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1、10申请公布号CN104212903A43申请公布日20141217CN104212903A21申请号201410470360822申请日20140915C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人江苏蒙特立生物技术有限公司地址214400江苏省无锡市江阴市砂山路85号A座1108号72发明人缪为民74专利代理机构天津滨海科纬知识产权代理有限公司12211代理人韩敏54发明名称双色FISH用于筛查肺癌融合基因的方法及试剂盒57摘要本发明涉及双色FISH用于筛查肺癌融合基因的方法及试剂盒，所述试剂盒包括两组双色探针，所述的两组双色探针是1ALK基因双色分离探针，2ALKE。
2、ML4双色融合探针；其中ALK为SEQIDNO1所示的核苷酸序列，EML4为SEQIDNO2所示的核苷酸序列。本发明的肺癌相关融合基因FISH检测方法根据检测到的荧光信号判断是否存在所述肺癌相关融合基因。本法设计周全，操作简单，特异性和敏感性高，可以快速，准确，直观检测出肺癌相关ALKEML4融合基因，检测结果准确可靠，从而可作为医师对肺癌进行精确分子分型的参考依据，适于大规模推广应用。51INTCL权利要求书1页说明书6页序列表10页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表10页10申请公布号CN104212903ACN104212903A1/1页21一。
3、种用于检测肺癌相关融合基因的两组双色FISH探针，其特征在于，所述的两组双色探针是1ALK基因双色分离探针，2ALKEML4双色融合探针；其中ALK为SEQIDNO1所示的核苷酸序列，EML4为SEQIDNO2所示的核苷酸序列。2根据权利要求1所述的两组双色FISH探针，其特征在于1ALK基因双色分离探针采用ALK基因3端探针红色荧光素标记，ALK基因5端探针绿色荧光素标记，2ALKEML4双色融合探针采用ALK基因红色荧光素标记，EML4基因绿色荧光素标记。3一种肺癌相关融合基因FISH检测试剂盒，其特征在于，包括两组双色探针，所述的两组双色探针是1ALK基因双色分离探针，2ALKEML4双。
4、色融合探针；其中ALK为SEQIDNO1所示的核苷酸序列，EML4为SEQIDNO2所示的核苷酸序列。4一种肺癌相关融合基因FISH检测试剂盒，其特征在于1ALK基因双色分离探针采用ALK基因3端探针红色荧光素标记，ALK基因5端探针绿色荧光素标记。2ALKEML4双色融合探针采用ALK基因红色荧光素标记，EML4基因绿色荧光素标记。5一种肺癌相关融合基因FISH检测方法，其特征在于，对肺癌组织石蜡切片进行常规预处理，然后采用权利要求1所述两组双色探针先后进行原位杂交，根据检测到的荧光信号判断是否存在所述肺癌相关融合基因。6根据权利要求5所述的肺癌相关融合基因FISH检测方法，其特征在于1AL。
5、K基因双色分离探针采用ALK基因3端探针ALK断裂热点3端红色荧光素标记，ALK基因5端探针ALK断裂热点5端绿色荧光素标记；2ALKEML4双色融合探针采用ALK基因红色荧光素标记，EML4基因绿色荧光素标记。权利要求书CN104212903A1/6页3双色FISH用于筛查肺癌融合基因的方法及试剂盒技术领域0001本发明涉及疾病相关基因检测技术领域，具体的，涉及肺癌相关融合基因检测技术领域，特别是指一种肺癌相关融合基因FISH检测方法和相关检测探针及试剂盒。背景技术0002肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显。
6、增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确，大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生有非常密切的关系。0003根据肺癌的生长、侵犯及转移速度和范围以及对化疗药物和放射治疗的敏感性，临床将肺癌分为小细胞肺癌SCLC及非小细胞肺癌NSCLC，后者占肺癌发病率80左右。只有合理应用手术、放疗、化疗、靶向治疗等方法，才能获得较好控制率，延长生存期。0004在过去的几十年里，虽然科学家们不断地探索非小细胞肺癌NSCLC化疗和放疗的方法，但取得的成果仍不能令人满意，例如晚期肺癌患者的平均生存时间仍未超过一年，疗效不确定，部分患者会出现。
7、一些毒副反应，如恶心、呕吐等胃肠道反应，影响了生活质量，甚至中断治疗。传统的细胞毒性化学药物可比作是“杀敌一千，自损八百”，因而许多患者对此是谈之色变，而靶向治疗正是科学家们几十年来致力于分辨癌细胞与正常细胞之间分子生物学差异的临床研究成果。0005所谓靶向治疗，就是通过基因或分子的选择，有针对性地杀死恶性肿瘤细胞，而几乎不影响正常细胞。这一划时代的生物肿瘤疗法的特点可以总结为4个字“高效低毒”。一方面，靶向治疗大大提高了肿瘤治疗的疗效；另一方面，靶向治疗减少患者在治疗中的副作用，提高生活质量。0006靶向治疗是指在分子生物学诊断的基础上，利用肺癌细胞和正常细胞之间存在的差异，有针对性地抑制肺。
8、癌细胞生长和增殖，例如，采用拮抗受体、抑制肿瘤生长所需的血管和阻断肿瘤生长的信号传导通路等方法来抑制肺癌细胞生长和增殖，从而达到治疗目的。0007ALKEML4融合基因是肺癌靶向治疗新宠。ALKEML4融合基因可见于多种肿瘤，例如间变性大细胞淋巴瘤、炎性成肌纤维细胞瘤、成神经细胞瘤和非小细胞肺癌NSCLC等，它是由第2号染色体短臂基因片段颠换INVERSION引起。ALKEML4的发现，代表了一种NSCLC的分子亚型，该组患者具有独特的临床特征不能从EGFRTKI靶向治疗中获益。接受EGFRTKI治疗的野生型患者和ALK阳性患者相比，后者可能更容易产生耐药。ALKEML4的发现促使肺癌治疗朝向。
9、“个体化”的目标迈近了一步。虽然ALKEML4融合基因仅有410的阳性率，在ALKEML4融合基因阳性的患者中，其抑制剂CRIZOTINIB的疗效可达60以上。美国FDA迅速批准CRIZOTINIB上市，对于ALKEML4融合基因阳性的患者是个福音。由于该基因较低的阳性率，所以在使用前应进行基因检测，只有在阳性的患者中才建议使用。说明书CN104212903A2/6页40008ALK基因，间变型淋巴瘤激酶基因，定位于染色体2P23。FISH可检测与ALK基因相关的染色体易位，包括EML4、TFG和KIF5B及其他基因融合。雅培VYSISALK双色分离探针试剂盒是第一个针对非小细胞肺癌患者新型亚。
10、类的伴随诊断试剂，适用于福尔马林固定、石蜡包埋的非小细胞肺癌组织切片样本。选择XALKORICRIZOTINIB药物治疗的必要条件是FISH检测ALK阳性的非小细胞肺癌。雅培VYSISALK双色分离探针试剂盒和辉瑞的XALKORICRIZOTINIB同时获得美国FDA批准。另外，此探针也可用于间变型大细胞淋巴瘤的辅助诊断。0009然而，目前美国FDA批准的ALKFISH检测试剂盒雅培VYSISALK双色分离探针试剂盒仅能检测ALK基因的断裂，但不能判断ALK断裂后是否和EML4发生融合，因此提供给临床医生的信息不够全面，不利于肺癌的精确分子分型和靶向治疗。发明内容0010本发明的主要目的就是针。
11、对以上存在的问题与不足，提供一种肺癌相关融合基因FISH检测的改良方法，探针及试剂盒。该法设计周全，操作简单，特异性和敏感性高，可以快速，准确，直观地测出肺癌相关ALKEML4融合基因，检测结果准确可靠，从而可作为医师对肺癌进行分子分型的参考依据，适用于大规模推广应用。0011为了实现上述目的，0012本发明一方面提供一种用于检测肺癌相关融合基因的两组双色FISH探针，其特征在于，所述的两组双色探针是1ALK基因双色分离探针，2ALKEML4双色融合探针；其中ALK为SEQIDNO1所示的核苷酸序列，EML4为SEQIDNO2所示的核苷酸序列。0013更佳地，1ALK基因双色分离探针采用ALK。
12、基因3端探针红色荧光素标记，ALK基因5端探针绿色荧光素标记，2ALKEML4双色融合探针采用ALK基因红色荧光素标记，EML4基因绿色荧光素标记。0014本发明另一方面提供一种肺癌相关融合基因FISH检测试剂盒，其特征在于，包括两组双色探针，所述的两组双色探针是1ALK基因双色分离探针，2ALKEML4双色融合探针；其中ALK为SEQIDNO1所示的核苷酸序列，EML4为SEQIDNO2所示的核苷酸序列。0015更佳地，该试剂盒中，1ALK基因双色分离探针采用ALK基因3端探针红色荧光素标记，ALK基因5端探针绿色荧光素标记。2ALKEML4双色融合探针采用ALK基因红色荧光素标记，EML4。
13、基因绿色荧光素标记。0016本发明的另一方面提供一种肺癌相关融合基因FISH检测方法，包括如下步骤对肺癌组织石蜡切片进行常规预处理，然后采用上述两组双色探针先后进行原位杂交，根据检测到的荧光信号判断是否存在所述肺癌相关融合基因。0017具体地说，第一步用ALK基因双色分离探针进行杂交，确定ALK基因是否断裂。第二步，选择ALK基因断裂的样本，用ALKEML4双色融合探针进行第二次杂交检测。以确定ALK断裂后是否和EML4基因形成了融合基因。0018更佳地，1ALK基因双色分离探针采用ALK基因3端探针ALK断裂热点3端红色荧光素标记，ALK基因5端探针ALK断裂热点5端绿色荧光素标记；2ALK。
14、EML4双色融合探针采用ALK基因红色荧光素标记，EML4基因绿色荧光素标记。说明书CN104212903A3/6页50019本发明的有益效果在于本发明的肺癌相关融合基因FISH检测方法通过对肺癌组织石蜡切片进行常规预处理，然后采用两组双色探针进行原位杂交，根据检测到的荧光信号判断是否存在所述肺癌相关融合基因。本法设计周全，操作简单，特异性和敏感性高，可以快速，准确，直观检测出肺癌相关ALKEML4融合基因，检测结果准确可靠，从而可作为医师对肺癌进行精确分子分型的参考依据，适于大规模推广应用。具体实施方式0020为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。下列具体实施例采用的主要。
15、试剂，仪器和操作步骤如下0021实施例10022一、探针DNA的获取00231划线接种将携带有ALK基因和EML4的BAC菌种划线接种于含有抗生素氯霉素的琼脂平板上，37培养过夜约14小时。00242初始培养次日挑取生长状态良好的单克隆菌种，接种于2ML含有抗生素氯霉素的LB液体培养基中，放入37摇床，设置摇床速度约200RPM，培养68小时。00253过夜培养每1ML菌液转移至200ML培养体系，放置于37摇床，转速200RPM，培养过夜约1416小时。00264次日按照QIAGEN公司质粒大量提取试剂盒操作说明进行DNA大量提取和纯化。0027二、探针标记00281酶切DNA00291按照。
16、以下反应体系对目的DNA进行酶切0030003137孵育1小时，加入1L的05M的乙二胺四乙酸ETHYLENEDIAMINETETRAACETICACID，EDTAPH75终止反应，混匀，瞬时离心。00322沉淀DNA加入1/10体积的3M乙酸钠，2倍体积100乙醇20，混匀，瞬时离心，70，沉淀约2小时。00333离心14000RPM，4，20分钟。用枪尖小心吸弃上清，加入100UL70乙醇4，混匀，离心14000RPM，4，15分钟。00344用枪尖小心吸弃上清，干燥沉淀10分钟。用10L的10MM的TRISHCLPH85说明书CN104212903A4/6页6重悬后在振荡器上连续震荡至少。
17、5小时，转速800，将溶解好的DNA放在4保存直至连接反应。00352连接反应0036采用切口平移法对酶切好的DNA进行荧光素标记。0037方法如下0038取避光的EP管，先加入水，最后加入DNASE10NG/L和DNAPOLYMERASE酶始终放在冰盒或冰上按如下反应体系加液00390040混匀，瞬时离心，14孵育过夜912小时。0041次日加入5UL的05M的EDTAPH75终止反应，混匀，瞬时离心，连接好的DNA放在20避光保存。00423沉淀DNA00431对标记好的DNA探针进行沉淀加去离子水至总体积为300L，再加入3M的乙酸钠1/20总体积，再加入100乙醇20混匀，瞬时离心，2。
18、0，沉淀过夜。00442次日离心14000RPM，4，20分钟。用枪尖小心吸弃上清，加入100UL的70乙醇4，混匀，离心14000RPM，4，15分钟。用枪尖小心吸弃上清，室温避光干燥沉淀10分钟。00453加入10UL的杂交缓冲液，在振荡器上连续震荡至少6小时，转速800，将溶解好的探针放在4保存直至后续实验。00464将3制作好的探针从4中拿出，放入56中孵育1小时，室温离心14000RPM，20分钟，将离心好的探针转移至一个新的避光EP管中，4中保存，若长期不用探针应保存于20。0047三、杂交反应00481肺癌组织石蜡切片预处理程序00491将载玻片浸入23氨基丙基三乙氧基硅烷丙酮溶。
19、液中5分钟。随后在丙酮及蒸馏水中漂洗，自然干燥载玻片。00502从福尔马林固定石蜡包埋的肺癌组织中获取多块4微米切片，分别置于以上经说明书CN104212903A5/6页7氨基丙基三乙氧基硅烷处理过的载玻片上。00513将组织片置于65下过夜烘烤00524将组织切片浸入二甲苯中室温脱蜡2次。每次10分钟。随后浸入100乙醇中5分钟。00535将组织切片依次室温下置于100乙醇，85乙醇，70乙醇中各2分钟复水。将组织切片室温浸入去离子水3分钟，用无绒纸巾试干。0054650C下用30W/V酸性亚硫酸钠SODIUMBISULTE处理组织切片2030分钟。00557室温下于2XSSC溶液中漂洗2次。
20、，每次5分钟。00568取04ML蛋白酶K储存液20MG/ML溶于40ML2XSSC得到蛋白酶K工作液200G/ML。将组织切片浸入蛋白酶K工作液中37孵育2030分钟。00579组织切片经蛋白酶K处理后，于2XSSC中漂洗2次，每次5分钟。005810将组织切片浸入01MHCL中室温浸泡510分钟。于2XSS溶液中漂洗2次，每次5分钟。005911将组织切片玻片依次浸入20预冷的70，85，100乙醇中各2分钟脱水。006012将组织切片室温浸入丙酮溶液2分钟。006113自然干燥玻片。006214加热玻片至56。00632杂交0064将玻片放入杂交仪中，8490变性5分钟，47杂交过夜。0。
21、0653洗涤0066将杂交过夜的片子移去盖玻片，放在47的4SSPE中洗涤5分钟，55的4SSPE中洗涤10分钟。00674梯度乙醇中脱水70，85，2100乙醇，3分钟/梯度。00685放入己烷异丙醇6040混合液中10分钟，再放入异丙醇中5分钟，最后放入100的乙醇中5分钟。00696空气中干燥片子约10分钟后加入810L的DAPI，加上盖玻片，避免产生气泡，指甲油封片。00707镜检0071在荧光显微镜下观察，利用蓝色滤镜观察绿色信号，利用绿色滤镜观察红色信号，利用双通道滤镜观察红绿融合的黄色信号。选择背景干净，杂交信号强烈，细胞核大小均一无重叠，核边界清晰，DAPI染色均一的区域拍照记。
22、录。00721结果判断00731ALK基因双色分离探针ALK基因双色分离探针采用ALK基因3端探针红色荧光素标记，ALK基因5端探针绿色荧光素标记。在ALK阴性的肺癌细胞上可以观察到2个红绿色融合融合部分呈现黄色的信号；而在ALK阳性的肺癌细胞上可以观察到一个红绿色融合融合部分呈现黄色的信号，另外2个分离的红色和绿色信号，此结果表明ALK呈现断裂状态。说明书CN104212903A6/6页800742对ALK呈现断裂状态的肺癌样本，再进行第二组ALKEML4双色融合探针的检测。ALKEML4双色融合探针采用ALK基因红色荧光素标记，EML4基因绿色荧光素标记。ALKEML4融合基因阴性的细胞呈。
23、现2个分离的红色和绿色信号。说明ALK基因断裂后和EML4基因以外的基因形成了融合基因。而ALKEML4融合基因阳性的肺癌细胞则呈现一个红绿色融合融合部分呈现黄色的信号，和另外2个红绿色分离的信号，此结果表明ALK基因断裂后确实和EML4基因形成了融合基因。0075在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。说明书CN104212903A1/10页900010002序列表CN104212903A2/10页100003序列表CN104212903A103/10页110004序列表CN104212903A114/10页120005序列表CN104212903A125/10页130006序列表CN104212903A136/10页140007序列表CN104212903A147/10页150008序列表CN104212903A158/10页160009序列表CN104212903A169/10页170010序列表CN104212903A1710/10页18序列表CN104212903A18。