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1、10申请公布号CN104212732A43申请公布日20141217CN104212732A21申请号201410467077X22申请日20140912C12N1/19200601C12N15/81200601C12P19/26200601C12R1/8420060171申请人江南大学地址214122江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号72发明人陈坚堵国成康振金鹏74专利代理机构北京爱普纳杰专利代理事务所特殊普通合伙11419代理人张勇54发明名称一种产透明质酸的重组毕赤酵母及其构建方法57摘要本发明公开了一种产透明质酸的重组毕赤酵母及其构建方法，属于生物工程技术领域。本发明采用兽疫链球菌来。
2、源的透明质酸合酶HASA和枯草芽孢杆菌来源的UDP葡萄糖脱氢酶TUAD，分别置于组成型启动子GAP和TEF1下表达，在毕赤酵母GS115中实现了透明质酸的生产。本发明为高效制备透明质酸奠定了一定的基础，适合于工业化生产应用。51INTCL权利要求书1页说明书4页序列表6页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页序列表6页附图1页10申请公布号CN104212732ACN104212732A1/1页21一种产透明质酸的重组毕赤酵母，是在毕赤酵母中导入透明质酸合酶基因HASA和UDP葡萄糖脱氢酶基因TUAD。2根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于，两。
3、个基因分别以组成型强启动子控制表达。3根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于，以毕赤酵母PICHIAPASTORISGS115为宿主。4根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于，所述透明质酸合酶基因HASA来源于兽疫链球菌STREPTOCOCCUSZOOEPIDEMICUS、马链球菌STREPTOCOCCUSEQUI或类马链球菌STREPTOCOCCUSEQUISSP。5根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于，所述UDP葡萄糖脱氢酶来源于链球菌属STREPTOCOCCUSSPECIES、大肠杆菌ESCHERICHIACOLI或芽孢杆菌BACILLUS。6根据权利要求15任一所述。
4、的重组毕赤酵母，其特征在于，编码所述透明质酸合酶的基因HASA的核苷酸序列如SEQIDNO1所示，编码所述UDP葡萄糖脱氢酶的基因TUAD的核苷酸序列如SEQIDNO2所示。7根据权利要求2所述的重组毕赤酵母，其特征在于，HASA、TUAD分别由三磷酸甘油醛脱氢酶启动子GAP和翻译延伸因子1启动子TEF1控制表达。8一种应用权利要求15，7任一所述重组毕赤酵母发酵产透明质酸的方法，其特征在于，是以甘油、甲醇、山梨醇或葡萄糖作为碳源，在2030下，发酵4896H。9根据权利要求8所述的方法，其特征在于，碳源采用葡萄糖，200RPM、30，发酵96H；发酵培养基含酵母提取物10G/L，蛋白胨20G。
5、/L，3G/LK2HPO4，118G/LKH2PO4，1YNB134G/L，500生物素1ML/L，甘油1ML/L，添加2G/L的MGSO4，葡萄糖浓度为5。10一种构建权利要求15，7任一所述重组毕赤酵母的方法，其特征在于，将编码透明质酸合酶的基因HASA与启动子GAP融合，将编码UDP葡萄糖脱氢酶的基因TUAD与启动子TEF1融合，将两个融合片段再融合后连接表达载体，转化毕赤酵母得到。权利要求书CN104212732A1/4页3一种产透明质酸的重组毕赤酵母及其构建方法技术领域0001本发明涉及一种产透明质酸的重组毕赤酵母及其构建方法，属于生物工程技术领域。背景技术0002透明质酸HYALU。
6、RONICACID，HA，是一种高分子粘性多糖，以其独特的分子结构和理化性质，使其具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，同时无任何免疫原性和毒性，被广泛应用于化妆品、食品和医药等行业领域。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。0003HA广泛地存在于各种动物组织内，如鸡冠、关节滑液、软骨、眼玻璃体等，同时发现HA也存在于产气杆菌、绿脓杆菌和A、B、C溶血性链球菌等部分细菌中。由于动物提取工艺复杂、效率低以及存在病毒种间交叉感染和其它风险性的感。
7、染，因此，微生物发酵法开始逐渐替代提取法生产HA。基于食品安全和医疗卫生越来越高的要求以及消费者的偏好，应用食品安全级的微生物发酵生产HA日益受到青睐。0004本发明在毕赤酵母中构建HA代谢合成途径，实现分泌发酵透明质酸，由于毕赤酵母可实现高密度发酵，胞外分泌杂质相对少，产品易于分离纯化，同时，本发明更换的启动子为组成型强启动子，不需要甲醇诱导表达。该发明操作过程简单，且产品纯度高，易于实现工业化生产制备透明质酸。发明内容0005本发明提供了一种产透明质酸的重组毕赤酵母，是在毕赤酵母中导入两个关键酶基因，即编码透明质酸合酶的HASA和UDP葡萄糖脱氢酶的TUAD，完善了毕赤酵母代谢合成HA的途。
8、径，实现了直接以葡萄糖为碳源发酵产HA。0006这两个基因还可以分别置于组成型强启动子下控制表达。0007在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母为PICHIAPASTORISGS115。0008所述透明质酸合酶编码基因HASA可以来源于兽疫链球菌STREPTOCOCCUSZOOEPIDEMICUS、马链球菌STREPTOCOCCUSEQUI或类马链球菌STREPTOCOCCUSEQUISSP。在本发明的一种实施方式中，编码所述透明质酸合酶的基因HASA来源于兽疫链球菌。0009所述UDP葡萄糖脱氢酶可以来源于链球菌属STREPTOCOCCUSSPECIES、大肠杆菌ESCHERICHIACOL。
9、I和芽孢杆菌BACILLUS。在本发明的一种实施方式中，编码所述UDP葡萄糖脱氢酶的基因TUAD来源于枯草芽孢杆菌BACILLUSSUBTILIS。0010在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母组成型强启动子分别为三磷酸甘油醛脱氢酶启动子GAP和翻译延伸因子1启动子TEF1。0011在本发明的一种实施方式中，编码所述透明质酸合酶的基因HASA的核苷酸序列说明书CN104212732A2/4页4如SEQIDNO1所示。0012在本发明的一种实施方式中，编码所述UDP葡萄糖脱氢酶的基因TUAD的核苷酸序列如SEQIDNO2所述。0013在本发明的一种实施方式中，所述GAP启动子的核苷酸序列如SEQ。
10、IDNO3所示。0014在本发明的一种实施方式中，所述TEF1启动子的核苷酸序列如SEQIDNO4所示。0015本发明还提供了一种构建所述重组毕赤酵母的方法，是将编码透明质酸合酶的基因HASA与启动子GAP融合，将编码UDP葡萄糖脱氢酶的基因TUAD与启动子TEF1融合，将两个融合片段再融合后连接表达载体PPIC9K，转化毕赤酵母得到。0016本发明还提供了一种应用所述产透明质酸的重组毕赤酵母发酵产透明质酸的方法，是以甘油、甲醇、山梨醇或葡萄糖等作为碳源，在2030下，发酵4896H。所得明质酸分子量大于106DA。0017在本发明的一种实施方式中，碳源采用葡萄糖。0018在本发明的一种实施方。
11、式中，发酵温度控制为30。0019在本发明的一种实施方式中，发酵时间控制为96H。0020在本发明的一种实施方式中，挑取重组毕赤酵母单克隆，以YPD培养基活化，然后接种于发酵培养基，200RPM、30培养96H。0021所述发酵培养基含酵母提取物10G/L，蛋白胨20G/L，3G/LK2HPO4，118G/LKH2PO4，1YNB134G/L，500生物素1ML/L4104G/L，甘油1ML/L，添加2G/L的MGSO4，葡萄糖浓度为5。0022本发明利用毕赤酵母产透明质酸酶，与其他工程菌相比，该发明具有非常大的应用优势。首先，本发明过程中使用的宿主为分泌型真核表达宿主，胞外分泌杂质少，产品易。
12、于分离纯化；其次，以葡萄糖等廉价碳源为底物，可进行高密度发酵获得高转化率，再次，毕赤酵母表达系统无内毒素及其它热源物质，不会对产物的医用食品安全带来隐患。基于应用分析，本发明方法在工业上用于制备透明质酸具有潜在而非常广泛的价值。附图说明0023图1所示为重组质粒构建示意图。具体实施方式0024实施例1透明质酸合酶HASA基因和UDP葡萄糖脱氢酶TUAD基因的克隆0025本发明所用的透明质酸合酶HASA基因来源于为兽疫链球菌STREPTOCOCCUSZOOEPIDEMICUSATCC35246和UDP葡萄糖脱氢酶基因来源于BACILLUSSUBTILIS，STREPTOCOCCUSZOOEPID。
13、EMICUS菌株在接种与5MLM17液体培养基，在37200RPM培养16H。BACILLUSSUBTILIS接种于5MLLB液体培养基，在37200RPM培养16H。PICHIAPASTORISGS115接种于5MLYPD液体培养基，置于200RPM30培养24H。分别收集菌体，采用细菌基因组提取试剂盒提取三菌株的基因组DNA。0026根据已公布的基因组信息序列，分别设计引物HASAF/HASAR、TUADF/TUADR,以提取的基因组DNA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，分别扩增获取HASA和TUAD说明书CN104212732A3/4页5基因。以PICHIAPASTORISGS1。
14、15基因组为模板，设计引物GAPF/GAPR和TEFF/TEFR分别扩增GAP和TEF1启动子。0027引物序列信息53方向0028HASAFTGAACAACTATTTCGAAACGATGAGAACATTAAAAAACCTCATAAC0029HASARTGTCTAAGGCGAATTAATTCTTATAATAATTTTTTACGTGTTCCCCAGTC0030TUADFCATTTTAGTTATTCGCCAACATGAAAAAAATAGCTGTCATTGGAACAGG0031TUADRCCGGAATTCTTATAATAATTTTTTACGTGTTCCCCAGTCAGC0032GAPFCTTGATT。
15、CGAGCTCTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTC0033GAPRAGGTTTTTTAATGTTCTCATCGTTTCGAAATAGTTGTTCAATTG0034TEFFGAACACGTAAAAAATTATTATAAGAATTCCGGATAACTGTCGCCTCTTTTATCTGCCGC0035TEFRATGACAGCTATTTTTTTCATGTTGGCGAATAACTAAAATGTATGTAG0036序列表所示为本发明所述核苷酸序列信息00371SEQIDNO1序列信息为兽疫链球菌来源的透明质酸合成酶编码序列；00382SEQIDNO2序列信息为枯草芽孢杆菌来源的UDP葡萄。
16、糖脱氢酶编码序列；00393SEQIDNO3序列信息为毕赤酵母组成型启动子GAP的基因序列；00404SEQIDNO4序列信息为毕赤酵母组成型启动子TEF1的基因序列。0041实施例2重组质粒PAPT9K的构建0042采用上述扩增的DNA片段HASA、TUAD、GAP和TEF1，分别采用融合PCR进行启动子和目的基因的融合。具体操作程序如下HASA和GAP片段各取2L混合于PCR管内，加入无菌水21L和25L2XSUPERPFUMASTERMIX杭州宝赛生物科技有限公司，混匀后置于PCR仪，按如下程序运行943MIN，9430S，5030S，721MIN10,725MIN。无引物自融合PCR结。
17、束后，立即加入引物GAPF和HASAR各1L，混匀后按如下程序运行943MIN，9430S，5530S，721MIN32,725MIN。PCR产物经1的琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目标条带，获得GAPHASA片段。0043同理，按上述操作融合PCR获得TEF1TUAD片段。回收的两个融合片段GAPHASA和TEF1TUAD，在按上述融合PCR操作，将两片段进行融合，获得目标片段GAPHASATEF1TUAD。由于在引物GAPF和TUADR两端分别引入了SACI和NOTI限制性酶切位点，将载体PPIC9K进行SACI和ECORI双酶切，去掉AOX启动子和因子信号肽，重组目标片段GAPHASATEF。
18、1TUAD同样采取SACI和ECORI双酶切，回收后与已双切的PPIC9K载体连接，转化大肠杆菌JM109宿主，对鉴定出的阳性克隆提取质粒进行测序，比对分析重组质粒PAPT9K构建成功，质粒构建示意图如附图1所示。0044实施例3重组毕赤酵母产HA的菌株构建0045重组质粒PAPT9K采用SALI线性化后，按毕赤酵母操作手册，电转PICHIAPASTORISGS115宿主，以MD平板组氨酸缺陷型筛选标记筛选阳性重组子。同时，为筛选多拷贝插入的宿主，以含有不同浓度抗生素G418的YPD平板进行高拷贝筛选。本发明中采用的发酵重组菌株为4MG/ML筛选出来的阳性重组菌株，命名为PAPTGS115。0。
19、046实施例4重组毕赤酵母PAPTGS115菌株的摇瓶发酵0047挑取PAPTGS115重组菌单克隆接种于5MLYPD培养基，置于200RPM30过夜培养。16H后接种于250ML三角摇瓶装液量25ML中，发酵培养基为BMGY酵母提取物10G/L，说明书CN104212732A4/4页6蛋白胨20G/L，3G/LK2HPO4，118G/LKH2PO4，1YNB134G/L，500生物素1ML/L4104G/L，甘油1ML/L，添加2G/L的MGSO4，葡萄糖浓度为5。按1的接种量转接与BMGY摇瓶，置于200RPM30培养96H。0048收集发酵液，10000RPM下室温离心10MIN。发酵液。
20、上清转移置另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇充分混匀沉淀发酵液中的透明质酸。室温下静置1H，再10000RPM下室温离心20MIN，去除干净液体，白色沉淀加入发酵液等体积的1MNACL溶液充分溶解，适当稀释后，采用BITTERMUIR硫酸咔唑法检测HA酸含量，对照组为PICHIAPASTORISGS115同等条件下发酵液的回收物。经测定PAPTGS115重组菌株的HA产量为036G/L。说明书CN104212732A1/6页70001序列表CN104212732A2/6页800020003序列表CN104212732A3/6页90004序列表CN104212732A4/6页100005序列表CN104212732A105/6页110006序列表CN104212732A116/6页12序列表CN104212732A121/1页13图1说明书附图CN104212732A13。