《米尔贝霉素类似物、其制备方法和应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《米尔贝霉素类似物、其制备方法和应用.pdf（23页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104098585A43申请公布日20141015CN104098585A21申请号201410321563022申请日20140707C07D493/22200601C12P17/18200601A01N43/90200601A01P7/02200601A01P7/04200601C12R1/46520060171申请人浙江海正药业股份有限公司地址318000浙江省台州市椒江区外沙路46号72发明人张辉王继栋黄隽陈安良郑玲辉向文胜白骅54发明名称米尔贝霉素类似物、其制备方法和应用57摘要本发明涉及两个新的米尔贝霉素MILBEMYCIN类似物，即化合物1和化合物2。所述两个新。
2、的米尔贝霉素类似物比现有产业化的米尔贝霉素A3A4具有更强的杀虫活性，对小菜蛾、蚜虫及红蜘蛛都有很好的防治作用。本发明还涉及化合物1和化合物2的制备方法，包括如下步骤发酵培养阿维链霉菌STREPTOMYCESAVERMITILISSTRAINNEAU1069，得到含有化合物1和化合物2的发酵液，然后从发酵液中分离得到化合物1和化合物2。本发明还涉及含有化合物1和/或化合物2的农药组合物，以及化合物1和/或化合物2在制备用于防治农作物病虫害的农药组合物中的用途。51INTCL权利要求书2页说明书10页附图10页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书10页附图10页1。
3、0申请公布号CN104098585ACN104098585A1/2页21一种具有如下结构式的化合物其中，XYZ为CHCCH3，其为如下结构式的化合物1或者XYZ为CH2CCH2，其为如下结构式的化合物22一种制备权利要求1所述的化合物1和化合物2的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤1将保藏编号为CGMCCNO2946的阿维链霉菌STREPTOMYCESAVERMITILISSTRAINNEAU1069在培养基中进行发酵培养，得到含有化合物1和化合物2的发酵液；和2从步骤1所得发酵液中分离出化合物1和化合物2。权利要求书CN104098585A2/2页33根据权利要求2所述的方法，其特征在于。
4、，步骤1所述培养基含有以下组分玉米淀粉1020W/W，淀粉酶00010005W/W，黄豆饼粉15W/W，酵母粉052W/W。4根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤2包括将步骤1所得发酵液经预处理后得到粗提物，粗提物进行硅胶柱层析，分别得到含有化合物1的流分和含有化合物2的流分。5根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括将含有化合物1的流分和含有化合物2的流分进行反相制备柱层析，用含有水和有机溶剂的洗脱液进行洗脱，分别得到化合物1和化合物2。6根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述反相制备柱层析的填料为C18反相填料。7根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述。
5、有机溶剂选自甲醇、乙腈、丙酮或它们的任意比混合溶剂，优选甲醇和乙腈的混合溶剂。8一种药物组合物，含有权利要求1所述的化合物1和/或化合物2，以及一种或者多种常规载体和/或稀释剂。9权利要求1所述的化合物1和/或化合物2在制备用于防治农作物病虫害药物中的用途，优选的，所述农作物病虫害包括小菜蛾、蚜虫和红蜘蛛。权利要求书CN104098585A1/10页4米尔贝霉素类似物、其制备方法和应用技术领域0001本发明涉及两种新的米尔贝霉素类似物，即化合物1和化合物2，其制备方法以及作为杀虫剂在防治农作物病虫害中的应用。背景技术0002米尔贝霉素是由日本科学家首先从土壤放线菌STREPTOMYCESHYG。
6、ROSCOPICUSSUBSPAUREOLACRIMOSUS发酵培养液中分离得到的十六元大环内酯类化合物。美国专利US3,950,360首次公开了米尔贝霉素A3和A4，其结构式如下所示00030004米尔贝霉素与目前最广泛使用的生物农药阿维菌素比较，用量相当，但米尔贝霉素安全性更高，安全剂量范围更大张宝新等，世界农药，2009，31，1112。00052002年，美国EPA认定米贝尔霉素A3/A4是在草莓、西瓜、桃、梨、茄子、家庭观赏植物等中使用最安全的农药之一，日本、台湾还登记用于茶叶。2006年，米尔贝霉素A3/A4半合成的新化合物LEPIMECTIN也已登记用于防治蔬菜、水果害虫。相对于。
7、米贝尔霉素主要用于防治螨、蚜虫、蓟马、卷叶螟等，LEPIMECTIN对鳞翅目、同翅目害虫都具有很高的杀虫活性。米尔贝霉素类抗生素由于其高效的杀虫能力和低毒特性，其越来越受到国内外科学家的重视。因此，开发用量少、超高效、极低毒性、安全可靠、易降解、无环境污染的米尔贝霉素类驱虫药具有极具重要的现实意义。0006根据专利CN2009100716294公开的信息，菌株STREPTOMYCESAVERMITILISSTRAINNEAU1069在发酵过程中添加环己烷基羧酸可以产生多拉菌素类抗生素。除此之外，该菌还具有产米尔贝霉素类化合物的能力WANGMING,ETALTHEJOURNALOFANTIBIO。
8、TICS,2009,62,587591但上述研究均未发现本专利所要保护的米尔贝霉素类化合物。0007本发明主要涉及由STREPTOMYCESAVERMITILISSTRAINNEAU1069得到的新的米尔贝霉素类化合物，及它们的制备方法和应用。发明内容说明书CN104098585A2/10页50008本发明提供了一种具有如下结构式的化合物00090010其中，0011XYZ为CHCCH3，其为如下结构式的化合物100120013或者0014XYZ为CH2CCH2，其为如下结构式的化合物200150016本发明还提供了一种制备如前所述的化合物1和化合物2的方法，包括如下步骤00171将保藏编号为。
9、CGMCCNO2946的阿维链霉菌STREPTOMYCESAVERMITILIS说明书CN104098585A3/10页6STRAINNEAU1069在培养基中进行发酵培养，得到含有化合物1和化合物2的发酵液；和00182从步骤1所得发酵液中分离出化合物1和化合物2。0019其中，步骤1所述培养基含有以下组分玉米淀粉1020W/W，淀粉酶00010005W/W，黄豆饼粉15W/W，酵母粉052W/W。在一个具体实施例中，将阿维链霉菌STREPTOMYCESAVERMITILISSTRAINNEAU1069在PH7274，28下，在发酵培养基中培养610天，得到含有化合物1和化合物2的发酵液，所。
10、述发酵培养基包括玉米淀粉1020W/W，淀粉酶00010005W/W，黄豆饼粉15W/W，酵母粉052W/W，沸石粉0105W/W，MNSO400010005W/W，NA2MOO400010005W/W，COCL26H2O00010005W/W。0020其中，在步骤1之前，还包括种子培养的步骤。在一个具体实施例中，将阿维链霉菌STREPTOMYCESAVERMITILISSTRAINNEAU1069单菌落接种于种子培养基中，于PH7274，28，250RPM下培养3050小时，得到种子培养液，其中种子培养基含有玉米淀粉15W/W，黄豆饼粉052W/W，花生饼粉052W/W，酵母粉052W/W，。
11、COCL200010005W/W。0021其中，步骤2包括将步骤1所得发酵液经预处理后得到粗提物，粗提物进行硅胶柱层析分别得到含有化合物1的流分和含有化合物2的流分。接着，将含有化合物1的流分和含有化合物2的流分进行反相制备柱层析，用含有水和有机溶剂的洗脱液进行洗脱，分别得到化合物1和化合物2。0022其中，硅胶柱层析采用石油醚丙酮9075/1025V/V的混合溶剂进行洗脱，优选石油醚丙酮80/20V/V洗脱，分别得到含有化合物1的流分和含有化合物2的流分。0023其中，所述反相制备柱的填料为C18反相填料。0024其中，所述反相制备柱层析洗脱液中有机溶剂选自甲醇、乙腈、丙酮或它们的任意比混合。
12、溶剂，优选甲醇和乙腈的混合溶剂。优选的，用于纯化化合物1的反相制备柱层析的洗脱液为甲醇/乙腈/水1080/565/1525三者组成100的混合液；用于纯化化合物2的反相制备柱层析的洗脱液为甲醇/乙腈/水1080/1075/510三者组成100的混合液。0025所述的预处理方法可以采用本领域技术人员熟知的一些常规技术手段来处理，非限制性的，本发明所述的预处理可以采用如下步骤进行过滤发酵液中的菌丝体，用甲醇浸泡，然后浓缩甲醇浸泡液，用乙酸乙酯萃取浓缩液，将乙酸乙酯相浓缩至干得到油状的粗提物。0026本发明使用的阿维链霉菌STREPTOMYCESAVERMITILISSTRAINNEAU1069已于。
13、2009年03月11日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为CGMCCNO2943，命名为NEAU1069STREPTOMYCESAVERMITILIS。0027本发明进一步提供了如前所述的化合物1和化合物2的结构确认。分离得到的化合物1和化合物2，经过广泛的波谱研究分别确证了它们的结构。0028化合物鉴定涉及仪器如下0029核磁谱采用BRUKER公司的超导核磁共振仪BRUKERDRX400测定；0030质谱及高分辨质谱采用WATERS公司的QTOFMICROLCMSMS质谱仪测定；说明书CN104098585A4/10页70031紫外光谱采用VARIAN公司的VAR。
14、IANCARY300BIOSPECTROPHOTOMETER光谱仪测定；0032旋光采用PERKINELMER公司的PERKINELMER341POLARIMETER测定仪测定。0033化合物具体数据如下0034化合物1结构00350036性状无色油状物0037溶解性易溶解于氯仿、丙酮、甲醇，不溶于水0038比旋度433C003,ETOH0039分子式C31H42O80040质谱ESIMSM/Z565MNA0041高分辨质谱HIGHRESOLUTIONESIMS5652759计算值C31H42NAO8,56527720042紫外吸收光谱UVABSORPTIONSPECTRUMMAXETOHNM。
15、LOG2454010043氢谱1HNMR和碳谱13CNMR数据见表10044化合物2结构00450046性状无色油状物0047溶解性易溶解于氯仿、丙酮、甲醇，不溶于水0048比旋度733C003,ETOH说明书CN104098585A5/10页80049分子式C31H42O80050质谱ESIMSM/Z565MNA0051高分辨质谱HIGHRESOLUTIONESIMS5652743计算值C31H42NAO8,56527720052紫外吸收光谱UVABSORPTIONSPECTRUMMAXETOHNMLOG2454290053氢谱1HNMR和碳谱13CNMR数据见表10054表1化合物1和化合。
16、物2在CDCL3中的核磁数据氢谱，400MHZ；碳谱，100MHZ00550056说明书CN104098585A6/10页90057说明书CN104098585A7/10页100058氢谱数据中括号内的为耦合常数，单位为HZ0059本发明进一步提供了含有如前所述的化合物1和/或化合物2的农药组合物，所述组合物还含有一种或者多种常规载体和/或稀释剂。所述农药组合物的剂型可以为水分散粒剂、乳油、水悬浮剂、油悬浮剂、微乳剂或片剂。0060本发明进一步提供了如前所述的化合物1和/或化合物2在制备用于防治农作物病虫害药物中的用途。所述农作物病虫害包括小菜蛾、蚜虫和红蜘蛛。0061实验数据证明，本发明提供。
17、的化合物1和化合物2，与现有产业化的米尔贝霉素A3/A4相比，对小菜蛾、蚜虫和红蜘蛛等农作物害虫具有更强的杀灭活性，而且其安全性更高，易降解，具有非常好的市场应用前景。附图说明0062图1实施例2所得化合物1的高分辨质谱；0063图2实施例2所得化合物1的氢谱；0064图3实施例2所得化合物1的碳谱；0065图4实施例2所得化合物1的DEPT135谱；0066图5实施例2所得化合物1的紫外光谱；0067图6实施例2所得化合物2的高分辨质谱；0068图7实施例2所得化合物2的氢谱；0069图8实施例2所得化合物2的碳谱；0070图9实施例2所得化合物2的DEPT135谱；0071图10实施例2所。
18、得化合物2的紫外光谱。具体实施方式0072以下通过实施例对本发明进行进一步说明。必须指出，这些实施例是用于说明本发明，而不是对本发明的限制。0073实施例1发酵生产含有化合物1和化合物2的发酵液0074将STREPTOMYCESAVERMITILISSTRAINNEAU1069单菌落接种于种子培养基重量比W/W玉米淀粉25，黄豆饼粉08，花生饼粉1，酵母粉095，COCL20003，PH7274中，28，250RPM，摇床培养40小时得到种子液。以6的接种量将种子液转接于30KG发酵培养基重量比W/W玉米淀粉14，淀粉酶0003，黄豆饼粉20，酵母粉1，沸石粉02，MNSO400024，NA2。
19、MOO400024，COCL26H2O0002，PH7274中，28，250RPM，发酵罐中培养8天，得到含有化合物1和化合物2的发酵液。0075实施例2化合物1和化合物2的提取分离0076取实施例1得到的发酵液30KG，过滤得到菌丝体并用水洗涤两次，滤液弃之，水洗涤后菌丝体用10L甲醇浸泡，甲醇浸泡液浓缩至2L后，用2L乙酸乙酯萃取，重复三次，将得说明书CN104098585A108/10页11到的乙酸乙酯相浓缩至干得到26G油状粗提物。0077前述油状粗提物用硅胶柱青岛海洋化学集团,青岛,中国；100200目的硅胶层析进行分离，分别得到三个流分，流份AI95/5洗脱部分，流份AII90/1。
20、0和85/15洗脱部分和流份AIII80/20和75/25洗脱部分，其中流分AIII再用硅胶柱层析进行分离纯化，用石油醚/丙酮80/20,V/V洗脱，分段收集洗脱流分，TLC检测，合并洗脱液，得到流分I和流分II。0078进一步将流分I进行反相制备柱色谱纯化，条件如下0079液相系统AGILENT1100半制备高压液相色谱仪AGILENT,PALOALTO,CA,USA0080柱子ZORBAXECLIPSEXDBC185M,25094MMID；AGILENT,PALOALTO,CA,USA0081洗脱剂甲醇/乙腈/水72721V/V/V0082流速15ML/MIN0083检测波长254NM00。
21、84收集保留时间为173MIN的峰，得到12MG化合物1。0085进一步将流分II进行反相制备柱色谱纯化，条件如下0086液相系统AGILENT1100半制备高压液相色谱仪AGILENT,PALOALTO,CA,USA0087柱子ZORBAXECLIPSEXDBC185M,25094MMID；AGILENT,PALOALTO,CA,USA0088洗脱剂甲醇/乙腈/水69247V/V/V0089流速15ML/MIN0090检测波长254NM0091收集保留时间为301MIN的峰，得到8MG化合物2。0092实施例3化合物1和化合物2杀灭红蜘蛛活性测定0093采用浸虫法测定。选择室内饲养、生理状态。
22、一致的雌成螨虫。选取生长一致的蚕豆叶片，用打孔器做成直径2CM叶碟，叶背朝上置于培养皿中心的脱脂棉上，每皿3片叶蝶，用小号毛笔挑接雌成螨接种到叶碟上，每叶碟2030头，并加适量水，放于261，光照强度30004500LX、14H/D，RH5075的培养室内。2H后于体视显微镜下检查成螨数，每皿叶碟上螨的数量不低于50头。配制分别含有化合物1、化合物2和米尔贝霉素色谱纯度95，米尔贝霉素A3A43070的药液，其中每一种药液配成5份不同质量浓度的药液，其质量浓度分别为00005MG/L、0001MG/L、00025MG/L、0005MG/L、001MG/L。将带有螨的叶蝶依次浸入制备好的药液中并。
23、与用蒸馏水处理雌成螨进行对照，每个质量浓度浸入5S为一处理，每处理重复3次。0094将处理过的叶碟置于261，14H光周期的人工气候室培养24H，并在培养皿中加少量水保湿。24H后镜检并记录死亡及存活的螨数，检查时用毛笔轻触螨体，完全不动者判定为死亡。结果见表20095表2化合物1和化合物2杀灭红蜘蛛活性0096说明书CN104098585A119/10页120097A米尔贝霉素A3米尔贝霉素A43070V/V0098实施例4化合物1和化合物2杀灭小菜蛾活性测定0099供试昆虫为小菜蛾3龄幼虫在人工气候室条件下261，RH705，H/D14用改良的蛭石白菜苗法继代饲养的品系。采用叶碟浸液法。分。
24、别将化合物1、化合物2和米尔贝霉素色谱纯度95，米尔贝霉素A3A43070配制成05的制剂，兑水稀释成10、25、50、100、200个浓度梯度药液，置于烧杯中备用。0100将新鲜无污染的甘蓝叶片分别在各供试药液中浸渍约L0S。取出自然晾干后，放入铺有保湿滤纸的培养皿D9CM内，然后移入3龄小菜蛾幼虫，每处理重复3次，每皿20头试虫，并置于养虫室内恒温饲养。以清水处理为对照。检查48H试虫死亡情况并采用几率值法计算毒力回归方程及致死中浓度LC50MGL1值，结果见表3。0101表3化合物1和化合物2杀灭小菜蛾活性01020103A米尔贝霉素A3米尔贝霉素A43070V/V0104实施例5化合物。
25、1和化合物2杀灭菜蚜活性测定0105菜蚜，从田间十字花科蔬菜上采集没有施过药剂的带蚜叶片，剔除若蚜和有翅蚜，使蚜虫大小基本一致、密度适中，于温室内培养。采用叶碟浸虫浸液法。分别将化合物1、化合物2和米尔贝霉素色谱纯度95，米尔贝霉素A3A43070配制成05的制剂，兑水稀释成01、025、05、1、2个浓度梯度药液，置于烧杯中备用。0106将试虫叶片在药液中浸渍5S，取出晾干后放入垫有保湿滤纸的培养皿D9CM中。每个处理设3次重复，每个重复50头试虫，并置于养虫室内恒温饲养，以清水作对照。在室内条件下饲养24H后检查各浓度药液处理后的死亡虫数，并采用几率值法计算毒力回归方程及致死浓度LC50M。
26、GL1值，结果见表4。0107表4化合物1和化合物2杀灭菜蚜的活性0108说明书CN104098585A1210/10页130109A米尔贝霉素A3米尔贝霉素A43070V/V说明书CN104098585A131/10页14图1说明书附图CN104098585A142/10页15图2说明书附图CN104098585A153/10页16图3说明书附图CN104098585A164/10页17图4说明书附图CN104098585A175/10页18图5说明书附图CN104098585A186/10页19图6说明书附图CN104098585A197/10页20图7说明书附图CN104098585A208/10页21图8说明书附图CN104098585A219/10页22图9说明书附图CN104098585A2210/10页23图10说明书附图CN104098585A23。