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1、(10)授权公告号 CN 101785432 B (45)授权公告日 2011.12.21 CN 101785432 B *CN101785432B* (21)申请号 201019146041.0 (22)申请日 2010.02.05 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 浙江林学院 地址 311300 浙江省临安市环城北路 88 号 (72)发明人 张启香 黄坚钦 王正加 黄有军 胡恒康 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 周烽 孔令霞等 . 大别山野生山核桃离体快繁研 究 . 安徽农学通报 .2007, 第 13 卷 ( 第 13 期 。
2、), 第 105 106 页 . 章铁等 . 大别山山核桃组培中防褐变措施的 研究 .经济林研究 .2005, 第 23 卷 ( 第 1 期 ), 第 21 23 页 . 傅玉兰等 . 美国山核桃组培中材料灭菌的研 究 .安徽农业大学学报 .2004, 第 31 卷 ( 第 2 期 ), 第 169 172 页 . 郭传友等 . 山核桃研究综述及展望 .经济 林研究 .2004, 第 22 卷 ( 第 1 期 ), 第 61 63 页 . 朱玉球等 . 山核桃愈伤组织诱导的初步研 究. 浙江林学院学报 .2001,第18卷(第2期), 第 115 118 页 . (54) 发明名称 山核桃胚根。
3、不定芽诱导和生根培养基及组培 方法 (57) 摘要 一种山核桃胚根不定芽诱导和生根培养基， 包括不同诱导时期的四种培养基 ： (1) 初代培养 基， (2) 胚根不定芽诱导培养基， (3) 不定芽增殖 培养基， (4) 不定芽生根培养基， 这四种培养基均 以 MS 为基本培养基， 附加蔗糖、 琼脂 A 等物质， pH5.7。 用上述四种培养基进行山核桃胚根不定芽 及生根的组培方法经过如下五个步骤 ： 一是外植 体的采集与消毒， 二是初代培养， 三是胚根不定芽 诱导， 四是不定芽增殖培养， 五是生根诱导。经过 上述五步骤的培育为快速而优质地培养出山核桃 幼苗打好坚实的基础。 应用本培养基组培， 。
4、再生植 株能保持母本优良性状， 提高幼苗繁殖速度， 扩大 繁殖数量， 并能有效利用种子、 缩短育苗周期， 利 于满足社会需求。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 冀敏 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 CN 101785432 B1/1 页 2 1. 一种山核桃胚根不定芽诱导和生根培养基， 其特征是包括不同诱导时期的四种培养 基， 各种培养基的原料及其附加量分别是 ： (1) 初代培养基 ： 以 MS 为基本培养基， 附加蔗糖 20 30g/L、 Agar type A 即琼脂 A 6.5 8.5g/L， 培养基的 pH。
5、 值为 5.7 ； (2) 胚根不定芽诱导培养基 ： MS 附加蔗糖 20 30g/L、 琼脂 A 6.5 8.5g/L、 Picloram 即 4- 氨基 -3， 5， 6- 三氯吡啶羧酸 0.01mg/L、 6-BA 即 6- 氨基腺嘌呤 1.0 3.0mg/L， pH 值 5.7 ； (3) 不 定 芽 增 殖 培 养 基 ： MS 附 加 蔗 糖 20 30g/L、琼 脂 A6.5 8.5g/L、 Picloram0.01 0.02mg/L、 6-BA1 2mg/L， pH 值为 5.7 ； (4) 不定芽生根培养基 ： MS 附加蔗糖 20 30g/L， 琼脂 A6.5 8.5g/L。
6、、 IAA 即吲哚乙 酸 0.3 0.8mg/L， pH 值 5.7。 2. 一种用权利要求 1 所述的培养基进行山核桃胚根不定芽诱导及生根的组培方法， 其 特征是经过下列步骤 ： (1) 外植体采集与消毒 ： 选取健壮的山核桃开花后 100 120 天所结的幼果， 依次进行 自来水冲洗 2h， 超净工作台上用 75乙醇灭菌 3min， 无菌水冲洗 3 4 次， 浓度为 0.525 的 NaClO 灭菌 20min 并抽真空， 无菌水冲洗 5 次后， 用灭菌滤纸吸干表面水分， 并剥去革质 果皮， 取出幼胚待用 ； (2) 初代培养 ： 将步骤 (1) 无菌条件下取出的幼胚接入前述的初代培养基中。
7、， 每天转 接 1 次 ； 3 天后改为每 3 天转接一次， 每次均转接至相同的新鲜培养基中， 共转接三次， 其中 前 7 天置于暗柜中培养， 后 5 天置于光暗周期为光 16h/ 暗 8h 的条件下培养， 培养温度为 252 ； (3) 胚根不定芽诱导 ： 将初代培养后胚根发育良好的幼胚接入前述的胚根不定芽诱导 培养基中， 经过 30d 的诱导， 获得不定芽， 微电脑时控开关控制培养室每日光照时间， 每日 光暗周期为光 16h/ 暗 8h， 光照强度为 40 50mol m-2s-1， 培养温度为 252 ； (4) 不定芽增殖培养 ： 将获得的不定芽在前述的不定芽增殖培养基上进行增殖培养，。
8、 30 天继代 1 次， 共继代 3 次， 增殖系数为 5 8， 光照培养， 光暗周期为光 16h/ 暗 8h， 光照强 度为 40 50mol m-2s-1， 培养温度为 252 ； (5) 生根诱导 ： 前述的不定芽在生根培养基中诱导生根， 培养 30 天， 生根率达 50， 光 照培养， 光暗周期为光 16h/ 暗 8h， 光照强度为 40 50mol m-2s-1， 培养温度为 251。 权 利 要 求 书 CN 101785432 B1/3 页 3 山核桃胚根不定芽诱导和生根培养基及组培方法 技术领域 0001 本发明涉及一种以山核桃幼胚为外植体， 发育形成胚根， 继而形成不定芽、 。
9、诱导生 根的培养基及组培方法。 背景技术 0002 山核桃 (Carya cathayensis Sarg.) 是胡桃科山核桃属的果、 木兼用的优良经济 树种， 在自然环境下， 山核桃靠种子繁殖。 山核桃干果可加工成各种特色风味食品、 保健品， 山核桃含油率高达7074， 富含不饱和脂肪酸， 含粗蛋白7.89.6和含K、 Ca、 Mg、 Na等人体所必须的矿质元素。 山核桃木质坚硬、 纹理美、 抗腐蚀， 在军工、 船舶和建筑业用途 广泛， 是我国一种十分优良的经济树种。但山核桃树的分布区域狭窄， 为我国的特有树种， 且只有浙江西北山地和交界的皖南山地有所分布。需求旺、 产品少的矛盾突出。长期以。
10、来， 山核桃的繁殖主要是实生和嫁接繁殖， 实生繁殖难以保持品种的优良特性。山核桃又因富 含单宁， 切口极易氧化褐变， 对嫁接的技术要求较高， 而且嫁接又要受季节和气候的限制， 繁殖速度难以满足生产发展的需求。 0003 林学界， 众多学者对山核桃的繁殖作了许多新的探索和尝试， 如黄有军先生的幼 树的根插繁殖技术、 裴东等先生对核桃的试管嫩茎生根技术及幼树的根插繁殖技术等， 各 对社会作出了有益的贡献。经检索， 至今未发现通过山核桃幼胚经试管培育不定芽并繁殖 生根育成植株的相关报道。 发明内容 0004 针对山核桃树种的经济价值越来越被人们认识， 发展山核桃生产的热情自发涌 动， 依靠传统的实生。
11、繁殖和嫁接繁殖， 从质量和数量上均无法满足现实的需求， 为此， 本发 明要解决的技术问题是提供一种以山核桃幼胚为外植体， 诱导胚根发育、 不定芽形成和不 定芽生根的培养基及组培方法。 0005 本发明的技术问题通过如下技术方案解决 ： 0006 1. 本山核桃胚根不定芽诱导和生根培养基， 包括不同诱导时期的四种培养基， 各 种培养基的原料及其附加量分别是 ： 0007 (1) 初代培养基 ： 以 MS 为基本培养基， 附加蔗糖 20 30g/L、 Agar type A 即琼脂 A 6.5 8.5g/L， 培养基的 pH 值为 5.7 ； 0008 (2) 胚根不定芽诱导培养基 ： MS 附加。
12、蔗糖 20 30g/L、 琼脂 A 6.5 8.5g/L、 Picloram即4-氨基-3， 5， 6-三氯吡啶羧酸0.01mg/L、 6-BA即6-氨基腺嘌呤1.03.0mg/ L， pH 值 5.7 ； 0009 (3) 不 定 芽 增 殖 培 养 基 ： MS 附 加 蔗 糖 20 30g/L、 琼 脂 A6.5 8.5g/L、 Picloram0.01 0.02mg/L、 6-BA1 2mg/L， pH 值为 5.7 ； 0010 (4) 不定芽生根培养基 ： MS 附加蔗糖 20 30g/L， 琼脂 A6.5 8.5g/L、 IAA 即吲 哚乙酸 0.3 0.8mg/L， pH 值 。
13、5.7。 说 明 书 CN 101785432 B2/3 页 4 0011 用上述的培养基进行山核桃胚根不定芽诱导及生根的组培方法经过下列步骤 ： 0012 (1) 外植体采集与消毒 ： 选取健壮的山核桃开花后 100 120 天所结的幼果， 依 次进行自来水冲洗 2h， 超净工作台上用 75乙醇灭菌 3min， 无菌水冲洗 3 4 次， 浓度为 0.525的 NaClO 灭菌 20min 并抽真空， 无菌水冲洗 5 次后， 用灭菌滤纸吸干表面水分， 并剥 去革质果皮， 取出幼胚待用 ； 0013 (2) 初代培养 ： 将步骤 (1) 无菌条件下取出的幼胚接入前述的初代培养基中， 每天 转接 。
14、1 次 ； 3 天后改为每 3 天转接一次， 每次均转接至相同的新鲜培养基中， 共转接三次， 其 中前 7 天置于暗柜中培养， 后 5 天置于光暗周期为光 16h/ 暗 8h 的条件下培养。培养温度 为 252 ； 0014 (3) 胚根不定芽诱导 ： 将初代培养后胚根发育良好的幼胚接入前述的胚根不定芽 诱导培养基中， 经过 30d 的诱导， 获得不定芽。微电脑时控开关控制培养室每日光照时间， 每日光暗周期为光 16h/ 暗 8h， 光照强度为 40 50mol m-2s-1， 培养温度为 252 ； 0015 (4) 不定芽增殖培养 ： 将获得的不定芽在前述的不定芽增殖培养基上进行增殖培 养。
15、， 30 天继代 1 次， 共继代 3 次， 增殖系数为 5 8。光照培养， 光暗周期为光 16h/ 暗 8h， 光 照强度为 40 50mol m-2s-1， 培养温度为 252 ； 0016 (5) 生根诱导 ： 前述的不定芽在生根培养基中诱导生根， 培养 30 天， 生根率达 50。光照培养， 光暗周期为光 16h/ 暗 8h， 光照强度为 40 50mol m-2s-1， 培养温度为 251。 0017 本发明的有益效果是 ： 0018 应用山核桃胚根不定芽诱导并进行生根培养， 能使再生植株较好地保持母本的优 良性状， 有效地提高山核桃的繁殖系数， 为山核桃良种快繁打下良好的基础。 与。
16、播种繁殖相 比， 组织培养法能有效利用种子， 其萌发率高， 育苗周期短， 无菌条件下种子只需 2 周即可 萌发。与扦插繁殖相比， 在一个为期 6 个月的生长周期内组织培养法的繁殖系数为扦插繁 殖的 50 60 倍。 具体实施方式 0019 本发明下面结合实施例作进一步详述 ： 本山核桃胚根不定芽诱导及生根的培养基 中， 选用基本培养基是 MS 培养基， 这是经过用 MS、 1/2MS、 WPM、 DKW 四种基本培养基各自均 附加蔗糖 20 30g/L、 琼脂 A 6.5 8.5g/L、 Picloram 即 4- 氨基 -3， 5， 6- 三氯吡啶羧酸 0.01mg/L、 6-BA 即 6-。
17、 氨基腺嘌呤 1.0 3.0mg/L， pH 值 5.7， 进行试验， 每组重复 3 次， 每 种基本培养基有 20 个外植体的对比试验得出的。因 MS 培养基中处理 30 天后， 胚根发育最 好， 诱导的不定芽数最多， 质量最好。 0020 总之， 本发明所公开的培养基及其配比值， 温度、 凝固剂等也可用诸如葡萄糖、 水 晶洋菜等替代， 培养基各原料的配比值也可分别采用本发明最佳方案定值的接近值取代。 0021 下面给出的是本发明的最佳实施例。 0022 1. 本山核桃胚根不定芽诱导和生根培养基， 包括不同诱导时期的四种培养基， 各 种培养基的原料及其附加量分别是 ： 0023 (1) 初代。
18、培养基 ： 以 MS 为基本培养基， 附加蔗糖 20 30g/L、 Agar type A 即琼脂 A 6.5 8.5g/L， 培养基的 pH 值为 5.7 ； 说 明 书 CN 101785432 B3/3 页 5 0024 (2) 胚根不定芽诱导培养基 ： MS 附加蔗糖 20 30g/L、 琼脂 A 6.5 8.5g/L、 Picloram即4-氨基-3， 5， 6-三氯吡啶羧酸0.01mg/L、 6-BA即6-氨基腺嘌呤1.03.0mg/ L， pH 值 5.7 ； 0025 (3) 不 定 芽 增 殖 培 养 基 ： MS 附 加 蔗 糖 20 30g/L、 琼 脂 A6.5 8.5。
19、g/L、 Picloram0.01 0.02mg/L、 6-BA1 2mg/L， pH 值为 5.7 ； 0026 (4) 不定芽生根培养基 ： MS 附加蔗糖 20 30g/L， 琼脂 A6.5 8.5g/L、 IAA 即吲 哚乙酸 0.3 0.8mg/L， pH 值 5.7。 0027 用上述培养基进行山核桃胚根不定芽诱导及生根方法经过下列步骤 ： 0028 (1) 外植体采集与消毒 ： 选取健壮的山核桃开花后 100 120 天所结的幼果， 依 次进行自来水冲洗 2h， 超净工作台上用 75乙醇灭菌 3min， 无菌水冲洗 3 4 次， 浓度为 0.525的 NaClO 灭菌 20min。
20、 并抽真空， 无菌水冲洗 5 次后， 用灭菌滤纸吸干表面水分， 并剥 去革质果皮， 取出幼胚待用 ； 0029 (2) 初代培养 ： 将步骤 (1) 无菌条件下取出的幼胚接入前述的初代培养基中， 每天 转接 1 次 ； 3 天后改为每 3 天转接一次， 每次均转接至相同的新鲜培养基中， 共转接三次， 其 中前 7 天置于暗柜中培养， 后 5 天置于光暗周期为光 16h/ 暗 8h 的条件下培养， 光照强度 ： 40 50mol m-2s-1。培养温度为 252， 接种于初代培养基中， 该培养基包括磷酸二氢 钠 85g/L、 White s 维生素和 MS 盐类， 还有 30g/L 蔗糖、 50。
21、0mg/L 水解酪蛋白、 6.5 8.5g/L 琼脂 A， 加入 1.0 3.0mg/L BA 即苄氨基腺嘌呤、 0.01mg/LPicloram 即 4- 氨基 -3， 5， 6- 三 氯吡啶羧酸配制而成。培养 12 天， 胚根发育良好 ； 0030 (3) 胚根不定芽诱导 ： 将初代培养后胚根发育良好的幼胚接入附加 0.01 0.02mg/L Picloram、 1.0 3.0mg/L 6-BA、 蔗糖 20 30g/L、 琼脂 A 6.5 8.5g/L 的 MS 培 养基中， pH 值 5.7， 光照强度 ： 40 50mol m-2s-1。培养温度 252， 光照时间 16h/ 天， 。
22、培养 30 天， 得发育良好的不定芽 ； 0031 (4) 不定芽增殖培养 ： 将获得的不定芽长至 0.5cm 左右高时， 从胚根切下并接种到 前述的不定芽增殖培养基中培养， 30 天继代 1 次， 共继代 3 次， 每次增殖系数为 5 8。光 照培养， 光暗周期为光 16h/ 暗 8h， 光照强度为 40 50mol m-2s-1， 培养温度 252 ； 0032 (5) 生根诱导 ： 当前述的不定芽长至 0.5 1.0cm 高时， 切成单芽并接种到前述的 生根培养基中， 培养 30 天， 生根率达 50。光照培养， 光暗周期为光 16h/ 暗 8h， 光照强度 为 40 50molm-2s-1， 培养温度为 252。 0033 上述培养基中MS盐类和White s维生素及其它相关化学品可市售获得， 按商品说 明书配用， 为同行所公知。 说 明 书 。