荧光假单胞菌铁调控蛋白的应用.pdf

本发明涉及分子疫苗学领域，具体的说是荧光假单胞菌铁调控蛋白的应用。铁调控蛋白用于制备荧光假单胞菌的免疫疫苗。本发明的铁调控蛋白作为疫苗能够有效地保护牙鲆抵御荧光假单胞菌侵染。

1.  一种荧光假单胞菌铁调控蛋白的应用，其特征在于：铁调控蛋白用于制备荧光假单胞菌的免疫疫苗。

2.  按权利要求1所述的荧光假单胞菌铁调控蛋白的应用，其特征在于：铁调控蛋白为质粒pETTfeR或pETOprF。

3.  按权利要求1所述的荧光假单胞菌铁调控蛋白的应用，其特征在于：以荧光假单胞菌TSS1为模板，采用F1/R1或F2/R2为引物分别进行PCR扩增,PCR产物分别与载体pET259连接，获得质粒pETTfeR或pETOprF，所得质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)即可表达重组铁调控蛋白。

4.  按权利要求3所述的荧光假单胞菌铁调控蛋白的应用，其特征在于：所述引物为F1：5’-GATATCATGAGCCCCAGCTTCAACGCCT-3’；R1：5’-GATATCCGATGTAGTCACCGACGCGAA-3’；F2：5’-GATATCATGAAACTGAAAAACACCTTGG-3’；R2：5’-GATATCCTGAGCGGTA GCTTCAACC-3’。

荧光假单胞菌铁调控蛋白的应用
技术领域
本发明涉及分子疫苗学领域，具体的说是荧光假单胞菌铁调控蛋白的应用。
背景技术
荧光假单胞菌是一种革兰氏阴性细菌，广泛分布于各种环境。荧光假单胞菌是重要的水生动物病原菌，能够感染水生脊椎动物和无脊椎动物，前者包括多种养殖经济鱼类。对鱼类而言，荧光假单胞菌感染宿主范围广，既包括淡水鱼类也包括海水鱼类。目前对该菌引起的疾病在国内尚无有效防范措施。铁是一种细菌生存所必需的营养成分。在许多细菌中的研究表明，铁调控大量细菌蛋白的表达，这些蛋白参与各种生物功能，包括铁获取和运输、代谢反应以及致病过程等。在某些细菌中，位于细胞表面的铁调控蛋白参与细菌感染过程并具有免疫保护作用。目前荧假单胞菌铁调控蛋白的研究很少，其作用也不甚清楚。
发明内容
本发明目的在于提供荧光假单胞菌铁调控蛋白的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种荧光假单胞菌铁调控蛋白的应用，铁调控蛋白用于制备荧光假单胞菌的免疫疫苗。所述铁调控蛋白为质粒pETTfeR或pETOprF。
进一步的说，以荧光假单胞菌TSS1为模板，采用F1/R1或F2/R2为引物分别进行PCR扩增,PCR产物分别与载体pET259连接，获得质粒pETTfeR或pETOprF，所得质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)即可表达重组铁调控蛋白。
所述引物为F1：5’-GATATCATGAGCCCCAGCTTCAACGCCT-3’；R1：5’-GATATCCGATGTAGTCACCGACGCGAA-3’；F2：5’-GATATCATGAAACTGAAAAACACCTTGG-3’；R2：5’-GATATCCTGAGCGGTA GCTTCAACC-3’。
本发明具有如下优点：
1.显著保护性。本发明的荧光假单胞菌铁调控蛋白作为疫苗对荧光假单胞菌的免疫保护效率达50％以上。
2.本发明的疫苗无需商业化佐剂。
附图说明
图1为本发明实施例提供的纯化的铁调控蛋白(泳道1)。泳道M，分子量标准。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。
实施例1
荧光假单胞菌铁调控蛋白TfeR和OprF的表达受铁条件调控
荧光假单胞菌TSS1在正常LB培养基(对照组)或含有600uM铁络合物2,2’-dipyridyl(购于美国Sigma公司)的LB培养基中摇动培养2h，培养温度为28℃，转速160rpm。随后以5000g，4℃离心10min，收集菌体。将收集的菌体进行荧光定量PCR检测TfeR或OprF基因的表达(具体方法见文献：Zhang SR,Zhang L,Sun L.Identification and analysis of three virulence-associated TonB-dependent outer membrane receptors of Pseudomonas fluorescens.Dis Aquat Org.2014；110:181-91.)。结果表明，在铁络合物2,2’-dipyridyl的存在下，TfeR和OprF基因的表达量显著(P<0.01)上调(即检测到的TfeR和OprF的mRNA量显著增多)(分别为对照组的14倍和30倍)，说明这两个基因受铁条件调控。
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水；所述菌株TSS1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.2329，分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)保藏日期为2008年1月9日，保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。
实施例2
重组荧光假单胞菌铁调控蛋白rTfeR和rOprF的制备
步骤1)rTfeR和rOprF的表达载体pETTfeR和pETOprF的构建：
荧光假单胞菌TfeR和OprF的序列已被报道(GenBank access ion number.AFJ59752.1和AFJ59305.1)。pETTfeR的构建如下：以荧光假单胞菌TSS1为模板，采用引物F1/R1扩增TfeR基因。PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA,然后94℃40s,60℃60s,72℃60s,5个循环，然后94℃40s,66℃60s,72℃60s,30个循环。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体pET259(pET259构建过程参见Hu YH,Zheng WW,Sun L.Identification and molecular analysis of a ferritin subunit from red drum(Sciaenops  ocellatus).Fish Shellfish Immunol 2010；28:678-86)用限制性内切酶SwaI酶切后与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为pETTfeR。
pETOprF的构建如下：以荧光假单胞菌TSS1为模板，采用引物F2/R2PCR扩增OprF基因。PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA,然后94℃40s,56℃60s,72℃60s,5个循环，然后94℃40s,62℃60s,72℃60s,30个循环。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体pET259用限制性内切酶SwaI酶切后与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为pETOprF。
所述引物为F1：5’-GATATCATGAGCCCCAGCTTCAACGCCT-3’；R1：5’-GATATCCGATGTAGTCACCGACGCGAA-3’；F2：5’-GATATCATGAAACTGAAAAACACCTTGG-3’；R2：5’-GATATCCTGAGCGGTA GCTTCAACC-3’。
步骤2)重组荧光假单胞菌铁调控蛋白rTfeR和rOprF的诱导表达和纯化：
rTfeR的诱导表达和纯化如下：将上述步骤1)质粒pETTfeR用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(50ug/ml)的LB固体培养基上培养18－24小时,挑取转化子，将其命名为BL21/pETTfeR。将BL21/pETTfeR于含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液,加入100ml新鲜的含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中，于37℃下转速200rpm摇动培养至OD₆₀₀为0.6,加入终浓度为1mM的IPTG，37℃继续以转速160rpm摇动培养4－5h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4℃离心30min，回收上清。将上清中的蛋白用His Trap HP Columns(购于美国GE Healthcare公司)回收纯化，纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测(8v/cm电压下电泳25－30min，随后15v/cm电压下电泳2－2.5h)，测定其分子量大小，与rTfeR吻合(参见图1A)。
rOprF的诱导表达和纯化如下：将上述步骤1)质粒pETOprF用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(50ug/ml)的LB固体培养基上培养18－24小时,挑取转化子，将其命名为BL21/pETOprF。随后所有步骤同rTfeR的诱导表达和纯化。纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测(同上)，测定其分子量大小，与rOprF吻合(参见图1B)。
所述裂解液含10mM NaH₂PO₄、10mM Tris和8M尿素,pH 8.0。
实施例3
重组荧光假单胞菌铁调控蛋白rTfeR和rOprF作为疫苗的应用
步骤1)佐剂及疫苗混合液的制备。
佐剂对照液的制备:将5％(质量比)NaOH和5％(质量比)Al₂(SO₄)₃以2：5体积比混合，将混合物以10,000g离心5分钟。将沉淀悬浮于PBS中至0.2mg/ml，即为佐剂。将PBS与佐剂等体积混合，即为佐剂对照液。
疫苗混合液制备：将上述实施例2纯化的rTfeR或OprF分别在PBS中稀释至200ug/ml，将稀释后的蛋白与佐剂等体积混合，即为rTfeR疫苗混合液或rOprF疫苗混合液。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na₂HPO₄.12H₂O,0.024％NaH₂PO₄，余量为水。
步骤2)疫苗的免疫应用。将120条牙鲆(每条重约18g)随机分为3组，每组40条。将这3组分别命名为A,B和C组。将A组的每条鱼腹腔注射100ul上述步骤1)的rTfeR疫苗混合液，将B组的每条鱼腹腔注射100ul上述步骤1)的rOprF疫苗混合液，将C组的每条鱼腹腔注射100ul上述步骤1)的佐剂对照液。
步骤3)荧光假单胞菌悬液的制备。在LB培养基中培养荧光假单胞菌TSS1至OD₆₀₀为1,然后离心(5000g，4℃)10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为1x10⁸cfu/ml。
步骤4)疫苗免疫保护效应检测。在步骤2)免疫注射后的第30天，用上述步骤3)的荧光假单胞菌悬液腹腔注射步骤2)的3组鱼，每条鱼的注射量为100ul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，20条；B组,17条；C组,40条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)：
RPS＝100x(1－免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)
根据此公式算出rTfeR和rOprF的相对免疫保护效率分别为50％和58％。因此，重组荧光假单胞菌铁调控蛋白rTfeR和rOprF作为疫苗能够有效地保护牙鲆抵御荧光假单胞菌侵染。