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1、(10)授权公告号 CN 102048022 B (45)授权公告日 2012.08.15 CN 102048022 B *CN102048022B* (21)申请号 201010562438.0 (22)申请日 2010.11.25 A23J 3/16(2006.01) A23J 3/34(2006.01) (73)专利权人 广州合诚实业有限公司 地址 510530 广东省广州市云埔 （白云） 工业 区云诚路 8 号 (72)发明人 王才华 周雪松 曾建新 蒋文真 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 裘晖 CN 1840681 A,2006.10.04。
2、, 全文 . CN 101492663 A,2009.07.29, 全文 . CN 101240311 A,2008.08.13, 全文 . EP 0976331 A2,2000.02.02, 全文 . CN 1461597 A,2003.12.17, 全文 . CN 101113168 A,2008.01.30, 全文 . 管风波等 . 大豆肽的生产及其苦味脱除方法 的研究 .山 东 轻 工 业 学 院 学 报 .2008, 第 22 卷 ( 第 3 期 ),18-20. 冯红霞等 . 苦味肽的形成及脱苦方法 的研究 .食品科学 .2002, 第 23 卷 ( 第 5 期 ),151-154。
3、. (54) 发明名称 一种无水解味、 无苦味的大豆多肽及其制备 方法与应用 (57) 摘要 本发明公开一种无水解味、 无苦味的大豆多 肽及其制备方法与应用。本发明首先利用固态微 生物发酵法产生大量的蛋白酶系， 利用微生物发 酵产生的蛋白酶系除去多肽中的苦味和水解味， 保证大豆多肽具有良好的风味， 并将部分大豆蛋 白分解成小分子多肽 ； 然后将大豆蛋白配制成溶 解液， 由固态发酵体系转化为液态酶解体系， 通过 提高酶解体系温度， 抑制微生物生长， 加入高效蛋 白酶， 利用酶解法的高效、 稳定和专一性进一步将 多肽水解成分子量更小的大豆多肽。本发明中大 豆蛋白的水解度为 20 40， 得到的大豆。
4、多肽 平均长度为 2.5 4.0 个氨基酸， 平均分子量在 1,000Da 以下， 无苦味、 无水解味。该大豆多肽可 直接添加到食品中， 也可应用到化妆品中。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王辉 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 一种无水解味、 无苦味的大豆多肽的制备方法， 其特征在于包括如下步骤 ： （1） 润湿 ： 用相当于大豆蛋白质量 50 200% 的水充分润湿大豆蛋白， 并搅拌均匀 ； （2） 湿蒸 ： 将润湿的大豆蛋白于 100 121湿蒸 10 。
5、60min ； （3） 冷却 ： 将步骤 （2） 湿蒸处理过的大豆蛋白通风冷却， 温度降至 30以下备用 ； （4） 接种 ： 将相当于大豆蛋白质量 0.05 0.20% 的曲霉与相当于曲霉质量 20 100 倍 的大豆分离蛋白充分混匀 ； 然后将均匀分散在大豆分离蛋白中的菌种与步骤 （3） 处理后的 大豆蛋白原料充分混匀， 接种完成 ； （5） 发酵 ： 将接种好的大豆蛋白于 25 35、 相对湿度 85 95% 发酵 20 70h ； （6） 酶解 ： 将发酵结束的大豆蛋白配制成质量百分比为 5 15% 的溶解液， 采用高速 剪切方法将大豆蛋白充分分散 ； 接着在不断搅拌的条件下， 将剪切。
6、后的溶解液加热至 45 60， 将悬浮液 pH 值调节至 7 9 ； 再加入相当于大豆蛋白质量 0.2 2% 的蛋白酶， 酶解 的条件为于 45 60酶解时间 6 24h ； （7） 后期处理 ： 将步骤 （6） 制备得到的酶解液加热， 加热的条件为 90以上保持 5 30min ； 接着离心， 将上清液超滤， 浓缩、 干燥， 得到无水解味、 无苦味的大豆多肽。 2. 根据权利要求 1 所述无水解味、 无苦味的大豆多肽的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中所述大豆蛋白为豆粕或大豆浓缩蛋白中的一种或两种 ； 步骤 （1） 中所述水的用量为相当于大豆蛋白质量 120%。 3. 根据权利要求。
7、 1 所述无水解味、 无苦味的大豆多肽的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中所述湿蒸的条件为 121湿蒸 20min。 4. 根据权利要求 1 所述无水解味、 无苦味的大豆多肽的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （4） 中所述大豆分离蛋白的用量为相当于曲霉质量 50 倍质量 ； 步骤 （4） 中所述曲霉为黑曲霉或米曲霉中的至少一种。 5. 根据权利要求 4 所述无水解味、 无苦味的大豆多肽的制备方法， 其特征在于 ： 所述黑 曲霉为黑曲霉 AS3.350 ； 所述米曲霉为米曲霉 A-9005。 6. 根据权利要求 1 所述无水解味、 无苦味的大豆多肽的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 。
8、（6） 中当所述大豆蛋白为豆粕时， 先将豆粕进行粉碎， 再配制溶解液 ； 步骤 （6） 中所述溶解液的浓度为质量百分比 10% ； 步骤 （6） 中所述 pH 值为通过浓度为 3 5mol/L 的氢氧化钠溶液进行调节 ； 步骤 （6） 中所述的蛋白酶为碱性蛋白酶 ； 步骤 （6） 中所述的蛋白酶为先溶解后再加入溶解液中 ； 步骤 （6） 中所述酶解的时间为 12h。 7. 根据权利要求 1 所述无水解味、 无苦味的大豆多肽的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （7） 中所述加热的条件为 90以上保持 15min ； 步骤 （7） 中所述离心的条件为以 5000rpm 的速度离心 5min ； 步。
9、骤 （7） 中所述超滤的条件为通过 1000 道尔顿的 PS 膜超滤器进行超滤。 8. 一种无水解味、 无苦味的大豆多肽， 通过权利要求 1 7 任一项所述制备方法得到。 9. 权利要求 8 所述的无水解味、 无苦味的大豆多肽在食品领域或化妆品领域中的应 用。 权 利 要 求 书 CN 102048022 B 2 1/5 页 3 一种无水解味、 无苦味的大豆多肽及其制备方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及一种大豆蛋白的精深加工工艺， 具体涉及一种无水解味、 无苦味的大 豆多肽及其制备方法与应用。 背景技术 0002 大豆多肽是以大豆蛋白为原料， 经过水解工艺将大豆蛋白分子切割成若干小分子。
10、 肽， 再经过分离、 精制等过程得到的混合物。研究表明， 大豆多肽能够抗高血压、 抗胆固醇、 抗血栓形成， 促进脂肪代谢， 防止动脉硬化， 增强肌肉运动能力， 促进肌红细胞复原， 还具有 帮助人体恢复体力， 促进矿物质吸收等功能。 因此， 大豆多肽在功能性食品领域具有十分广 阔的应用前景。 0003 目前， 通过微生物发酵法制备大豆多肽是一种常用的方法。利用微生物在生长 繁殖过程中产生大量的蛋白酶系， 催化大豆多肽从大豆蛋白分子中释放出来， 并对大豆多 肽中某些苦味多肽进行修饰、 转移和重组， 使大豆多肽具有更好的溶解性， 无苦味， 增强其 应用价值。例如， 中国专利 生物发酵法分离大豆多肽、。
11、 蛋白胨、 氨基酸的工艺 ( 专利号 ： ZL200510042337.X) 提出利用液态发酵法生产大豆多肽、 复合氨基酸、 蛋白胨。但微生物发 酵法的缺点在于， 水解过程难以控制， 所得目标产物的分子量较大， 液态发酵法制备大豆多 肽的成本较高。目前工业化生产大豆多肽多采用微生物固态发酵法， 产品主要应用于动物 营养领域， 用于食品领域较少见报道。 0004 另一种常用的大豆多肽生产方法是酶解法， 通常可选用胰蛋白酶、 胃蛋白酶等动 物蛋白酶， 也可使用菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶等植物蛋白酶， 或者微生物酶等。 采用酶解法 生产的多肽产品安全性高， 生产条件温和、 易控制， 水解效率高， 蛋白回。
12、收率高， 成本低廉。 因此， 目前已成为食品工业大豆多肽生产的主要方法。采用酶解工艺制备大豆多肽的不足 之处在于， 获得的多肽产物往往风味不佳， 具有不同程度的苦味和水解味， 这严重限制了大 豆多肽在食品中的应用。由于大豆多肽风味不佳， 市面上一些添加大豆多肽的功能性食品 要么大豆多肽含量不高， 要么采用较浓郁的风味物质掩盖大豆多肽苦味和水解味。 因此， 针 对大豆多肽的苦味和水解味， 一些专利提出了解决方案。 中国专利 无苦味大豆多肽的生产 工艺 ( 专利号 ： ZL02115912.2) 针对酶解工艺制备大豆多肽易产生苦味， 提出了用双酶分 段水解， 并结合高岭土吸附制备无苦味多肽。 但用。
13、高岭土或活性炭等吸附剂具有非选择性， 并不能完全吸附苦味多肽， 同时也会吸附非苦味的多肽， 从而降低多肽的回收率。 中国专利 一种无苦味的大豆多肽及其生产方法 ( 专利号 ： ZL 200310112130.6) 提出了用自制毛霉 蛋白酶提取液和碱性蛋白酶酶解工艺， 可以得到无苦味的大豆多肽。这种自制毛霉蛋白酶 提取液是一种十分具有商业潜力的蛋白酶， 但生产的可行性和商业成本还有待于进一步的 研究与探索。 发明内容 0005 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足， 提供一种无水解味、 无苦味 说 明 书 CN 102048022 B 3 2/5 页 4 的大豆多肽的制备方法。该制备方法。
14、以大豆蛋白为原料， 通过结合微生物发酵法和酶解法 制备大豆多肽， 是大豆蛋白的精深加工技术。 0006 本发明的另一目的在于提供通过所述方法得到的大豆多肽。 0007 本发明的再一目的在于提供所述大豆多肽的应用。 0008 本发明的目的可以通过如下措施来实现 ： 一种无水解味、 无苦味的大豆多肽的制 备方法， 包括如下几个步骤 ： 0009 (1) 润湿 ： 精选无发霉、 无变质的优质大豆蛋白， 将相当于大豆蛋白质量 50 200 (w/w 质量百分比， 下同 ) 的水充分润湿大豆蛋白， 并搅拌均匀 ； 0010 (2) 湿蒸 ： 将润湿的大豆蛋白于 100 121湿蒸 10 60min ； 。
15、湿蒸的目的是让大 豆蛋白在高温下变性， 分子结构充分展开， 有利于下一步发酵工艺 ； 同时高温湿蒸可以有效 地杀死附着于大豆蛋白的微生物， 减少发酵杂菌污染 ； 0011 (3) 冷却 ： 将步骤 (2) 湿蒸处理过的大豆蛋白通风冷却， 温度降至 30以下备用 ； 0012 (4) 接种 ： 将相当于大豆蛋白质量 0.05 0.20的曲霉与相当于曲霉质量 20 100 倍的大豆分离蛋白充分混匀， 大豆分离蛋白的作用为稀释菌种和补充蛋白 ； 然后将均 匀分散在大豆分离蛋白中的菌种与步骤 (3) 处理过的大豆蛋白原料充分混匀， 接种完成 ； 0013 (5) 发酵 ： 将接种好的大豆蛋白于 25 。
16、35、 相对湿度 85 95发酵 20 70h ； 发酵可让曲霉充分生产蛋白酶系， 使部分大豆蛋白分解成小分子多肽 ； 0014 (6) 酶解 ： 将发酵结束的大豆蛋白配制成质量百分比为 5 15的溶解液， 采用 高速剪切方法将大豆蛋白充分分散 ； 接着在不断搅拌的条件下， 将剪切后的溶解液加热至 45 60， 将悬浮液 pH 值调节至 7 9 ； 再加入相当于大豆蛋白质量 0.2 2的蛋白酶， 酶解的条件为于 45 60酶解时间 6 24h， 酶解过程中， 保持酶解液 pH 值恒定 ； 在这一 过程中， 添加的蛋白酶和先前发酵过程中产生的蛋白酶系同时催化蛋白质水解， 同时， 由于 酶解温度较。
17、高， 曲霉生长受到抑制 ； 0015 (7) 后期处理 ： 将步骤 (6) 制备得到的酶解液加热， 加热的条件为 ： 90以上保持 5 30min， 加热的目的是钝化蛋白酶的活性 ； 接着离心， 将上清液超滤， 浓缩、 干燥， 得到无 水解味、 无苦味的大豆多肽 ； 0016 步骤 (1) 中所述大豆蛋白为豆粕或大豆浓缩蛋白中的一种或两种 ； 更优选非转基 因豆粕 ； 0017 步骤 (1) 中所述水的用量优选为相当于大豆蛋白质量 120 ； 0018 步骤 (2) 中所述湿蒸的条件优选为 121湿蒸 20min ； 0019 步骤 (4) 中所述大豆分离蛋白的用量优选为相当于曲霉质量 50 。
18、倍质量 ； 0020 步骤 (4) 中所述曲霉优选黑曲霉或米曲霉中的至少一种 ； 0021 所述黑曲霉优选为黑曲霉 AS3.350 ； 0022 所述米曲霉优选为米曲霉 A-9005 ； 0023 步骤 (6) 中当所述大豆蛋白为豆粕时， 先将豆粕进行粉碎， 再配制溶解液 ； 0024 步骤 (6) 中所述溶解液的浓度优选为质量百分比 10 ； 0025 步骤 (6) 中所述 pH 值优选通过浓度为 3 5mol/L 的氢氧化钠溶液进行调节 ； 0026 步骤 (6) 中所述的蛋白酶优选碱性蛋白酶 ； 0027 步骤 (6) 中所述的蛋白酶优选先溶解后再加入溶解液中 ； 说 明 书 CN 10。
19、2048022 B 4 3/5 页 5 0028 步骤 (6) 中所述酶解的时间优选为 12h ； 0029 步骤 (7) 中所述加热的条件优选为 90以上保持 15min ； 0030 步骤 (7) 中所述离心的条件优选为以 5000rpm 的速度离心 5min ； 0031 步骤 (7) 中所述超滤的条件优选通过 1000 道尔顿的 PS 膜超滤器进行超滤 ； 0032 一种水解味、 无苦味的大豆多肽， 通过上述制备方法得到 ； 0033 所述水解味、 无苦味的大豆多肽可应用于食品领域， 如功能性食品、 运动型饮料 等 ； 0034 所述水解味、 无苦味的大豆多肽也可以用于化妆品领域， 这。
20、是由于大豆多肽的溶 解性好、 吸湿性和保湿性强， 易溶解于多种化妆品溶剂中， 因此可以应用于化妆品中。 0035 本发明的发明原理 ： 本发明首先利用固态微生物发酵法产生大量的蛋白酶系， 利 用微生物发酵产生的蛋白酶系除去多肽中的苦味和水解味， 保证大豆多肽具有良好的风 味， 并将部分大豆蛋白分解成小分子多肽 ； 然后将大豆蛋白配制成溶解液， 由固态发酵体系 转化为液态酶解体系， 通过提高酶解体系温度， 抑制微生物生长， 并加入高效蛋白酶， 利用 酶解法的高效、 稳定和专一性进一步将多肽水解成分子量更小的大豆多肽。本发明中大豆 蛋白的水解度DH为2040， 得到的大豆多肽平均肽链长度为2.54。
21、.0个氨基酸， 平均 分子量在 1,000 道尔顿以下， 无苦味、 无水解味。该大豆多肽可直接添加到酸性饮料、 运动 型饮料、 功能性食品， 也可以应用到化妆品中。 0036 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果 ： 本发明充分结合了微生物发酵 法和酶解法的优点， 有效地克服单一采用微生物发酵法或酶解法制备多肽的缺点， 工艺稳 定可靠， 得到大豆多肽平均肽链长度为 2.5 4.0 个氨基酸， 平均分子量在 1,000 道尔顿 以下， 无苦味、 无水解味， 与现有技术相比较， 本发明制得的水解味、 无苦味的大豆多肽风味 好， 成本低。 具体实施方式 0037 下面结合实施例对本发明作进一步详。
22、细的描述， 但本发明的实施方式不限于此。 0038 实施例 1 0039 (1) 润湿 ： 选用非转基因豆粕为原料， 用相当于豆粕质量 50的自来水充分润湿 ； 0040 (2) 湿蒸和冷却 ： 将润湿的豆粕于 100湿蒸 60min ； 湿蒸结束后， 将豆粕取出， 通 风冷却至 30 ； 0041 (3) 接种 ： 准确称取相当于豆粕质量 0.05的米曲霉 3.042 孢子 ( 广州市微生物 研究所)， 将其与相当于米曲霉3.042孢子质量50倍的大豆分离蛋白粉充分混合后， 再与豆 粕混匀， 接种完成 ； 0042 (4) 发酵 ： 将接种过的豆粕在 30、 相对湿度 95的环境下发酵 70。
23、h ； 0043 (5) 酶解 ： 将发酵后的豆粕粉碎， 用去离子水将粉碎后的豆粕配制成质量百分比 5的溶解液， 用胶体磨将溶解液剪切均匀 ； 用浓度为 5mol/L 的氢氧化钠溶液将悬浮液 pH 值调节至 7 ； 称取相当于豆粕质量 0.2的 Alcalase 2.4L( 诺维信生物技术有限公司商品 酶 )， 均匀地分散到溶解液中， 酶解温度 45， 酶解时间 6h， 酶解过程中保持酶解液 pH 恒 定 ； 0044 (6) 后期处理 ： 酶解结束后， 将酶解液的温度进一步加热至 90， 并保持 5min， 钝 说 明 书 CN 102048022 B 5 4/5 页 6 化蛋白酶的活性。然。
24、后将酶解液 5000rpm 离心 5min， 弃去沉淀的蛋白质， 取上清 ； 上清液通 过1000道尔顿的PS膜超滤器超滤。 最后， 透过液通过进一步的浓缩、 喷雾干燥， 即得到大豆 多肽。大豆蛋白的水解度 DH 为 23 ( 采用 pH-stat 法测定多肽水解度， 以下实施例同 )， 大豆多肽的平均肽链长度为 4.4 个氨基酸， 平均分子量为为 652 道尔顿 ( 采用高效凝胶过 滤色谱 GPC， TSKgel G2000 凝胶柱， 流动相 ： 乙腈、 水和三氟乙酸按体积比 20 80 0.1 混 合得到， 检测波长 ： 220nm， 流速 ： 0.5ml/min， 进样体积 ： 20l，。
25、 以下实施例同 )， 蛋白回收率 为 52 ( 即所得到大豆多肽含量占原料重量百分比 )， 无苦味 ( 由 20 人组成感官评价小组 对产品检验感官检验， 以下实施例同)、 无水解味(由20人组成感官评价小组对产品检验感 官检验， 以下实施例同 )。 0045 实施例 2 0046 (1) 润湿 ： 选用非转基因豆粕为原料， 用相当于豆粕质量 200的自来水充分润 湿 ； 0047 (2) 湿蒸和冷却 ： 将润湿的豆粕于 121湿蒸 10min ； 湿蒸结束后， 将豆粕取出， 通 风冷却至 30 ； 0048 (3)接种 ： 准确称取相当于豆粕质量0.15的米曲霉A-9005孢子(广州市微生物。
26、 研究所)， 与相当于米曲霉A-9005质量20倍的大豆分离蛋白粉充分混合后， 再与豆粕混匀， 接种完成 ； 0049 (4) 发酵 ： 将接种过的豆粕在 30、 相对湿度 95的环境下发酵 20h ； 0050 (5) 酶解 ： 将发酵后的豆粕粉碎， 用去离子水将粉碎后的豆粕配制成质量百分比 15的溶解液， 用胶体磨将溶解液剪切均匀 ； 用浓度为 3mol/L 的氢氧化钠溶液将悬浮液 pH 值调节至 8 ； 称取相当于豆粕质量 0.5的 Alcalase( 诺维信生物技术有限公司商品酶 )， 均匀地分散到溶解液中， 酶解温度 50， 酶解时间 24h， 酶解过程中保持酶解液 pH 恒定 ； 。
27、0051 (6) 后期处理 ： 酶解结束后， 将酶解液的温度进一步加热至 90， 并保持 30min， 钝 化蛋白酶的活性。然后将酶解液 5000rpm 离心 5min 分离， 弃去沉淀的蛋白质， 取上清 ； 上清 液通过 1000 道尔顿的 PS 膜超滤器超滤。最后， 透过液通过进一步的浓缩、 喷雾干燥， 即得 到大豆多肽。大豆蛋白的水解度 DH 为 27， 大豆多肽的平均肽链长度为 3.7 个氨基酸， 平 均分子量为为 554 道尔顿， 蛋白回收率为 71， 无苦味、 无水解味。 0052 实施例 3 0053 (1) 润湿 ： 选用大豆浓缩蛋白为原料， 用相当于大豆浓缩蛋白质量 120的。
28、自来水 充分润湿 ； 0054 (2)湿蒸和冷却 ： 将润湿的大豆浓缩蛋白于121湿蒸20min ； 湿蒸结束后， 将大豆 浓缩蛋白取出， 通风冷却至 30 ； 0055 (3)接种 ： 准确称取相当于大豆浓缩蛋白质量0.2的米曲霉3.042孢子(广州市 微生物研究所 )， 与相当于米曲霉 3.042 孢子质量 100 倍的大豆分离蛋白粉充分混合后， 再 与豆粕混匀， 接种完成 ； 0056 (4) 发酵 ： 将接种过的大豆浓缩蛋白在 30、 相对湿度 95的环境下发酵 48h ； 0057 (5) 酶解 ： 用去离子水将发酵后的大豆浓缩蛋白配制成质量百分比 10的溶解 液， 用胶体磨将溶解液。
29、剪切均匀 ； 用浓度为 5mol/L 的氢氧化钠溶液将悬浮液 pH 值调节至 9 ； 称取相当于大豆浓缩蛋白质量2.0的Alcalase(诺维信生物技术有限公司商品酶)， 均 说 明 书 CN 102048022 B 6 5/5 页 7 匀地分散到溶解液中， 酶解温度 60， 酶解时间 12h， 酶解过程中保持酶解液 pH 恒定 ； 0058 (6) 后期处理 ： 酶解结束后， 将酶解液的温度进一步加热至 90， 并保持 15min， 钝 化蛋白酶的活性。然后将酶解液高速 5000rpm 离心 5min 分离， 弃去沉淀的蛋白质， 取上清 ； 上清液通过 1000 道尔顿的 PS 膜超滤器超滤。最后， 透过液通过进一步的浓缩、 喷雾干燥， 即得到大豆多肽。大豆蛋白的水解度 DH 为 33， 大豆多肽的平均肽链长度为 3.0 个氨基 酸， 平均分子量为为 420 道尔顿， 蛋白回收率为 65， 无苦味、 无水解味。 0059 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 102048022 B 7 。