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1、10申请公布号CN104059969A43申请公布日20140924CN104059969A21申请号201410238526322申请日20140529C12Q1/6820060171申请人温州迈拓生物科技有限公司地址325000浙江省温州市瓯海经济开发区东方南路38号72发明人管敏鑫薛凌施苏雪郑斌娇唐霄雯74专利代理机构温州金瓯专利事务所普通合伙33237代理人黄肇平54发明名称检测原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG的试剂盒及其检测方法57摘要一种检测原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG的试剂盒及其检测方法。可从细胞、血液以及组织样本中快速、高效提取全基因组D。
2、NA，针对采样方式、样本来源以及样本形式的不同，对不同样本和样本形式选择相应的方法进行预处理，通过特异性引物设计以及提高退火温度等方法提高扩增片段的特异性，然后直接利用扩增的特异的目的片段进行酶切，省去了琼脂糖凝胶回收目的片段繁琐复杂的操作步骤，本发明检测方法操作简便、易掌握；对仪器设备及操作人员无特殊要求，适合在一股医院、分子生物实验室开展，为全国性开展原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG突变的大规模筛查和预防性检查提供条件，有效减少原发性高血压发生率，做到早筛查、早预防和早治疗。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利。
3、要求书1页说明书5页附图2页10申请公布号CN104059969ACN104059969A1/1页21一种检测原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括有提取样本全基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、酶切反应试剂、阳性标准品、阴性标准品。2根据权利要求1所述的检测原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG的试剂盒，其特征在于，所述的提取样本全基因组DNA的试剂包括有裂解液、溶液I、酚氯仿异戊醇混合液和溶液II。3根据权利要求2所述的检测原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG的试剂盒，其特征在于，所述的溶液I的主要成分为蛋白酶。
4、K，所述的溶液II的主要成分为氢氧化钠。4根据权利要求1所述的检测原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增反应试剂包括有DNTP、10PCR缓冲液、MGCL2、引物、TAQ酶和三蒸水。5根据权利要求1所述的检测原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG的试剂盒，其特征在于，所述的酶切反应试剂包括有限制性内切酶NLAIII和酶切缓冲液。6一种检测线粒体TRNAMET基因A4435G突变的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤1提取全基因组DNA运用蛋白酶K消化裂解蛋白质，酚氯仿异戊醇法，从细胞、血液以及组织样本中提取全基因组DNA；2特异。
5、性PCR扩增及酶切根据人类线粒体基因剑桥参考序列特异性设计一对引物4435F、4435R为模版，所述的引物特异性的扩增含有4435位点的序列，然后利用专一性限制性内切酶NLAIII特异性的识别CATG回文结构，4435位点碱基突变后，产生限制性内切酶NLAIII识别的回文结构，利用限制性内切酶NLAIII识别的专一性，对样本的全基因组DNA进行PCR扩增和酶切；3突变鉴定将酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳。权利要求书CN104059969A1/5页3检测原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG的试剂盒及其检测方法技术领域0001本发明涉及生物医学工程领域，具体涉及一种检测原发性高血压相。
6、关的线粒体TRNAMET4435AG的试剂盒及其检测方法。背景技术0002心血管疾病是全球造成死亡的首要原因，据世界卫生组织统计，2008年约有1730万人死于心血管病，到2030年，几乎有2330万人将死于心血管病，而高血压是心血管疾病的首位危险因素。高血压影响全世界超过三分之一的成年人，即大约10亿人，每年造成全世界900多万人死亡，其中半数死于心脏病和中风，高血压还可引起肾衰竭、盲症、血管破裂以及脑损伤。高血压按照发病原因可以分为原发性高血压和继发性高血压，原发性高血压约占所有高血压的9095。0003线粒体是一种由两层膜包被的细胞器，是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷ATP的主要场所，。
7、为细胞的活动提供能量，所以有“细胞动力工厂”之称。除了为细胞供能外，线粒体还参与如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。0004线粒体基因是人体内唯一的核外遗传物质。线粒体TRNA基因突变是与原发性高血压相关的突变热点区域，2009年GUANMX等人发现，位于线粒体TRNAMET基因4435AG突变与原发性高血压相关YUQILIU，MINXINGUANETALHYPERTENTION，2009；5310831090，2011年又进一步在细胞功能水平证明线粒体TRNAMET基因4435AG可能影响原发性高血压的发生发展ZHONGQIULU，MINXINGUA。
8、NETALEURJHUMGENET，2011；1911811186。0005目前对于突变检测最常用方法为第一代测序测序技术，但此技术对仪器要求高，操作繁琐且成本昂贵，结果误差大、敏感性差并且存在放射性核素污染；PCR限制性片段长度多态性PCRRFLP是目前应用较广泛、相对成熟的检测方法，但操作繁琐，操作过程中影响结果的不确定因素太多；近年来，变性高效液相色谱DHPLC和基因芯片的应用为点突变检测提供了思路，检测技术灵敏度和特异度均较高，自动化程度高，适合高通量检测，但涉及仪器昂贵，需专人操作，不适合广泛推广。因此，迫切需要一种快速、准确、操作简易的突变筛查方法应用与临床突变筛查。发明内容000。
9、6为了解决现有的技术的缺点，本发明提供了一种检测原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG的试剂盒及其检测方法，通过酶切法进行原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG突变检测，克服了现有方法耗时长、操作难、成本高等缺点。0007本发明采用的技术解决方案是一种检测原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG的试剂盒，所述的试剂盒包括有提取样本全基因组DNA的试剂、PCR扩增说明书CN104059969A2/5页4反应试剂、酶切反应试剂、阳性标准品、阴性标准品。0008所述的检测原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG的试剂盒，所述的提取样本全基因组DNA的试剂包。
10、括有裂解液、溶液I、酚氯仿异戊醇混合液和溶液II。0009所述的检测原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG的试剂盒，所述的溶液I的主要成分为蛋白酶K，所述的溶液II的主要成分为氢氧化钠。0010所述的检测原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG的试剂盒，所述的PCR扩增反应试剂包括有DNTP、10PCR缓冲液、MGCL2、引物、TAQ酶和三蒸水。0011所述的检测原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG的试剂盒，所述的酶切反应试剂包括有限制性内切酶NLAIII和酶切缓冲液。0012一种检测线粒体TRNAMET基因A4435G突变的方法，所述的方法包括以下步骤1提。
11、取全基因组DNA运用蛋白酶K消化裂解蛋白质，酚氯仿异戊醇法，从细胞、血液以及组织样本中提取全基因组DNA；2特异性PCR扩增及酶切根据人类线粒体基因剑桥参考序列特异性设计一对引物4435F、4435R为模版，所述的引物特异性的扩增含有4435位点的序列，然后利用专一性限制性内切酶NLAIII特异性的识别CATG回文结构，4435位点碱基突变后，产生限制性内切酶NLAIII识别的回文结构，利用限制性内切酶NLAIII识别的专一性，对样本的全基因组DNA进行PCR扩增和酶切；3突变鉴定将酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳。0013本发明的有益效果是本发明提供了一种检测原发性高血压相关的线粒体TRNAM。
12、ET4435AG的试剂盒及其检测方法，可从细胞、血液以及组织样本中快速、高效提取全基因组DNA，针对采样方式、样本来源以及样本形式的不同，对不同样本和样本形式选择相应的方法进行预处理，通过特异性引物设计以及提高退火温度等方法提高扩增片段的特异性，然后直接利用扩增的特异的目的片段进行酶切，省去了琼脂糖凝胶回收目的片段繁琐复杂的操作步骤，与其他检测方法相比，本发明检测方法操作简便、易掌握；对仪器设备及操作人员无特殊要求，适合在一股医院、分子生物实验室开展，为全国性开展原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG突变的大规模筛查和预防性检查提供条件，有效减少原发性高血压发生率，做到早筛查、早预。
13、防和早治疗。0014附图说明0015图1为本发明特异性条带扩增循环条件图2为本发明突变样本、对照样本PCR产物及酶切产物图图3为本发明突变样本、对照样本测序验证酶切方法图具体实施方式0016一种检测原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG的试剂盒，所述的试剂盒包括有提取样本全基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、酶切反应试剂、阳性标准品、阴性标准品。0017阳性标准品是指携带4435G突变的样品，携带原发性高血压突变位点；阴性标准说明书CN104059969A3/5页5品是指4435A的样品，不携带原发性高血压突变位点，用以进行测试后的对照。0018提取样本全基因组DNA的试剂包括。
14、有裂解液、溶液I、酚氯仿异戊醇混合液和溶液II。0019溶液I的主要成分为蛋白酶K，所述的溶液II的主要成分为氢氧化钠。0020PCR扩增反应试剂包括有DNTP、10PCR缓冲液、MGCL2、引物、TAQ酶和三蒸水。0021酶切反应试剂包括有限制性内切酶NLAIII和酶切缓冲液。0022一种检测线粒体TRNAMET基因A4435G突变的方法，所述的方法内容如下1DNA的提取运用酚氯仿异戊醇法提取血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液的样本中的DNA。00232特异性引物设计及特异性条带PCR扩增使用PRIMER50软件根据人类线粒体基因序列NC_0129201在4435前后设计上游引物44。
15、35F、下游引物4435R；采用上述引物对包含4435的特异性条带进行扩增。00243专一性酶切及电泳鉴定采用专一性限制性内切酶NLAIII对上述特异性条带进行酶切，酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，即可鉴定是否发生4435AG突变。0025具体步骤如下1收集标本在上述检测线粒体TRNAMET基因A4435G突变的方法中，可从细胞、血液以及组织样本中快速提取全基因组DNA，针对采样方式、样本来源以及样本形式的不同，对不同样本和样本形式选择相应的方法进行预处理，处理方法如下1收集样品前准备好灭菌的收集容器，每人250ML瓶子2瓶内有5ML双抗，选择晨尿，主要收集中段尿，瓶口不要碰到任何皮肤部位，收集。
16、150200ML尿液，将尿液转移至50ML的离心管中，400G离心10MIN，弃上清，加10MLPBS，清洗一次，400G离心10MIN，弃上清；2指尖采血用手指按摩采血部位，使中指或无名指指尖自然充血，再用医用酒精棉球消毒皮肤，待酒精挥发干燥后，右手持消毒刺针，自指尖腹侧迅速刺入2MM，立即出针，让血液自然流出，用消毒棉球擦去第一滴血后，按需要依次采血，采血完毕，用消毒干棉球压住伤口片刻。静脉采血先用碘酊棉签自所选静脉穿刺处从内向外、顺时针方向消毒皮肤，待碘酊挥发后，再用医用酒精棉签以同样方法拭去碘迹，然后左手拇指固定静脉穿刺部位下端，右手拇指和中指持注射器针筒，使针头斜面和针筒刻度向上，沿。
17、静脉走向使针头与皮肤成30度角快速刺人皮肤，然后以5度角向前穿破静脉壁进人静脉腔，见回血后，将针头顺势探人少许。取50100L血液标本如一滴血或1CM2的血滤纸片放入15MLEPPENDORF管中，用PBS补至200L，室温静置10分钟；3收集组织前，要让受检者了解研究内容，并自愿同意参加试验的原则并签订知情同意书。先用医用酒精棉球从内向外对采集皮肤处进行消毒，然后涂上局部麻醉软膏，贴上麻醉贴，然后用采集皮肤组织的器具采集米粒大小的皮肤组织，将组织放入含有双抗的PBS溶液中。0026然后用细胞裂解液和溶液I对上述样本进行消化裂解，再用酚氯仿异戊醇沉淀DNA，用乙醇清洗有机溶剂，最后用溶液II溶。
18、解DNA后于20保存备用。00272特异性引物设计使用PRIMER50软件根据人类线粒体基因序列NC_0129201在4435位点前后220BP说明书CN104059969A4/5页6和80BP处设计上游引物4435F、下游引物4435R，4435F和4435R引物，该引物特异性的扩增包含4435位点的序列，并且扩增的序列中不含有其它CATG回文结构。具体参数如表1；此对引物中无连续出现的5个同一碱基，GC含量为44，无引物二聚体和发夹结构。设计引物人工合成委托生物公司，用于后续实验。0028表1针对4435位点设计引物参数表3特异性条带PCR扩增将样本DNA、10PCR缓冲液、DNTPA、T。
19、、C、G四种脱氧核糖核苷三磷酸混合液、MG2溶液、上述引物及TAQ酶、三蒸水按一定比例混合，进行PCR扩增，扩增后长度为302BP，具体条件及反应体系如图1、表2所示。0029表2PCR反应体系浓度体系PCR缓冲液102LDNTP200NM/L2LMGCL225UM/L15L引物F10UM/L01L引物R10UM/L01LTAG酶5U/UL01LDNA模板50NG/UL1LDDH2O182L4专一性限制性内切酶NLAIII酶切专一性限制性内切酶NLAIII特异性识别序列为携带线粒体TRNAMET4435AG突变样本恰好好存在CATG回文结构，上述特异性扩增产物可以被酶切。将上述基因组提取试剂、。
20、PCR扩增反应试剂；酶切反应试剂，包括限制性内切酶NLAIII和酶切缓冲液；阳性标准品、阴性标准品；使用说明书组合，组成用于体外检测线粒体TRNAMET4435AG突变试剂盒，将样本DNA提取、PCR扩增、限制性内切酶酶切在试剂盒基础上一次性完成。讲上述特异性PCR产物LUG、LOUNIT限制性内切酶NLAIII及2UL10酶切说明书CN104059969A5/5页7缓冲液及三蒸水组成20UL体系，37加热1H，即可完成酶切。00305琼脂糖凝胶电泳鉴定将上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，取075G琼脂糖，微波炉加热溶于50ML1TAEBUFFER中，冷却至60后加入05G/MLEBETHI。
21、DIUMBROMIDE，溴化乙锭染料25UL；混合均匀后导入胶槽，冷却后即为15琼脂糖凝胶，根据不同大小DNA分子在胶中迁移率不同，即可对突变样本和正常样本的酶切产物进行鉴定。0031结果根据图2可知，携带线粒体TRNAMET4435AG突变样本可以被NLAIII酶切，产物为80BP和222BP两条带，而不携带该突变样本不能被酶切，产物为302BP一条带，其中泳道11为空白对照；泳道2、4、6为突变样本PCR产物；泳道1、3、5分别为1、2、4样本酶切产物；泳道8、10为野生型样本PCR产物；泳道7、9分别为8、10样本酶切产物。0032可靠性的检验将携带线粒体TRNAMET4435AG突变样。
22、本和对照样本进行直接测序分析，结果与本发明方法完全吻合。结果如图3所示。0033本发明的方法及其制备的体外检测母系遗传药物性耳聋线粒体基因A1555G突变和C1494T突变试剂盒具有以下特点1本发明的所用标本血液、尿液、组织等采集后仍可用于后续实验研究，如血液样本可建立永生化类淋巴母细胞系、尿液细胞可用于成纤维细胞培养、组织可用于诱导多功能干细胞的建立，可保存珍贵的遗传资源。00342目前已有的点突变检测方法，例如PCR限制性片段长度多态性PCRRFLP变性高效液相色谱DHPLC和基因芯片等检测技术灵敏度和特异度均较高，自动化程度高，适合高通量检测，但涉及仪器昂贵，需专人操作，不适合广泛推广。。
23、因此，迫切需要一种快速、准确、操作简易的突变筛查方法应用与临床突变筛查。0035但由于其自身的缺陷，如费时费力、操作繁琐以及检测费用偏高而不易在临床进行推广。与这些方法相比较，本试剂盒借助特异性PCR技术与专一性限制性内切酶NLAIII特异性的识别CATG回文结构的特点，每份DNA样本用1对特异性引物进行PCR扩增，然后用专一性限制性内切酶NLAIII进行1次酶切即可在几小时内对原发性高血压相关的线粒体TRNAMET基因A4435G突变进行检测。另外值得一提的是，本试剂盒提供的阳性标准品和阴性标准品可以对应用本试剂盒的检测结果进行对比分析，从而更直观、更清晰的分析检测结果。00363本发明提供的线粒体TRNAMET4435AG突变检测试剂盒，提供了完整的监测体系及详细的说明书，与其他检测方法相比，本发明检测方法操作简便、易掌握；对仪器设备及操作人员无特殊要求，适合在一股医院、分子生物实验室开展，为全国性开展原发性高血压相关的线粒体TRNAMET4435AG突变的大规模筛查和预防性检查提供条件，有效减少原发性高血压发生率，做到早筛查、早预防和早治疗。说明书CN104059969A1/2页8图1图2说明书附图CN104059969A2/2页9图3说明书附图CN104059969A。