间共有150个差异表达基因，其中143个差异表达基因在胆囊结石中上调，7个差异。
12、表达基因在胆囊息肉中上调。我们对差异表达基因进行了GENEONLOGY和KEGG通路的富集，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了1个在胆囊息肉中下调、在胆囊结石中上调的差异表达基因CST1。0016本发明运用荧光定量PCR方法对筛选到的差异表达基因CST1进行功能分析。0017为了实现上述目的，本发明分别提取了45例胆囊息肉组织和38例胆囊结石组织的总RNA的进行提取，设计了用于扩增CST1基因的2条引物SEQIDNO1和SEQIDNO2，用于扩增内参基因GAPDH的2条引物SEQIDNO3和SEQIDNO4。制备了含有CST1基因序。
13、列的标准DNA模板，并进行了敏感性实验。进而，采用QRTPCR的方法比较CST1基因在胆囊息肉组织和胆囊结石组织中的表达水平。结果表明QRTPCR扩增结果稳定，其中CST1在胆囊结石组织的表达水平明显低于胆囊息肉组织和对照质粒100COPIES，而在胆囊息肉组织中的CST1高表达，即生物信息学筛选得到的CST1基因能很好的区别胆囊息肉组织和胆囊结石组织，可作为检测胆囊息肉和胆囊结石的特异性标记分子。0018本发明目的是提供了一种检测CST1表达水平的荧光定量PCR试剂盒及其使用方法。该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量说明书CN104059988A3/。
14、7页5快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。0019本发明制备的一种检测CST1表达水平的荧光定量PCR试剂盒组分包括特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO1，下游引物序列为SEQIDNO2。所述内参引物为GAPDH内参引物，上游引物序列为SEQIDNO3，下游引物序列为SEQIDNO4。所述荧光定量PCR反应液包括2ULTRALSYBRONESTEPRTQPCRBUFFERWITHROX、SUPERENZYMEMIX和RNASEFREEWATER。0020本发明还公开了一种检测CST1表达水平的荧光定量PCR试剂。
15、盒的使用方法，荧光定量PCR体系上游引物；下游引物；样品RNA10PG100NG；2ULTRALSYBRONESTEPRTQPCRBUFFERWITHROX，SUPERENZYMEMIX，加RNASEFREEWATER至25L。荧光定量PCR程序4510MIN；955MIN预变性，接3040个循环9510S，6045S。0021所述的试剂盒应用于CST1基因的定量检测，制备区别胆囊息肉和胆囊结石辅助诊断制剂，具有重要的临床应用价值。0022本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为107102COPIES/L，最小检出浓度为100COPIES/L。0023本发明优点0024A本发。
16、明提供的CST1能很好的区别胆囊息肉组织和胆囊结石组织，可作为检测胆囊息肉和胆囊结石的特异性标记分子。0025B本发明提供的检测CST1表达水平的荧光定量PCR试剂盒包含了从RNA提取到反转录到荧光定量实验所用的整套试剂，既方便临床使用，有保证了结果的一致性。具体实施方式0026下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。0。
17、027实施例1研究样本的收集及RNA提取0028收集7例胆囊结石样本和2例胆囊息肉样本，进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NANODROP1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNASEQ测序的样品要求OD260/OD280为1822。0029实施例2数据分析0030测序平台ILLUMINA公司的HISEQ2500高通量测序平台0031高通量转录组深度测序后，为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了GENEONLOGY和KEGG通路的富集，并对差异表达基因进行功能注释和。
18、蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了1个在胆囊息肉中下调、在胆囊结石中上调的差异表达基因CST1。0032实施例3胆囊息肉及胆囊结石组织CST1基因表达情况说明书CN104059988A4/7页60033一材料和方法00341、材料0035胆囊息肉及胆囊结石组织取自于2005年2010年住院病例，分别取了45例和38例。00362、方法003721胆囊息肉及胆囊结石组织总RNA的提取0038按康为世纪超纯RNA提取试剂盒ULTRAPURERNAKITDNASEI，货号CW0597说明书提取胆囊组织及瘤旁组织的RNA，通过凝胶电泳证明RNA的完整性，用核酸蛋白仪测定。
19、RNA的浓度和纯度。0039采用超纯RNA提取试剂盒货号CW0597提取，主要操作步骤如下00401样品处理，3050MG组织在液氮中充分研磨后加入1MLBUFFERRLT，或在组织样品中加入1MLBUFFERRLT后匀浆处理。00412样品中加入BUFFERRLT后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。00423以每1MLBUFFERRLT加入200L氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟。00434412,000RPM13,400G离心10分钟，此时样品分为三层红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一。
20、个新的RNASEFREE离心管自备中。00445在得到的水相溶液中加入等体积的70乙醇无RNASE的水配制，颠倒混匀。00456将上步所得溶液全部加入到已装入收集管COLLECTIONTUBE2ML的吸附柱SPINCOLUMNRM中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000RPM离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。00467向吸附柱中加入350LBUFFERRW1，12,000RPM离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。00478配制DNASEI混合液取52LRNASEFREEWATER，向其中加入8L10REACTIONBUFFER和20LDN。
21、ASEI1U/L，混匀，配制成终体积为80L的反应液。00489向吸附柱中直接加入80LDNASEI混合液，2030孵育15分钟。004910向吸附柱中加入350LBUFFERRW1，10,000RPM离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。005011向吸附柱中加入500LBUFFERRW2使用前检查是否已加入无水乙醇，12,000RPM离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。005112重复步骤11。00521312,000RPM离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。005314将吸附柱置于一个新的无RNASE离心管COLLECTION。
22、TUBE15ML中，向吸附柱的中间部位加入3050LRNASEFREEWATER，室温放置1分钟，12,000RPM离心1分钟，收集RNA溶液，70保存RNA，防止降解。说明书CN104059988A5/7页7005415总RNA完整性鉴定取2LRNA样品在15琼脂糖凝胶电泳80V，15MIN，分出区带后，EB染色，紫外灯下观察电泳区带。005516用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。005622CST1检测引物设计与合成0057根据PCR引物设计原则，应用PREMIER50和增强版的OLIGOARCHITECTTM软件进行引物设计。0058CST1的上、下游引物序列分别为0059上游引物5G。
23、AGGAGGATAGGATAATC3；SEQIDNO10060下游引物5GTCTGTAGTAGTCATCTT3；SEQIDNO20061产物长度为124BP。0062内参基因GAPDH的上、下游引物序列分别为0063上游引物5TAAGGTGGTGGCTGTGAAT3；SEQIDNO30064下游引物5CCGTGGGTGGAGTCATAC3；SEQIDNO40065产物长度为78BP。006623定量标准曲线的建立0067标准DNA模板的制备0068按照说明书，从胆囊组织中，利用超纯RNA提取试剂盒货号CW0597提取总RNA，接着用康为世纪SUPERRTCDNA第一链合成试剂盒货号CW0741。
24、进行逆转录反应，具体步骤如下1将RNA模板、PRIMERMIX、DNTPMIX、RTBUFFER、SUPERRT和RNASEFREEWATER溶解并置于冰上备用。00692配置反应体系，总体积为20L终浓度为50PG5G的RNA模板、2LPRIMERMIX、4LDNTPMIX、4LRTBUFFER、1LSUPERRT，加RNASEFREEWATER补平到20L。00703涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。0071442孵育3050分钟，85孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。0072将逆转录反应得到的CDNA用康为世纪2TAQMASTERMIX货号CW0682进行常。
25、规PCR，反应体系和条件如下2TAQMASTERMIX25L、上下游引物各2L、CDNA05G、补平至50L。反应条件为94预变性2MIN；94变性30S，50退火30S，72延伸30S，30CYCLES；最后72延伸2MIN。取样5L，对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，进行切胶回收并纯化，将纯化产物连接到PGMT克隆载体，随后转化到DH5感受态细胞中。通过序列为SEQIDNO1和SEQIDNO2的特异性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒DNA，质粒DNA采用NANODROPND1000核酸定量仪定量NANODROPTECHNOLOGIES，WILMINGTON，DELAWARE。
26、并做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备标准DNA模板浓度范围在108102COPIES/L。007323敏感性实验0074取重组质粒按比例稀释为108、107、106、105、104、103、102个拷贝/L，进行荧光定量PCR，以检测为阳性的最低浓度为该方法的检测灵敏度。本研究所建立的方法检测范围为108102COPIES/L，最小检出浓度为100COPIES/L。007524QRTPCR检测CST1基因表达量0076取上述胆囊结石组织和胆囊息肉组织用超纯RNA提取试剂盒货号CW0597提取说明书CN104059988A6/7页8总RNA，进而用ULTRASYBR一步法荧光定量PCR。
27、试剂盒货号CW0660进行RTPCR。具体步骤00771将RNA模板、引物、2ULTRASYBRONESTEPRTQPCRBUFFERWITHROX、SUPERENZYMEMIX和RNASEFREEWATER溶解并置于冰上备用。00782RTPCR反应体系25L2ULTRASYBRONESTEPRTQPCRBUFFERWITHROX125L、上游引物10M05L、下游引物10M05L、SUPERENZYMEMIX05L、加RNA模板终浓度为10PG100NG、RNASEFREEWATER补平至25L。00793涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。00804将热循环仪预热到45，将PCR管。
28、置于热循环仪中，按以下反应条件进行反应反转录4510MIN；955MIN预变性，接35个循环9510S，6045S。0081对QRTPCR反应结果使用SPSSFORWINDOWS115软件，相关数据采用2检验和FISHER确切概率法进行处理，P005有统计学意义；QRTPCR反应利用MEDCALC统计分析软件来计算。0082根据QRTPCR的相对定量公式2CT100，比较CST1基因在胆囊息肉和胆囊结石中的表达水平。结果显示QRTPCR扩增结果稳定，其中CST1在胆囊息肉中的表达水平在00000001之间，明显低于胆囊结石和对照质粒100COPIES，而胆囊结石中的CST1的表达量在00020。
29、150之间，以上结果说明CST1在胆囊结石中高表达，在胆囊息肉中低表达。0083实施例4一种检测胆囊中CST1基因的检测试剂盒及使用方法0084RNA提取试剂超纯RNA提取试剂盒货号CW05970085荧光定量试剂ULTRASYBR一步法荧光定量PCR试剂盒货号CW0660008600870088荧光定量PCR反应体系及方法0089RTPCR反应体系25L2ULTRASYBRONESTEPRTQPCRBUFFERWITHROX125L、上游引物10M05L、下游引物10M05L、SUPERENZYMEMIX05L、加RNA模板终浓度为10PG100NG、RNASEFREEWATER补平至25L。
30、。0090反应调节反转录4510MIN；955MIN预变性，接3040个循环9510S，说明书CN104059988A7/7页96045S。0091实施例5一种检测CST1蛋白的试剂盒及使用方法0092该试剂盒含有A提供CST1蛋白的平均量的标准对照；B能特异且定量鉴定CST1蛋白的试剂。所述试剂包括针对人CST1蛋白的特异性抗体如SINOBIOLOGICALINC的抗体CYSTATINSN/CST1ANTIBODY，货号11568RP0250，或者ABNOVA公司的抗体CST1MONOCLONALANTIBODY，货号H00001469M等；或者用标准的杂交瘤技术产生的抗CST1蛋白的单克隆抗体。该试剂盒用于直接检测样品中是否存在CST1蛋白及蛋白的含量。此外，试剂盒还可以进一步包括组织蛋白抽提试剂，蛋白定量试剂以及蛋白MARKER等。0093本发明采用生物信息学方法成功的对已知的基因芯片结果进行二次分析，筛选出区别胆囊息肉和胆囊结石的标记基因CST1，并提供了检测CST1表达水平的荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含了从RNA提取到反转录到荧光定量实验所用的整套试剂，既方便临床使用，又保证了结果的一致性，具有很好的临床应用前景。说明书CN104059988A1/2页1000010002序列表CN104059988A102/2页11序列表CN104059988A11。