技术领域
本发明涉及一种以香果、香叶为原料制备的香辛料及其在抑制单增李斯特菌中的应用。
背景技术
在食品调味调香中使用的芳香植物的干燥粉末或精油被人们称为香辛料。香辛料主要来自植物的种子、茎叶、花蕾、果实等其他部位，有独特的刺激性味道，如香、甜、苦、辣等味道，有抗氧化、着色、防腐抗菌以及其他生理药理作用，此外，还有使食品风味更好和香味更浓的作用。香辛料有以下的特点：绝大多数香辛料具有一定的药理作用；绝大多数香辛料含有挥发性物质；有典型的滋味或香气；在正常使用量(一般不做限量)内对人体功能不会造成损害，或对身体功能有帮助。
香果，又名川芎，伞形科、藁本属多年生草本植物，高40～60厘米。发达的根茎形成不规则的结节状拳形团块，有强烈的香气。根茎竖立，形状为圆柱形，条纹纵向发展，上部大多是分枝，下部茎节胀大呈盘状(苓子)。大多在路边、树林边缘、山地疏林或以竹类为优势的开敞的混交林中、海拔700-1000米生长，而很少在密林中生长。主产四川(灌县)，在其他地区也有培育，比如云南、浙江、江苏、陕西、广西、贵州、江西、湖北、甘肃、内蒙古、河北等省区。香辛料的根茎具有药用价值，可以祛湿，活血化瘀，治疗头痛头晕、腹部疼痛、痈疽疮疡、闭经、难产等症状。
香叶，也可称为月桂叶、香桂叶、桂叶、天竺桂等。香叶为樟科月属常绿小乔木，它的叶片是烹调中的调味料。香叶为小乔木或绿灌木，主要生长在南欧地中海沿岸，这两种香叶的颜色都呈现为绿色，形状为长椭圆披针形，长约三英寸，叶面是光滑的，味道有辛辣及强烈苦味。欧洲人常用香叶作为调味料和餐点装饰，可以和肉食、蔬菜、汤作为搭配，有健胃保胃的功能。
肉类保鲜是当今社会面临的一大难题，人们在肉类中添加防腐剂来维持肉类的新鲜，防止其变质腐败，最终推迟肉类的货架期。但是化学防腐剂对身体会造成一定的危害，损害身体健康。因此，选出安全可靠的天然防腐剂刻不容缓。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种以香果、香叶为原料制备的香辛料，通过实验证明，本发明的香辛料，对猪肉中的单增李斯特菌有较好的抑菌效果，可作为天然防腐剂进行应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种以香果、香叶为原料制备的香辛料，是通过以下方法制备得到的：
(1)粉碎：取香果和香叶，分别用粉碎机粉碎至颗粒直径为0.1mm；
(2)取上述粉碎完的香果和香叶，分别置于蒸馏瓶中，加入乙酸乙酯，料液比1:10(单位g：ml)，在60℃水浴条件下浸提5小时；
(3)抽滤：将浸提液抽滤后得到滤液；
(4)浓缩：使用水浴锅于通风橱中蒸发浓缩，得到除去全部溶剂的浓缩浸膏，即分别得到香果提取物、香叶提取物；将香果提取物与香叶提取物按质量比1:1的比例混合，即得。
通过上述方法制备得到的香辛料，经实验证明，其对猪肉中的单增李斯特菌有抑制作用，且取得了增效作用，因此，可以作为猪肉的防腐剂进行应用，也可以作为抑菌剂进行应用。
附图说明
图1：25℃时香果提取物对猪肉中单增李斯特菌的抑菌效果图。
图2：4℃时香果提取物对猪肉中单增李斯特菌的抑菌效果图。
图3：25℃时香叶提取物对猪肉中单增李斯特菌的抑菌效果图。
图4：4℃香叶提取物对猪肉中单增李斯特菌的抑菌效果图。
图5：25℃时香果香叶复配物对猪肉中单增李斯特菌的抑菌效果图。
图6：4℃时香果香叶复配物对猪肉中单增李斯特菌的抑菌效果图。
图7：25℃时熟肉中单增李斯特菌的抑菌效果图。
图8：4℃时熟肉中单增李斯特菌的抑菌效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1香辛料的研究
1研究目的和意义
随着人们对食品越来越高的需求，食品防腐也变得越来越重要。作为天然防腐剂的香辛料，更引起了人们的高度重视。香辛料在中国乃至世界的烹调业中占有重要地位，利用香辛料的抗菌防腐及抗氧化作用可以相应减少或不加防腐剂抗氧化剂等化学添加剂。香辛料的调味作用是食品风味的关键，随着世界经济的发展，对香辛料的要求更高，香辛料也会必将会有更广阔的应用前景。
2材料与方法
2.1实验材料与设备
2.1.1实验材料
主要原料：如下：
香果，干制，购自徐州农贸市场。
香叶，干制，购自徐州农贸市场。
主要试剂：如下：
无水乙醇，分析纯，上海博河精细化学品有限公司。
乙酸乙酯，分析纯，上海苏懿化学试剂有限公司。
超纯水，分析纯，化学与食品实验室。
胰蛋白胨大豆琼脂，生化试剂，上海盛思生化科技有限责任公司。
胰蛋白胨大豆肉汤，生化试剂，北京陆桥技术有限责任公司。
纯化琼脂粉，生化试剂，上海宜兴市有信生物有限公司。
氯化钠，分析纯，江苏腾狮化工厂
2.1.2实验设备：如下：
旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司。
循环水式真空泵，巩义市英峪予华仪器厂。
数显式电热恒温水浴锅，上海跃进医疗器械厂。
电热恒温干燥箱，上海跃进医疗器械厂。
JA2003N型电子天平，上海精密仪器有限公司。
微型植物粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司。
DNP-9162型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司。
SW-CJ-IC标准型双人净化工作台，苏州净化设备厂。
2.1.3供试菌种：如表1所示。
表1 供试菌种
2.2实验方法
2.2.1提取工艺
流程为：香果、香叶(干制)→粉碎→称量→乙酸乙酯60℃浸提→抽滤→蒸发浓缩→成品。
步骤如下：
(1)粉碎：取香果或香叶，用粉碎机粉碎到颗粒直径为0.1mm，用筛子筛选(颗粒太大，提取率不高，也不利于有效成分溶出；颗粒太小，各种杂质的溶出度也会增高，而且不利于过滤、浓缩和分离)。
(2)取30g粉碎完的香果或香叶，置于蒸馏瓶中，加入300ml乙酸乙酯，在60℃水浴条件下浸提5小时。
(3)抽滤：将浸提液抽滤后得到滤液。
(4)浓缩：使用水浴锅于通风橱中蒸发浓缩，得到浓缩浸膏(除去全部溶剂)，即分别得到香果提取物、香叶提取物。
(5)保存：提取好后，放于离心管中，121℃高温灭菌，保存。
2.2.2抑菌作用的研究
2.2.2.1实验用培养基的配制
胰蛋白胨大豆琼脂培养基(用于细菌培养)：TSA34g，水1000mL，pH7.4～7.6。
配制生理盐水：氯化钠100g，水900ml。
均于121℃高温灭菌。
2.2.2.2菌悬液制备
1.菌种的活化。将供试菌种从冷冻中取出，放入无菌操作台中解冻5分钟左右。点燃酒精灯，并用酒精棉消毒双手和擦净台面。将接种环在酒精灯火焰外焰烧至通红，冷却，挑取2-3次供试菌种，接入培养液中进行活化，置于37℃水浴中恒温振荡培养。
2.菌悬液的制备。在无菌条件下，在9.5ml的生理盐水中加入0.5ml活化好的菌种，稀释成10倍的稀释液，得到菌悬液。
2.2.2.3在纯培养中的抑制
滤纸片的制备及处理：将定性滤纸对折2-3次，用打孔器制备出6mm的圆片，放入离心管中密封，在121℃的高压灭菌锅中干热灭菌20min后放于置于烘箱中烘干，备用。
在无菌操作台中，用灭菌镊子夹取烘干后的灭菌滤纸圆片，将其放到香辛料提取物中浸泡2h，以无菌水浸过的滤纸片做空白对照。滤纸片经充分浸泡后取出晾干，备用。
在无菌操作台中，将灭过菌的TSA固体培养基倒入同样灭过菌的干净培养皿，待其完全冷却凝固后，倒置放于无菌操作台中。在酒精灯周围分别移取各菌悬液0.1mL于培养基中，用涂布器涂布均匀。
在无菌操作台中，将浸泡过香辛料提取物的四种不同的滤纸片和空白滤纸片分别贴在一个平板上，之间间隔一定距离，每种菌做三个平行。倒置于恒温培养箱中，在适宜温度下培养24h。观察测量抑菌圈直径大小。
2.2.2.4在猪肉中的抑制研究
实验准备：在无菌操作台中用天平称取新鲜猪肉10g共40份(尽量做到肉块大小均匀)，将猪肉置于高温灭菌过的大烧杯中在无菌环境下加热煮熟1-2h，确保达到杀菌效果。
材料处理：将香辛料提取物分为香果提取物、香叶提取物和香果香叶混合提取物进行研究，另外做一组空白组作为对照试验。在无菌操作台中分别取稀释至105浓度的三代以后纯菌液0.5ml滴加在每块煮熟的猪肉上，用手揉搓10-20min。将40份猪肉平均分成八份，其中两份在涂上菌液揉搓后作为空白对照，一份每块分别装入无菌均质袋中标上0d、1d、2d、3d、4d放入25℃恒温培养箱中培养，另一份每块分别装入无菌均质袋标上0d、2d、4d、5d、6d放入冰箱4℃冷藏。在剩下的猪肉中取两份，在每块猪肉上滴加50mg的香果提取物，揉搓10-20min。装入无菌均质袋中，照空白组一样，一份标上0d、1d、2d、3d、4d放入25℃恒温培养箱中培养，另一份装入无菌均质袋中标上0d、2d、4d、5d、6d放入4℃冰箱冷藏。再取两份猪肉按照之上步骤在每块猪肉上滴加香叶提取物50mg，揉搓10-20min以后标上记号分别放入25℃和4℃保存。最后两份的每块猪肉上是分别滴加香果提取物25mg和香叶提取物25mg进行揉搓10-20min以后放入无菌均质袋标记分别放入25℃和4℃保存。
抑菌研究：处理完所有猪肉之后取出标有0d的无菌均质袋，在袋中倒入90ml灭过菌的生理盐水，放入拍打机中拍打直至将猪肉拍烂拍碎，用移液枪移取拍打液进行稀释接种到TSA上培养，隔天进行菌落总数的计算。将剩余的袋装猪肉放好根据袋上的标记日期测定数据，25℃的每24h测一次，4℃每24h测一次共测两次，之后的每48h测一次。
3实验结果
3.1香辛料提取物在纯培养环境中的抑菌效果
由抑菌实验表明，天然香辛料对熟肉中单增李斯特菌有抑菌效果，其中香果香叶混合物抑菌效果最好，香果提取物抑菌效果其次，香叶的抑菌效果最差。
3.1.1香果提取物对各种供试菌种的最大抑菌圈数据
根据实验结果可知(如表2所示)，香果提取物对各种供试菌种均有良好的抑菌效果，其中肠炎沙门氏菌和耶尔森氏菌属的抑菌效果最为明显，单增李斯特菌的抑菌效果也较为明显。
表2 香果提取物抑菌效果(抑菌圈直径mm)
3.1.2香叶提取液对各种供试菌种的最大抑菌圈数据
香叶提取液对各种供试菌种均有抑菌效果(如表3所示)，但是没有香果的抑菌效果好。其中荧光假单胞菌和耶尔森氏菌属的抑菌效果较其他菌种而言略高。单增李斯特菌的抑菌效果一般。
表3 香叶提取物抑菌效果(抑菌圈直径mm)
3.2香辛料提取物在猪肉中对单增李斯特菌的抑制作用
3.2.1香果提取物对猪肉中单增李斯特菌的抑制作用，如表4、图1所示。
3.2.1.1香果提取物在25℃情况下抑菌效果
表4 香果提取物中的菌落总数(个/ml)
由图1可知，25℃时经过香果提取物处理的猪肉上单增李斯特菌的生长速度比没处理的空白组的猪肉上的单增李斯特菌生长速度明显要慢，说明在25℃情况下香果提取物对单增李斯特菌有抑制作用。
3.2.1.2香果提取物在4℃情况下抑菌效果，如表5、图2所示。
由图2可知，4℃时经过香果提取物处理的猪肉上单增李斯特菌的生长速度比没处理的空白组的猪肉上的慢，说明在4℃情况下香果提取物对单增李斯特菌有抑制作用。
将25℃情况下的抑菌效果图与4℃情况下的抑菌效果图作对比，可知在4℃情况下，经香果提取物处理过的猪肉中单增李斯特菌的生长速度更为缓慢，同样抑菌效果更好。
表5 香果提取物中的菌落总数(个/ml)
3.2.2香叶提取物对猪肉中单增李斯特菌的抑制作用
3.2.2.1香叶提取物在25℃情况下的抑菌效果，如表6、图3所示。
表6 香叶提取物中的菌落总数(个/ml)
由图3可知，25℃时经过香叶提取物处理的猪肉上单增李斯特菌的生长速度比没处理的空白组的猪肉上的单增李斯特菌的生长速度慢，说明在25℃情况下香叶提取物对单增李斯特菌有抑制作用，但是抑菌效果并不明显。
3.2.2.2香叶提取物在4℃情况下的抑菌效果，如表7、图4所示。
表7 香叶提取物中的菌落总数(个/ml)
由图4可知，4℃时经过香叶提取物处理的猪肉上单增李斯特菌的生长速度比没处理的空白组的猪肉上的单增李斯特菌生长速度要慢，说明在4℃情况下香叶提取物对单增李斯特菌有抑制作用。
将25℃情况下的抑菌效果图与4℃情况下的抑菌效果图作对比，可知在4℃情况下，经香叶提取物处理过的猪肉中单增李斯特菌的生长速度更为缓慢，同样抑菌效果更好。
3.2.3香果香叶混合提取物对猪肉中单增李斯特菌的抑制作用
香果香叶混合提取物对各种供试菌种均有良好的抑菌效果，效果也是最强的。
3.2.3.1香果香叶混合提取物25℃情况下的抑菌效果，如表8、图5所示。
表8 香果香叶混合提取物中的菌落总数(个/ml)
由图5可知，25℃情况下经过香果香叶复配物处理的猪肉中单增李斯特菌的生长速度比未经处理过的空白组猪肉上单增李斯特菌的生长速度慢很多，说明香果香叶复配物在25℃情况下对单增李斯特菌有明显的抑菌效果。
3.2.3.2香果香叶混合提取物在4℃情况下的抑菌效果，如表9、图6所示。
由图6可知，4℃时经过香果香叶复配物处理的猪肉上单增李斯特菌的生长速度比没处理的空白组的猪肉上的单增李斯特菌生长速度要慢，说明在4℃情况下香果香叶复配物对单增李斯特菌有抑制作用。将25℃情况下的抑菌效果图与4℃情况下的抑菌效果图作对比，可知在4℃情况下，经香果香叶复配物处理过的猪肉中单增李斯特菌的生长速度更为缓慢，同样抑菌效果更好。
表9 香果香叶混合提取物中的菌落总数(个/ml)
3.3总结对比
根据实验结果，测定25℃环境下熟肉中单增李斯特菌的菌落生长总数的数据，绘制图如图7所示。
由图7可知，在25℃时经过香叶提取物处理的猪肉中单增李斯特菌的生长速度较快，香果次之，香果香叶复配物最慢，而未任何处理的猪肉中单增李斯特菌的生长速度作对比。说明香果香叶复配物对猪肉中单增李斯特菌的抑制效果最好，香果其次，香叶最差。
根据实验结果，测定4℃环境下熟肉中单增李斯特菌的菌落生长总数的数据，绘制图如图8所示。
由图8可知，在4℃时经过香叶提取物处理的猪肉中单增李斯特菌的生长速度较快，香果次之，香果香叶复配物最慢，而未任何处理的猪肉中单增李斯特菌的生长速度作对比。说明香果香叶复配物对猪肉中单增李斯特菌的抑制效果最好，香果其次，香叶最差。
3.4讨论分析
由以上图表可以看出，香辛料提取物都对熟肉中单增李斯特菌的生长有抑制作用。以煮熟未经处理的猪肉做空白，经过香果香叶复配物处理的熟猪肉上，单增李斯特菌的生长得到较好抑制；香果的抑制效果次之；香叶的抑制效果最差。在4℃下香辛料提取物的抑制效果要比在25℃下的抑制效果要好，因为在低温环境下，单增李斯特菌生长更缓慢，从而得到了更好的抑制效果。
香果香叶复配物对熟肉中单增李斯特菌的抑制效果最好，是协同增效的作用。香果和香叶的提取物中含有两种或两种以上的成分对抑制单增李斯特菌的生长有协同增效作用，从而促使抑制作用更明显，抑菌效果更好。
结论：
1.由上述实验可以得知：香果、香叶两种香辛料对细菌均有较好的抑菌效果。猪肉中的抑菌效果香果优于香叶，在今后的猪肉生产加工中，适当的提高浓度可能会使得香果的抑菌效果增强。香果香叶的抑菌效果随着温度也会有所改变，4℃情况下的抑菌效果比25℃情况下的好，因此在猪肉防腐这一块可以利用低温和香辛料双重保鲜。
2.根据利用香果香叶混合抑菌实验的结果，显示出了不同的香辛料共同使用，比单一香辛料的抑菌效果要更好。在今后使用香辛料的过程中，我们可以同时使用多种香辛料，使它们的抑菌成分相互协同，发挥出更好的抑菌效果。