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1、10申请公布号CN104211752A43申请公布日20141217CN104211752A21申请号201410448675222申请日20140904C07K1/14200601C07K1/16200601C07K1/11320060171申请人天津瑞普生物技术股份有限公司地址300308天津市滨海新区空港经济区环河北路与中心大道交口空港商务园西区2120172发明人孙艳吕茂杰杨保收盛长忠梁武74专利代理机构天津滨海科纬知识产权代理有限公司12211代理人韩敏54发明名称一种HIS标签包涵体蛋白纯化方法57摘要本发明提供了一种HIS标签包涵体蛋白的纯化方法。本发明以N十二烷基肌氨酸钠为变性。
2、剂，以碱性PH的CAPSN环己基3氨基丙磺酸为缓冲液，裂解包涵体蛋白。N十二烷基肌氨酸钠为一种表面活性剂，通过破坏蛋白内的疏水键溶解包涵体蛋白，变性条件较为温和。该变性方法的最大特点是，避免了尿素易分解产生异氰酸盐导致蛋白多肽链的自由氨基甲酰化的缺陷，溶解蛋白经NINTA柱纯化效果优于尿素，蛋白溶解后即具有生物活性，无需做复性处理。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图1页10申请公布号CN104211752ACN104211752A1/1页21一种HIS标签包涵体蛋白的纯化方法，其特征在于包括以下步骤1取待纯。
3、化的包涵体，先用包涵体洗涤液对其进行洗涤，再用PBS对其进行洗涤；2取包涵体裂解液，对步骤1洗涤完毕的包涵体进行溶解，室温震荡，充分溶解后离心收集上清；3利用NINET柱对步骤2得到的上清液进行纯化，过程中利用洗液洗脱杂蛋白，利用洗脱液洗脱目的蛋白，而后利用透析缓冲液对洗脱的目的蛋白进行透析；上述包涵体裂解液是其中具有50100MMCAPS，011N十二烷基肌氨酸钠的溶液，其PH为8090。2根据权利要求1所述一种HIS标签包涵体蛋白的纯化方法，其特征在于所述透析缓冲液是其中具有50100MMNAH2PO4，400500MMTRIS的溶液，其PH为8090；所述洗液是其中具有50100MMNA。
4、H2PO4，1050MMTRISCL，510MM咪唑的溶液，其PH为7585；所述洗液是其中具有50100MMNAH2PO4，1050MMTRISCL，100300MM咪唑的溶液，其PH为7585。3根据权利要求1所述一种HIS标签包涵体蛋白的纯化方法，其特征在于步骤1所述的包涵体洗涤液是其中具有20MMTRISCL，1TRITONX100的溶液，其PH为8090。4根据权利要求1所述一种HIS标签包涵体蛋白的纯化方法，其特征在于步骤1利用包涵体洗涤液对包涵体洗涤的次数为23次。5根据权利要求1所述一种HIS标签包涵体蛋白的纯化方法，其特征在于步骤1利用PBS对包涵体洗涤的次数为23次。6一种。
5、HIS标签包涵体蛋白的裂解液，其特征在于其中具有50100MMCAPS，011N十二烷基肌氨酸钠，且其PH为8090。权利要求书CN104211752A1/5页3一种HIS标签包涵体蛋白纯化方法技术领域0001本发明涉及蛋白纯化技术领域，具体涉及一种HIS标签包涵体蛋白的纯化方法。背景技术0002包涵体是指大肠杆菌高效表达的重组蛋白在细胞内凝集，形成的不溶的、无活性的固体颗粒。一般含有50质量分数以上的重组蛋白，及少量的核糖体、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白、脂多糖等，易于对目标蛋白进行分离纯化。另外大肠杆菌表达体系具有培养周期短、成本低、高效表达等优点，在生产中被广泛应用。但得到的包涵体蛋白。
6、必须经过变性溶解及复性处理，才能使目标蛋白恢复其生物活性。因此，优化包涵体蛋白变性复性过程，得到具有生物活性的蛋白，将是大量生产重组蛋白最有效的途径之一。0003目前常用的包涵体变性剂有尿素、盐酸胍及一些常见的去垢剂如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、SARKOSYL等。68M尿素为报道使用最多的变性剂，通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展。但是尿素易分解产生异氰酸盐导致多肽链的自由氨基甲酰化，不能长期储存，尤其是在高浓度、温度及碱性PH条件下。变性溶解得到的包涵体蛋白通常采用最简单的稀释法和透析法并辅以适当的添加剂逐步降低尿素浓度对目标蛋白进行复性。但。
7、复性过程缓慢，耗时较长，易造成蛋白的降解或重新聚集，使得蛋白回收率较低。发明内容0004本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种HIS标签包涵体蛋白的纯化方法，该方法以更加温和的变性条件处理包涵体，以保证变性过程不会造成蛋白生物活性损失，从而可以在变性溶解后直接纯化而省去复性步骤。0005为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案0006一种HIS标签包涵体蛋白的纯化方法，包括以下步骤00071取待纯化的包涵体，先用包涵体洗涤液对其进行洗涤，再用PBS对其进行洗涤；00082取包涵体裂解液，对步骤1洗涤完毕的包涵体进行溶解，室温震荡，充分溶解后离心收集上清；00093利用NINET柱对步骤2。
8、得到的上清液进行纯化，过程中利用洗液洗脱杂蛋白，利用洗脱液洗脱目的蛋白，而后利用透析缓冲液对洗脱的目的蛋白进行透析。0010上述包涵体裂解液是其中具有50100MMCAPS，011N十二烷基肌氨酸钠的溶液，其PH为8090。0011优选的，同时满足所述透析缓冲液是其中具有50100MMNAH2PO4，400500MMTRIS的溶液，其PH为8090；所述洗液是其中具有50100MMNAH2PO4，1050MMTRISCL，510MM咪唑的溶液，其PH为7585；所述洗液是其中具有50100MMNAH2PO4，1050MMTRISCL，100300MM咪唑的溶液，其PH为7585。0012优选的。
9、，步骤1所述的包涵体洗涤液是其中具有20MMTRISCL，1TRITON说明书CN104211752A2/5页4X100的溶液，其PH为8090。0013优选的，步骤1利用包涵体洗涤液对包涵体洗涤的次数为23次。0014优选的，步骤1利用PBS对包涵体洗涤的次数为23次。0015同时本发明还提供了一种HIS标签包涵体蛋白的裂解液，其中具有50100MMCAPS，011N十二烷基肌氨酸钠，且其PH为8090。0016本发明以N十二烷基肌氨酸钠为变性剂，以碱性PH的CAPSN环己基3氨基丙磺酸为缓冲液，裂解包涵体蛋白。N十二烷基肌氨酸钠为一种表面活性剂，通过破坏蛋白内的疏水键溶解包涵体蛋白，变性条。
10、件较为温和。该变性方法的最大特点是，避免了尿素易分解产生异氰酸盐导致蛋白多肽链的自由氨基甲酰化的缺陷，溶解蛋白经NINTA柱纯化效果优于尿素，蛋白溶解后即具有生物活性，无需做复性处理。附图说明0017图1是本发明实施例1两种变性液裂解处理的包涵体经NI柱纯化后SDSPAGE分析结果；图中区域1对应未诱导菌体，区域2对应诱导菌体，区域3对应包涵体裂解上清，区域4对应包涵体裂解后沉淀，区域5对应裂解上清过柱残液，区域6对应洗液，区域7对应洗脱蛋白以BUFFER2为裂解液，区域8对应洗脱蛋白以尿素为裂解液。具体实施方式0018实施例1以尿素为变性剂处理包涵体与本发明方法处理包涵体对后续蛋白纯化效果的。
11、比较001911本发明方法所用到的试剂0020包涵体洗涤液BUFFER120MMTRISCL，1TRITONX100，PH8090。0021包涵体裂解液BUFFER250100MMCAPS，011N十二烷基肌氨酸钠，PH8090。0022透析缓冲液BUFFER350100MMNAH2PO4，400500MMTRIS，PH8090。透析缓冲液的PH在8090较为适宜，实际操作中需根据具体情况，避开目的蛋白的等电点。0023用于NINET柱纯化蛋白的洗液50100MMNAH2PO4，1050MMTRISCL，510MM咪唑，PH80。0024在NINET柱纯化蛋白过程中用于洗脱杂蛋白的洗脱液501。
12、00MMNAH2PO4，1050MMTRISCL，100300MM咪唑，PH80。002512包涵体的制备0026诱导表达按1100比例接种新鲜菌液至LB液体培养基，培养34H，加入IPTG诱导，继续培养45H。6000RPM，离心6MIN，收集菌体。该条件下目的蛋白几乎全部以包涵体形式表达。0027收获包涵体用1/10菌液体积的PBS洗涤菌体，再用1/10菌液体积的BUFFER1重悬菌体，加100G/ML溶菌酶，30水浴30MIN，于冰上超声破碎菌体。离心弃上清，收集包涵体。用BUFFER1洗涤包涵体23次，再用PBS洗涤23次，必要时洗涤过程中可加DNA酶，此过程可除去包涵体中的脂多糖、D。
13、NA等杂质，收集沉淀并称重。002813包涵体的裂解说明书CN104211752A3/5页50029BUFFER2裂解包涵体按20MG/ML的比例用裂解液60MMCAPS，05N十二烷基肌氨酸钠，PH80重悬包涵体必要时需要超声混匀，室温震荡15MIN1H或4过夜，12000RPM离心10MIN，收集含有可溶蛋白的上清。00308M尿素裂解包涵体按20MG/ML的比例用裂解液50MMNAH2PO4，10MMTRISCL，8M尿素，PH80重悬包涵体必要时需要超声混匀，室温震荡1H2H或4过夜，12000RPM离心10MIN，收集含有可溶蛋白的上清。该条件下可以使包涵体得到充分溶解。003114。
14、蛋白的纯化0032以BUFFER2为裂解液的蛋白纯化介质混匀，装柱；用大约4个柱体积的平衡液50MMNAH2PO4，10MMTRISCL，PH80平衡介质，直到流出液A280值接近零；取10ML蛋白裂解液上样，流速约12ML/MIN，此过程可收集样品流穿液便于分析；用约8个柱体积的洗液50MMNAH2PO4，10MMTRISCL，10MM咪唑，PH80清洗介质，直到流出液A280值趋于平衡，流速约34ML/MIN；用洗脱液50MMNAH2PO4，10MMTRISCL，200MM咪唑，PH80洗脱蛋白并收集。此时收集的目的蛋白即具有生物活性，经透析去除咪唑后既可作为配制疫苗备用蛋白。0033以尿。
15、素为裂解液的蛋白纯化介质混匀，装柱；平衡液50MMNAH2PO4，10MMTRISCL，8M尿素，PH80平衡介质，直到流出液A280值接近零；取10ML蛋白裂解液上样，流速约12ML/MIN，收集样品流穿液便于分析；平衡液清洗介质，直到流出液A280值趋于平衡；用约2个柱体积的洗液50MMNAH2PO4，10MMTRISCL，10MM咪唑，8M尿素，PH80清洗NI2柱，直到流出液A280值趋于平衡；洗脱液50MMNAH2PO4，10MMTRISCL，250MM咪唑，8M尿素，PH80洗脱蛋白，收集洗脱液。获得的蛋白为变性蛋白，需经复性后方可应用。003415结果评价0035经SDSPAGE。
16、分析纯化效果，结果如图1所示。可以发现以BUFFER2为裂解液的蛋白纯化后无杂蛋白条带，纯化效果良好，以尿素为裂解液的蛋白纯化后仍有少量杂蛋白存在，效果不如前者。0036BRADFORD法测定蛋白浓度两种方法分别用等量的洗脱液洗脱目的蛋白，浓度分别是580G/ML、400G/ML，BUFFER2为裂解液的蛋白纯化回收率略高于以尿素为裂解液的蛋白纯化。0037实施例20038一种HIS标签包涵体蛋白的纯化方法，包括以下步骤00391取待纯化的包涵体，先用包涵体洗涤液对其进行洗涤2次，再用PBS对其进行洗涤3次；00402取包涵体裂解液，对步骤1洗涤完毕的包涵体进行溶解，室温震荡，充分溶解后离心收。
17、集上清；00413利用NINET柱对步骤2得到的上清液进行纯化，过程中利用洗液洗脱杂蛋白，利用洗脱液洗脱目的蛋白，而后利用透析缓冲液对洗脱的目的蛋白进行透析；0042上述包涵体裂解液是其中具有75MMCAPS，05N十二烷基肌氨酸钠的溶液，其PH为85。0043实施例3说明书CN104211752A4/5页60044一种HIS标签包涵体蛋白的纯化方法，包括以下步骤00451取待纯化的包涵体，先用包涵体洗涤液对其进行洗涤3次，再用PBS对其进行洗涤2次；00462取包涵体裂解液，对步骤1洗涤完毕的包涵体进行溶解，室温震荡，充分溶解后离心收集上清；00473利用NINET柱对步骤2得到的上清液进行。
18、纯化，过程中利用洗液洗脱杂蛋白，利用洗脱液洗脱目的蛋白，而后利用透析缓冲液对洗脱的目的蛋白进行透析；0048上述包涵体裂解液是其中具有100MMCAPS，1N十二烷基肌氨酸钠的溶液，其PH为9。0049实施例40050一种HIS标签包涵体蛋白的纯化方法，包括以下步骤00511取待纯化的包涵体，先用包涵体洗涤液对其进行洗涤5次，再用PBS对其进行洗涤7次；00522取包涵体裂解液，对步骤1洗涤完毕的包涵体进行溶解，室温震荡，充分溶解后离心收集上清；00533利用NINET柱对步骤2得到的上清液进行纯化，过程中利用洗液洗脱杂蛋白，利用洗脱液洗脱目的蛋白，而后利用透析缓冲液对洗脱的目的蛋白进行透析；。
19、0054上述包涵体裂解液是其中具有50MMCAPS，01N十二烷基肌氨酸钠的溶液，其PH为8。0055实施例50056一种HIS标签包涵体蛋白的纯化方法，包括以下步骤00571取待纯化的包涵体，先用包涵体洗涤液对其进行洗涤2次，再用PBS对其进行洗涤3次；00582取包涵体裂解液，对步骤1洗涤完毕的包涵体进行溶解，室温震荡，充分溶解后离心收集上清；00593利用NINET柱对步骤2得到的上清液进行纯化，过程中利用洗液洗脱杂蛋白，利用洗脱液洗脱目的蛋白，而后利用透析缓冲液对洗脱的目的蛋白进行透析；0060上述包涵体裂解液是其中具有75MMCAPS，05N十二烷基肌氨酸钠的溶液，其PH为85。00。
20、61在以上技术方案中，所述透析缓冲液是其中具有50MMNAH2PO4，400MMTRIS的溶液，其PH为80；所述洗液是其中具有50MMNAH2PO4，10MMTRISCL，5MM咪唑的溶液，其PH为75；所述洗液是其中具有50MMNAH2PO4，10MMTRISCL，100MM咪唑的溶液，其PH为85。0062步骤1所述的包涵体洗涤液是其中具有20MMTRISCL，1TRITONX100的溶液，其PH为8090。0063实施例60064一种HIS标签包涵体蛋白的纯化方法，包括以下步骤00651取待纯化的包涵体，先用包涵体洗涤液对其进行洗涤3次，再用PBS对其进行洗涤2次；00662取包涵体裂。
21、解液，对步骤1洗涤完毕的包涵体进行溶解，室温震荡，充分溶解说明书CN104211752A5/5页7后离心收集上清；00673利用NINET柱对步骤2得到的上清液进行纯化，过程中利用洗液洗脱杂蛋白，利用洗脱液洗脱目的蛋白，而后利用透析缓冲液对洗脱的目的蛋白进行透析；0068上述包涵体裂解液是其中具有100MMCAPS，1N十二烷基肌氨酸钠的溶液，其PH为9。0069在以上技术方案中，所述透析缓冲液是其中具有100MMNAH2PO4，500MMTRIS的溶液，其PH为90；所述洗液是其中具有100MMNAH2PO4，50MMTRISCL，10MM咪唑的溶液，其PH为85；所述洗液是其中具有100M。
22、MNAH2PO4，50MMTRISCL，300MM咪唑的溶液，其PH为75。0070实施例70071一种HIS标签包涵体蛋白的纯化方法，包括以下步骤00721取待纯化的包涵体，先用包涵体洗涤液对其进行洗涤1次，再用PBS对其进行洗涤1次；00732取包涵体裂解液，对步骤1洗涤完毕的包涵体进行溶解，室温震荡，充分溶解后离心收集上清；00743利用NINET柱对步骤2得到的上清液进行纯化，过程中利用洗液洗脱杂蛋白，利用洗脱液洗脱目的蛋白，而后利用透析缓冲液对洗脱的目的蛋白进行透析；0075上述包涵体裂解液是其中具有50MMCAPS，01N十二烷基肌氨酸钠的溶液，其PH为8。0076在以上技术方案中。
23、，所述透析缓冲液是其中具有75MMNAH2PO4，450MMTRIS的溶液，其PH为85；所述洗液是其中具有75MMNAH2PO4，30MMTRISCL，8MM咪唑的溶液，其PH为8；所述洗液是其中具有75MMNAH2PO4，30MMTRISCL，200MM咪唑的溶液，其PH为8。0077步骤1所述的包涵体洗涤液是其中具有20MMTRISCL，1TRITONX100的溶液，其PH为8090。0078实施例80079一种HIS标签包涵体蛋白的裂解液，其中具有50MMCAPS，01N十二烷基肌氨酸钠，且其PH为80。0080实施例90081一种HIS标签包涵体蛋白的裂解液，其中具有100MMCAPS，1N十二烷基肌氨酸钠，且其PH为90。0082实施例100083一种HIS标签包涵体蛋白的裂解液，其中具有75MMCAPS，06N十二烷基肌氨酸钠，且其PH为88。0084以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。说明书CN104211752A1/1页8图1说明书附图CN104211752A。