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1、10申请公布号CN104212900A43申请公布日20141217CN104212900A21申请号201410452992122申请日20140905C12Q1/68200601C12Q1/14200601C12N15/1120060171申请人郑秋月地址116001辽宁省大连市中山区长江东路60号申请人于珂高鹭马惠蕊战晓微72发明人郑秋月于珂高鹭马惠蕊战晓微74专利代理机构大连智慧专利事务所21215代理人周志舰54发明名称用于耐甲氧西林和/或耐四环素金黄色葡萄球菌检测的组合物57摘要本发明提供一种用于耐甲氧西林和/或耐四环素金黄色葡萄球菌检测的组合物，包括，引物对SEQIDNO1/2，。
2、以及，引物对SEQIDNO3/4和SEQIDNO5/6中的至少一对引物。并在此基础上进一步建立MPCRDHPLC/电泳检测试剂盒及方法，检测食品中致病性金黄色葡萄球菌、MRSA及耐四环素的金黄色葡萄球菌耐药菌株。使用本发明所述的组合物及方法对对金黄色葡萄球菌进行菌属鉴定的同时，可同时检测MRSA及四环素耐药基因，在一次检测中即同时鉴定样品中的金黄色葡萄球菌、MRSA及耐红霉素金黄色葡萄球菌。具有快速高通量的优点，并且检侧耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。51INTCL权利要求书2页说明书8页序列表2页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求。
3、书2页说明书8页序列表2页附图3页10申请公布号CN104212900ACN104212900A1/2页21用于耐甲氧西林和/或耐四环素金黄色葡萄球菌检测的组合物，包括，引物对SEQIDNO1/2，以及，引物对SEQIDNO3/4和SEQIDNO5/6中的至少一对引物。2权利要求1所述的组合物，其特征在于，包括下述引物对引物对SEQIDNO1/2，引物对SEQIDNO3/4和引物对SEQIDNO5/6。3用于耐甲氧西林和/或耐四环素金黄色葡萄球菌检测的试剂盒，包括权利要求1或2所述的组合物。4检测耐甲氧西林和/或耐四环素金黄色葡萄球菌的方法，包括PCR反应的步骤，其特征在于，所述PCR反应使用。
4、权利要求1或2所述的组合物为扩增引物。5权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应体系总体积25L，包括待测样品DNA溶液1L，5U/L的TAQDNA聚合酶025L，PCR反应液12L和余量的水；所述PCR反应液中含10MMTRISHCL、50MMKCL、25MMMGCL2、DNTP各25MM及01M的引物对SEQIDNO1/2、01M的引物对SEQIDNO3/4和02M的引物对SEQIDNO5/6。6权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应参数为预变性94，1MIN；进入循环94变性30S，57退火90S，72延伸90S，30个循环；终止延伸72，10MIN。7权利要求4所。
5、述的方法，其特征在于，还包括对PCR反应产物进行DHPLC分析的步骤，分析条件如下色谱柱PSDVBC18DNASEP色谱柱，46MM50MM，粒度3M；柱温50；按照体积比，流动相为0MIN550A，450B；05MIN502A，498B；36MIN418A，582B；68MIN382A，618B；99MIN363A，637B；130MIN350A，650B；A为50MLTEAA和250L乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ML所得溶液；B为50MLTEAA和250ML乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ML所得溶液；流速09ML/MIN；检测器荧光检测器，光源150WXENON灯；激发谱带宽。
6、15NM；发射谱带宽153NM；检测灵敏度在波长350NM积分2S；上样量PCR产物10L。8权利要求7所述的方法，其特征在于，按照如下标准判断所述DHPLC检测结果检测样品无扩增吸收峰出现，可判定样品结果为阴性，直接报告未检出相对应的致病菌；检测样品NUC基因出现典型的PCR产物吸收峰，且吸收峰值大于3MV时，可判定该样品权利要求书CN104212900A2/2页3为金黄色葡萄球菌，而MECA、TETM基因无扩增吸收峰，可判定该菌为MSSA，且无四环素耐药基因TETM；检测样品NUC基因出现典型的PCR产物吸收峰，且吸收峰值大于3MV时，可判定该样品为金黄色葡萄球菌，同时MECA基因出现典型。
7、的PCR产物吸收峰，而TETM基因无扩增吸收峰，可判定该样品为MRSA，且无四环素耐药基因TETM；检测样品NUC基因出现典型的PCR产物吸收峰，且吸收峰值大于3MV时，可判定该样品为金黄色葡萄球菌，同时MECA基因出现典型的PCR产物吸收峰，而TETM基因出现典型的PCR产物吸收峰，可判定该样品为MRSA，且对四环素耐药；检测样品出现典型的PCR产物吸收峰，但吸收峰值小于3MV时，建议样本重新增菌培养后重做；重做结果峰吸收值仍小于3MV则为阴性，否则为可疑阳性。9权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括对PCR反应产物进行电泳分析的步骤10LPCR产物，于3琼脂糖凝胶电泳，电压200V，电流。
8、190MA，电泳时间为20MIN，在紫外透射分析仪上观察结果。10权利要求9所述的方法，其特征在于，按照如下标准判断所述电泳结果检测样品NUC基因出现相应大小的扩增条带，可判定该样品为金黄色葡萄球菌，而MECA、TETM基因无相应大小的扩增条带，可判定该菌为MSSA，且无四环素耐药基因TETM；检测样品NUC基因出现相应大小的扩增条带，可判定该样品为金黄色葡萄球菌，同时MECA基因出现相应大小的扩增条带，而TETM基因无相应大小的扩增条带，可判定该样品为MRSA，且无四环素耐药基因TETM；检测样品NUC基因出现相应大小的扩增条带，可判定该样品为金黄色葡萄球菌，同时MECA、TETM基因出现相。
9、应大小的扩增条带可判定该样品为MRSA，且对四环素耐药。权利要求书CN104212900A1/8页4用于耐甲氧西林和/或耐四环素金黄色葡萄球菌检测的组合物技术领域0001本发明属于生物检测技术领域，涉及食品及生物产品中耐药性金黄色葡萄球菌所携带的耐药基因的检测，尤其针对耐甲氧西林和/或四环素金黄色葡萄球菌耐药基因的MPCR检测。技术背景0002食源性细菌耐药性近年来逐渐引起人们的重视，世界卫生组织已把“抗击耐药性”作为2011年世界卫生日的主题。从1997年开始，联合国粮农组织FAO、世界卫生组织WHO和世界动物卫生组织OIE等国际组织多次召开会议商讨抗菌药物应用于食品动物后对人类医疗和公共卫。
10、生的影响并制定了控制食品动物抗生素耐药性的全球准则。欧盟、美国、日本、澳大利亚等国家纷纷建立了食品动物耐药菌及抗菌药物使用量的监测网，开展了大规模的监测。中国已经将食源性细菌耐药性作为重要的食品安全与公共健康问题。0003目前，国内对动物源性细菌耐药性的方法主要依据临床和实验室标准化委员会CLINICALANDLABORATORYSTANDARDSINSTITUTE，CLSI制订的动物源细菌的抗微生物药物纸片扩散法和稀释法敏感度试验执行标准；认可标准第三版及检验检疫的行业标准动物及其制品中细菌耐药性的测定纸片扩散法SN/T19442007进行体外细菌培养药敏性试验，该体外药敏试验的结果无法评估。
11、细菌耐药性对人体的危害，而检测耐药基因的PCR能够较为准确的判断耐药菌株，避免被检测菌株因体外药敏试验而产生的假性耐药或假性敏感现象。由于细菌耐药性主要源自与临床检验医学中对细菌感染患者的检测，而动物源性细菌耐药性研究起步较晚，人们的重视不足，因而对动物源性细菌及食品中的细菌耐药性检测方法少之又少，这就可能造成耐药细菌通过食物链传播给人类，并且造成耐药细菌的蔓延。食品中金黄色葡萄球菌耐药菌株，在感染人类时由于其耐药性造成患者治疗困难，难以治愈；其耐药因子也会在菌株间传播扩散，造成耐药菌株发生率不断攀升，危害严重。为防止耐药性菌株从食品，尤其是动物性食品中经食物链传播给人类，预先建立针对食品的微。
12、生物耐药性检验方法是非常必要的。0004金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUS是常见的食源性致病菌，由于该菌可产生肠毒素，可引起食物中毒，也可导致禽畜类等动物患病，尤其是导致奶牛乳房炎的主要病原菌之一。随着兽药抗生素的滥用，耐药性金黄色葡萄球菌已蔓延全球，其中被称为“超级细菌”的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌METHICILLINRESISTANTSTAPHYLOCOCCUSAUREUS，MRSA对除糖肽类抗生素外几乎对其他抗生素均有不同程度的耐药性，感染后治疗困难，且可能在药物的选择性压力下造成对所有抗生素菌耐药的危险，MOHNARIN2011年度全国细菌耐药监测报告中呈MRSA已。
13、达50左右，随着耐药性细菌的传播蔓延及耐药因子的转移MRSA在动物尤其是禽畜类养殖中中，动物源性食品肉类、乳类等及其他各类食品中均有检出，且发生率也在逐年升高，有报道称，我国部分地区的市售鸡肉中金黄色葡萄球菌均存在耐药性，且MRSA检出率达13，牛乳源MRSA的检出率可达22左右，因说明书CN104212900A2/8页5此，对该类细菌的预防控制尤为重要。四环素作为广谱抑菌类抗生素，长期、不合理、滥用不仅能造成二重感染，加快耐药菌的产生，国内有报道称食源性金黄色葡萄球菌对四环素的耐药率接近50，而在动物养殖中，四环素常被拌入饲料中使用，造成动物源性细菌对四环素的耐药率更高。这种大量耐药菌株出现。
14、的现象往往被人们所忽视，但其危害却极其严重，一方面可造成动物疾病防控的失败，另一方面大量的动物源耐药菌通过食物链转移到人体的风险大大增加。如果是病原菌则直接导致人类疾病治疗的失败，如果是非病原性耐药菌，则可能在人类肠道中将耐药基因转移给其他病原菌引发疾病。且国内携带四环素耐药基因的MRSA检出率明显高于国外，但与国外基因型不同的是，我国国内对四环素耐药的金黄色葡萄球菌主要携带TETM基因。0005因此，期待建立更为准确灵敏的针对性检测耐药基因的方法，用以更为准确的判断耐甲氧西林和/或耐四环素金黄色葡萄球菌菌株，并有效避免被检测菌株因体外药敏试验而产生的假性耐药或假性敏感现象。发明内容0006本。
15、发明的目的之一，在于提供用于耐甲氧西林和/或耐四环素金黄色葡萄球菌检测的组合物，包括，0007引物对SEQIDNO1/2，以及，0008引物对SEQIDNO3/4和SEQIDNO5/6中的至少一对引物。0009关于这些引物对的描述如下表00100011作为优选的技术方案，所述用于耐甲氧西林和/或耐四环素金黄色葡萄球菌检测的组合物，同时包括所述全部3组特异性引物对，即引物对SEQIDNO1/2，引物对SEQIDNO3/4和引物对SEQIDNO5/6。0012所述组合物被应用于PCR反应，针对性扩增待测样品中可能含有的目的基因片段，这些目的基因片段包括致病性金黄色葡萄球菌的菌属特异性基因耐热核酸酶。
16、NUC基因、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药决定因子MECA基因及四环素耐药决定因子TETM基因。0013本发明的目的之二在于提供一种用于耐甲氧西林和/或耐四环素金黄色葡萄球菌检测的试剂盒，包括上述本发明的用于耐甲氧西林和/或耐四环素金黄色葡萄球菌检测的组合物，即引物对。0014显然，所述试剂盒可应用于PCR扩增，所述试剂盒中，除了包括上述特异性引物对，还可以包括用于PCR反应的其它组分，所述组分包括但不限于TAQDNA聚合酶，DNTP，说明书CN104212900A3/8页610PCR缓冲液以及水。0015本发明再一方面的目的在于提供一种检测耐甲氧西林和/或耐四环素金黄色葡萄球菌的方法，包括PC。
17、R反应的步骤，所述PCR反应使用上文所述本发明的用于耐甲氧西林和/或耐四环素金黄色葡萄球菌检测的组合物为MPCR扩增引物。0016具体的实施方案中，本发明所述的检测耐甲氧西林和/或耐红霉素金黄色葡萄球菌的方法中PCR反应体系总体积25L，包括待测样品DNA溶液1L，5U/L的TAQDNA聚合酶025L，PCR反应液12L和余量的水；0017所述PCR反应液中含10MMTRISHCL、50MMKCL、25MMMGCL2、DNTP各25MM及01M的引物对SEQIDNO1/2SEQIDNO1，SEQIDNO2各01M、01M的引物对SEQIDNO3/4SEQIDNO3，SEQIDNO4各01M和0。
18、2M的引物对SEQIDNO5/6SEQIDNO5，SEQIDNO6。0018具体的实施方案中，本发明所述的检测耐甲氧西林和/或耐四环素金黄色葡萄球菌的方法中PCR反应参数为0019预变性94，1MIN；0020进入循环94变性30S，57退火90S，72延伸90S，30个循环；0021终止延伸72，10MIN。0022对MPCR的产物，可以采用DHPLC或电泳的方法进行进一步的结果分析0023具体实施方案之一，对PCR反应产物进行DHPLC分析的步骤，分析条件如下0024色谱柱PSDVBC18DNASEP色谱柱，46MM50MM，粒度3M；0025柱温50；0026按照体积比，流动相为0027。
19、0MIN550A，450B；002805MIN502A，498B；002936MIN418A，582B；003068MIN382A，618B；003199MIN363A，637B；0032130MIN350A，650B；0033A为50MLTEAA和250L乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ML所得溶液；B为50MLTEAA和250ML乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ML所得溶液；0034流速09ML/MIN；0035检测器荧光检测器，光源150WXENON灯；激发谱带宽15NM；发射谱带宽153NM；检测灵敏度在波长350NM积分2S；0036上样量PCR产物10L。0037对所述DH。
20、PLC检测结果，按照如下标准进行判断0038检测样品无扩增吸收峰出现，可判定样品结果为阴性，直接报告未检出相对应的致病菌；0039检测样品NUC基因出现典型的PCR产物吸收峰，且吸收峰值大于3MV时，可判定该样品为金黄色葡萄球菌，而MECA、TETM基因无扩增吸收峰，可判定该菌为MSSA，且无四环素耐药基因TETM；说明书CN104212900A4/8页70040检测样品NUC基因出现典型的PCR产物吸收峰，且吸收峰值大于3MV时，可判定该样品为金黄色葡萄球菌，同时MECA基因出现典型的PCR产物吸收峰，而TETM基因无扩增吸收峰，可判定该样品为MRSA，且无四环素耐药基因TETM；0041检。
21、测样品NUC基因出现典型的PCR产物吸收峰，且吸收峰值大于3MV时，可判定该样品为金黄色葡萄球菌，同时MECA基因出现典型的PCR产物吸收峰，而TETM基因出现典型的PCR产物吸收峰，可判定该样品为MRSA，且对四环素耐药；0042检测样品出现典型的PCR产物吸收峰，但吸收峰值小于3MV时，建议样本重新增菌培养后重新检测；重做结果峰吸收值仍小于3MV则为阴性，否则为可疑阳性。0043对所述MPCR扩增结果的分析，具体实施方案之二，是电泳分析的步骤10LPCR产物，于3琼脂糖凝胶电泳，电压200V，电流190MA，时间20MIN，在紫外透射分析仪上观察结果。0044对所述电泳检测结果，按照如下标。
22、准进行判断0045检测样品NUC基因出现相应大小的扩增条带，可判定该样品为金黄色葡萄球菌，而MECA、TETM基因无相应大小的扩增条带，可判定该菌为MSSA，且无四环素耐药基因TETM基因；0046检测样品NUC基因出现相应大小的扩增条带，可判定该样品为金黄色葡萄球菌，同时MECA基因出现相应大小的扩增条带，而TETM基因无相应大小的扩增条带，可判定该样品为MRSA，且无四环素耐药基因TETM基因；0047检测样品NUC基因出现相应大小的扩增条带，可判定该样品为金黄色葡萄球菌，同时MECA、TETM基因出现相应大小的扩增条带可判定该样品为MRSA，且对四环素耐药。0048本发明针对食品中金黄色。
23、葡萄球菌的种属特异性基因耐热核酸酶NUC基因、MRSA耐药决定因子MECA基因及耐四环素的决定因子TETM基因设计特异性多重PCR探针及试剂盒，并进一步建立MPCRDHPLC/电泳检测方法，检测食品中致病性金黄色葡萄球菌、MRSA及耐四环素的金黄色葡萄球菌耐药菌株。使用本发明所述的组合物及方法对对金黄色葡萄球菌进行菌属鉴定的同时，可同时检测MRSA及四环素耐药基因，具有快速高通量等优点，满足了食品中微生物检测迅速准确的需求。使用本发明所建立的MPCRDHPLC/电泳方法可以在一次检测中即同时鉴定样品中的金黄色葡萄球菌、MRSA及耐红霉素金黄色葡萄球菌。并且检侧耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳。
24、力和财力，适合快速检测的要求。附图说明0049本发明附图8幅，分别是0050图1耐四环素MRSA菌株MPCR电泳检测结果；0051图2耐四环素MRSA菌株MPCRDHPLC检测结果；0052图3MPCR电泳检测耐甲氧西林和/或耐四环素金黄色葡萄球菌的方法特异性测试结果，0053图4MPCRDHPL检测耐甲氧西林和/或耐四环素金黄色葡萄球菌的方法特异性测试结果，0054图3和4中，1单核细胞增生李斯特氏菌；2鼠伤寒沙门氏菌；3粪肠球菌；4大肠杆菌；5副溶血性弧菌；6铜绿假单胞菌；7金黄色葡萄球菌；说明书CN104212900A5/8页80055图5MPCR电泳检测耐甲氧西林和/或耐四环素金黄色葡。
25、萄球菌方法灵敏度测试结果，0056图6MPCRDHPLC检测耐甲氧西林和/或耐四环素金黄色葡萄球菌方法灵敏度测试结果，0057图5和6中，154106CFU/ML；254105CFU/ML；354104CFU/ML；454103CFU/ML；554102CFU/ML；0058图7实际菌株样品MPCRDHPLC检测结果，0059图8实际菌株样品MPCR电泳检测结果，0060图7和8中，1携带携带TEXM耐药基因的MRSA菌株；2MRSA菌株；3MSSA菌株。0061上述附图中，横坐标均为保留时间单位分钟MIN，纵坐标表示吸收峰信号强度单位毫伏MV。具体实施方式0062下述非限制性实施例，其对本方。
26、法的建立及其应用作进一步的说明，可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。0063若无特殊说明，本部分所使用的主要试剂、仪器及其商品来源为细菌基因组DNA小量纯化试剂盒TAKARAMINIBESTBACTERIALGENOMICDNAEXTRACTIONKIT、TAQ酶及PCR缓冲液等试剂均购自宝生物工程大连有限公司；三乙胺乙酰盐TEAA，色谱纯购自TRANSGENOMIC公司；乙腈色谱纯购自FISHER公司；普通PCR仪PE24000PERKINELMER公司，美国；变性高效液相色谱仪NAV994500TRANSGENOMIC公司，美国；高速离心机CENTRIF。
27、UGE5804EPPENDORF公司，德国。0064本发明所用标准菌株均购自美国典型菌种保藏中心ATCC和中国医学微生物菌种保藏管理中心CMCC，见表1。各菌株使用菌种保存管80保存，活化培养等均按照相关的国家标准GB、检验检疫行业标准SN或国际权威标准方法进行。0065表1试验菌株00660067实施例1说明书CN104212900A6/8页90068引物的设计、合成与试剂盒的组装0069针对金黄色葡萄球菌的种属特异性基因耐热核酸酶NUC基因、MRSA耐药决定因子MECA基因及耐四环素的决定因子TETM设计引物。本实施例确定用于检测的引物序列及扩增片段长度如表2所示0070表20071007。
28、20073在此基础上设计用于检测的试剂盒。该试剂盒中包括浓度为5U/L的TAQDNA聚合酶和PCR反应液；其中的PCR反应液中含10MMTRISHCL、50MMKCL、25MMMGCL2、DNTPDATP、DGTP、DCTP和DTTP各25MM及上述3对金黄色葡萄球菌的引物对浓度如表2所示。0074MPCR0075使用上述步骤所设计的多重引物以及相应地试剂盒，进行PCR扩增，包括如下步骤0076待检样品的制备采用试剂盒提取法制备待测样品DNA基因组0077A、食品样品0078以无菌操作取食品25G剪取样品的部位参照国标方法，粉碎后加入装有225MLBPW的无菌三角瓶或拍击式均质袋中，摇晃35M。
29、IN或拍击1MIN，将三角瓶或均质袋封口后在36培养1824H。0079使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或20保存。0080B、标准菌株挑取单个菌落于营养肉汤中培养1824H，使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或20保存。0081PCR扩增0082取1L待测样品DNA溶液，加入12L试剂盒中的PCR反应液、025LTAQDNA聚合酶及灭菌超纯水至总体积25L；5000R/MIN离心10S，然后按下列参数进行PCR扩增0083预变性94，1MIN；0084进入循环94变性30S，57退火90S，。
30、72延伸90S，30个循环；0085终止延伸72，10MIN；说明书CN104212900A7/8页100086PCR产物4保存待测；0087MPCR产物分析0088取10L步骤MPCR所得产物在3琼脂糖凝胶电泳200V检测20MIN后，在紫外透射分析仪上观察结果，如附图1所示。可见，扩增片段大小为147BP的条带为四环素耐药基因TETM；扩增片段大小为320BP的条带为编码青霉素结合蛋白2APBP2A的MECA耐药基因；扩增片段大小为415BP的条带为耐热核酸酶NUC金黄色葡萄球菌特异性种属鉴定基因。0089将PCR产物进行DHPLC分析，DHPLC分析条件如下0090色谱柱PSDVBC18。
31、DNASEP色谱柱，46MM50MM，粒度3M；0091柱温50；0092按照体积比，流动相为00930MIN550A，450B；009405MIN502A，498B；009536MIN418A，582B；009668MIN382A，618B；009799MIN363A，637B；0098130MIN350A，650B；0099其中，缓冲溶液A为50MLTEAA和250L乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ML所得溶液；缓冲溶液B为50MLTEAA和250ML乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ML所得溶液；0100流速09ML/MIN；0101检测器荧光检测器，光源150WXENON灯；激发。
32、谱带宽15NM；发射谱带宽153NM；检测灵敏度在波长350NM积分2S；0102上样量PCR产物10L。0103MPCRDHPLC检测结果如附图2所示，三种引物的PCR扩增产物均能产生阳性吸收峰，且吸收峰与扩增片段大小符合。0104实施例2特异性试验0105表1中所有参考菌株提取基因组DNA，然后以这些基因组DNA为模板，按照实施例1所建立的方法进行检测分析。MPCR电泳结果如附图3所示，测试菌株中，仅金黄色葡萄球菌检出相应条带，其余菌株均显示阴性检测结果。实施例1所建立的MPCR电泳法检测结果特异性高，没有假阳性和假阴性结果。0106MPCRDHPLC结果如附图4所示，测试菌株中，仅金黄色。
33、葡萄球菌检出相应吸收峰，其余菌株均显示阴性检测结果。实施例1所建立的PCRDHPLC检测方法有很高的特异性，没有假阳性和假阴性结果。0107实施例3检测灵敏度试验0108将金黄色葡萄球菌ATCC51153接种到TSB培养基中，361培养24H，并通过梯度稀释法或计数法测出增菌液的细菌数量为54106CFU/ML，并对增菌液分别进行102、103、104梯度稀释，得到细菌数量为54105CFU/ML、54104CFU/ML、54103CFU/ML、54102CFU/ML菌液分别进行DNA提取并分析，MPCR电泳/DHPLC结果如附图5和6所示，说明书CN104212900A108/8页11显示N。
34、UC基因最低可检测到54103CFU/ML。0109实施例4实际样品检测0110取3株从实际样品中分离出的金黄色葡萄球菌，进行DNA提取，并按照实施例1所建立的方法进行MPCR，并以实施例1所建立的条件进行电泳及DHPLC分析。DHPLC检测结果如附图7，可见01111号菌株检测到147BP，320BP，415BP三条阳性吸收峰，该株菌为携带TEXM耐药基因的MRSA；2号菌株检测到320BP，415BP两条阳性吸收峰，该株菌为不携带TEXM耐药基因的MRSA；3号菌株检测到415BP一条阳性吸收峰，该株菌为不携带红霉素耐药基因的MSSA。0112电泳检测结果如附图8，可见，其检测结果与DHP。
35、LC检测结果一致。将此3株金黄色葡萄球菌通过纸片扩散法及全自动细菌鉴定药敏仪验证其耐药性分别为1号菌株为耐四环素MRSA；2号菌株为对四环素敏感的MRSA；3号菌株为对四环素敏感的MSSA。与本试验建立的方法检测结果相符，说明本发明所设计的MPCR引物对及相应检测方法对于检测鉴定金黄色葡萄球菌、MRSA及四环素耐药菌株具有良好的效果。0113本实施例中，使用传统纸片扩散法鉴定的耐药菌株，需在细菌菌属鉴定后，再经细菌24H过夜培养才能确认其耐药性，且此方法与细菌鉴定药敏仪均需测定细菌比浊度，易受检测人员操作的影响；且纸片扩散法鉴定耗时需要35天，工作量大，鉴定结果影响因素多。而使用本发明所建立的方法可在鉴定金黄色葡萄球菌菌属的同时，检测其耐药基因，方法平均总耗时包括样品制备6H，检测耗时不包括样品制备25H，操作简便快速。说明书CN104212900A111/2页1200010002序列表CN104212900A122/2页13序列表CN104212900A131/3页14图1图2图3图4说明书附图CN104212900A142/3页15图5图6图7说明书附图CN104212900A153/3页16图8说明书附图CN104212900A16。