技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种杜梨组培苗生根培养基，还涉及一种杜梨组培苗生根方法。
背景技术
梨为蔷薇科(Rosaceae)，梨亚科(Pomoideae)之梨属(Pyrus L.)植物。梨是一种重要的果树，在我国水果产量中，仅次于苹果、柑橘，居第三位。梨在生产中均采用嫁接繁殖，砧木是果树嫁接的重要基础，与果树的生产密切相关。优良砧木的筛选对于调节树势，延长结果年限，甚至调节果实品质等方面具有非常重要的意义。杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge.)是梨树砧木中综合抗性最强的砧木，在梨树生产研究中起着重要的作用。由于其适生性强，耐旱，根深、发达、耐瘠薄，抗盐碱能力强，在中性土及盐碱土中均能正常生长，且与我国现有大面积种植的白梨、砂梨、秋子梨等系统品种具有亲和力，为我国梨树砧木最佳选择，生产中广泛应用。
与其他木本果树一样，杜梨具有童期较长、田间繁殖耗用较大人力和时间、占用较多土地等特点，使其在常规育种中受限。目前，杜梨繁殖以实生播种为主，由于实生苗具有不同基因型，繁育的苗木生长势、抗病性、亲和力等方面均存在较大差异。此外，生产中已发现嫁接于不同砧木上接穗的生长势、抗病性、果实品质等也存在较大的差异。因而，生产中有必要选择基因型一致砧木用于苗木快繁。
对砧木进行无性繁殖，可以获得基因型一致的苗木，通常采用压条、扦插、组织培养等方式进行无性繁殖。其中，组织培养由于不受季节、环境等因素的影响，占场地面积以及人工较少而被认为是性价比以及效率最高的快繁方式。然而，木本植物组培快繁普遍存在生根困难、移栽成活率低等问题，影响了组培快繁技术的生产实际应用。
为解决试管苗生根，目前常用方法有以下几种：一是筛选合适生根培养基，在生根培养基上直接培养。二是瓶外生根，先将试管苗的茎段进行激素处理后，转到蛭石、珍珠岩、泥炭、苔藓等基质中来完成瓶外生根过程。三是瓶内二次转接生根，先将试管苗的茎段激素处理后，再转到空白培养基上诱导生根。这些方法在不同植物上都有成功的报道，但是不同植物采用的培养基配方以及培养方式存在极大差异，这对杜梨砧木的研究利用等方面造成了不便。
此外，这些常用方法仅仅集中于培养基的配方以及外源生长调节剂的浓度及配比，并未对外植体的选择考虑在内，而事实上，植物体内源激素对外植体的生根也具有相当大的影响，因为生长素对植物的作用具有正负两重性，即在低浓度促进生长，而超过最适浓度则抑制生长。植物的不同器官对其反应不同，一般敏感性为根＞芽＞茎，也就是说，组培苗外植体生根不仅仅取决于外源生长调节剂的控制，而是在内源以及外源生长素的共同调节下完成的，尤其是组培苗不定根的形成。其次，植物体分泌生长素的部位是幼芽幼叶和发育中的种子，不同外植体的选取，也在一定程度上影响着植物体内内源激素的含量，因此，结合外植体取材方式以及外源生长素的配比探索出便捷高效的杜梨组培苗生根的培养基配方具有重要的实际意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种杜梨组培苗生根培养基，该生根培养基能够提高生根效率、缩短生根周期、节约成本、操作简便。
本发明还要解决的技术问题是提供一种高效、简易的杜梨组培苗生根方法，该方法可提高杜梨组培苗生根率和移栽成活率，适用于杜梨组培快繁。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种杜梨组培苗生根培养基，包括：无机盐减半的MS培养基+0.25～0.5mg/L 3-吲哚丁酸+6～9g/L琼脂+0.3～0.5g/L活性炭+15～30g/L蔗糖。
其中，所述无机盐减半的MS培养基的组分和其在杜梨组培苗生根培养基中的浓度如下：0.95g/L硝酸钾、0.825g/L硝酸铵、0.185g/L七水硫酸镁、0.085g/L磷酸二氢钾、0.166g/L无水氯化钙、16.9mg/L一水硫酸锰、8.6mg/L七水硫酸锌、6.2mg/L硼酸、0.83mg/L碘化钾、0.25mg/L二水锰酸钠、0.025mg/L五水硫酸铜、0.025mg/L六水氯化钴、37.3mg/L乙二胺四乙酸二钠、34.55mg/L七水硫酸亚铁、100mg/L肌醇、2mg/L甘氨酸、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L盐酸吡哆醇、0.1mg/L盐酸硫胺素。本发明使用无机盐减半的MS培养基可使杜梨组培苗发根快，生根率高，根系发达，根多而粗壮，同时节约成本。
其中，所述生根培养基，3-吲哚丁酸(IBA)的浓度为0.25mg/L。当生长素IBA的浓度为0.25mg/L时，杜梨组培苗生根效率最高，并且成本用量较低。
其中，所述生根培养基，活性炭的浓度为0.3g/L。添加活性炭有利于提供生根所需的暗环境，免去刻意给予暗培养环境环节，促进生根，缩短生根周期；还对防止外植体褐化有一定的作用。
其中，所述生根培养基，琼脂的浓度为7～8g/L，优选7g/L。琼脂在离体生根中用来充当支持物，其生理作用表现较弱，但其浓度的高低通过影响培养基的水势和硬度进而影响组培苗的生根。
其中，所述生根培养基，蔗糖的浓度为15～25g/L，优选20g/L。蔗糖作为能源和渗透压物质，不同的蔗糖浓度影响根系的发育。
其中，所述生根培养基，溶剂为煮沸后的自来水。从实际操作角度来说，用煮沸的自来水作为溶剂配制杜梨生根培养基，不但减少了成本而且简化了实际操作过程，提高了实际生产上效率。
优选的，所述生根培养基包括：无机盐减半的MS培养基+0.25mg/L 3-吲哚丁酸+7g/L琼脂+0.3g/L活性炭+20g/L蔗糖，溶剂为煮沸后的自来水。
其中，所述生根培养基与生长健壮的切成1～2.5cm茎段的仅保留1～2片幼叶以及一芽的杜梨组培苗结合用于杜梨组培苗生根。
一种基于杜梨组培苗生根培养基的杜梨组培苗生根方法，该方法包括如下步骤：选择生长健壮的杜梨组培苗，切成1～2.5cm茎段，放入所述的生根培养基进行生根培养，得到杜梨生根苗。
其中，所述杜梨组培苗为继代培养30～50天后得到的组培苗，优选为继代培养40天后得到的组培苗。继代培养30天左右组培苗长势是最为良好的，超过50天，培养基养分大部分会被消耗掉，培养基会干涸，减少，对组培苗不利。
其中，所述茎段仅保留1～2片幼叶以及一芽。优选地，将所述杜梨组培苗切成1.5～2.5cm茎段，仅保留一片幼叶以及一芽。外植体的类型对杜梨组培苗的生根效率有很大的影响。由于新生叶片及芽的数量影响着外植体内源激素的含量，因此，外植体的选取应结合培养基激素含量的水平。当外植体仅保留1～2片幼叶以及一芽时，组培苗主枝清晰，根系发达。当外植体为多叶多芽时，组培苗丛生严重，发根率较低。
其中，所述生根培养，培养条件为：白天温度为25±2℃，夜间温度为20±2℃，光照强度为50～60μmol·m-2·s-1，每天光照12～14h。
本发明还提供与上述杜梨组培苗生根方法配合使用的炼苗和移栽方法，包括如下步骤：向生根的杜梨组培苗中加水，敞口炼苗2～3天；取出组培苗，洗净培养基，每株留叶2～3片，移入灭菌后的基质中，持水量为60％；白天温度为25±2℃，夜间温度为20±2℃；避免强光直射，阴暗角落培养一周；随后光照强度为50～60μmol·m-2·s-1，每天光照12～14h，继续练苗20天，期间浇灌1/8无机盐MS液体培养基，用煮沸后的自来水配制；然后移栽定植。
其中，所述基质为珍珠岩∶蛭石∶草炭体积比为1∶1∶3的基质。
有益效果：
(1)MS培养基无机盐用量减半，提高生根效率的同时节约成本。
(2)现有杜梨组培苗生根技术经暗培养和光培养两个步骤，耗时长、操作复杂，而本发明添加活性炭，提供生根所需的暗环境，免去刻意给予暗培养环境环节，促进生根，缩短生根周期，操作简便、成本低。
(3)打破了杜梨生根培养基的常规采用多种生长调节剂并用的方法，仅单一使用3-吲哚乙酸，并且优化的选择了最佳植物生长调节剂浓度，3-吲哚乙酸含量微量，使得操作简便、成本降低。
(4)无需刻意调试酸碱度，或特殊水源，仅日常自来水煮沸后即可使用，在未影响生根率的同时，简化操作过程，降低成本。
(5)筛选最佳生根外植体，优化生根体系。
(6)本发明较常规方法处理，大幅提高了杜梨组培苗生根率和移栽成活率，缩短生根周期。本发明的杜梨组培苗生根率可达75.7％，平均根数3.01条，平均根长3.0厘米。植株叶形及叶色正常，后续移栽成活率高，生根组培苗的移栽率可达95％。
综上所述，本发明的方法较常规方法生根率和移栽成活率高，繁殖效率高，操作简便，成本低，便于推广，遗传稳定性好，适用于杜梨组培快繁。
附图说明
图1为杜梨生根苗移植定栽后的照片；
图2为实施例2中杜梨组培苗培养40天后的照片(a、处理1；b、处理2)；
图3为实施例4中杜梨组培苗培养40天后的照片(a、处理1；b、处理2)；
图4为实施例5中杜梨组培苗培养40天后的照片(a、处理1；b、处理2)；
图5为实施例6中杜梨组培苗培养40天后的照片(a、一叶一芽外植体；b、多叶多芽外植体；c、处理1；d、处理2)。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：杜梨组培苗的生根
(1)培养基组分
MS基本培养基(无机盐，微量元素，铁盐，有机元素)：
无机盐：硝酸钾38g/L；
硝酸铵33g/L；
七水硫酸镁7.4g/L；
磷酸二氢钾3.4g/L；
无水氯化钙6.64g/L；
微量元素：一水硫酸锰16.9g/L；
七水硫酸锌8.6g/L；
硼酸6.2g/L；
碘化钾0.83g/L；
二水锰酸钠0.25g/L；
五水硫酸铜0.025g/L；
六水氯化钴0.025g/L；
铁盐：乙二胺四乙酸二钠7.46g/L；
七水硫酸亚铁6.91g/L；
有机元素：肌醇20g/L；
甘氨酸0.4g/L；
烟酸0.1g/L；
盐酸吡哆醇0.1g/L；
盐酸硫胺素0.02g/L；
3-吲哚丁酸(IBA)：1mg/mL
活性炭；琼脂；蔗糖。
(2)配备1L生根培养基所需各组分的数量：
25mL MS无机盐+1mL MS微量元素+5mL MS铁盐+5mL MS有机元素+0.3～0.5g活性炭+6～9g琼脂+15～30g蔗糖+0.25～0.5mL IBA。
(3)外植体的选取：
在继代培养40天的杜梨组培苗中，选生长健壮、杜梨组培苗作为试材，切成1～2.5cm的茎段，除去多余叶片，保留1-2片幼叶以及一芽，将茎段条接种到上述生根培养基上。
(4)培养条件
每颗植株培养基用量为30mL；
白天温度为25±2℃，夜间温度为20±2℃；
光照强度为50～60μmol·m-2·s-1，每天光照12～14h。
(5)移栽定植
待40天左右生根后(生根率可达75％)，向生根的试管植株三角瓶中加水5～10mL，敞口炼苗2～3天，取出组培苗，洗净培养基，每株留叶2～3片，移入灭菌后的基质中(珍珠岩∶蛭石∶草炭土1∶1∶3)，持水量为60％；白天温度为25±2℃，夜间温度为20±2℃；避免强光直射阴暗角落培养一周；随后光照强度为50～60μmol·m-2·s-1，每天光照12～14h，继续练苗20天，期间浇灌1/8无机盐MS液体培养基，仍用煮沸后的自来水配制；然后移栽定植，成活率可达95％以上。杜梨生根苗移植定栽后的照片见图1。
实施例2：MS无机盐对杜梨组培苗生根效果的影响
本实施例基于MS增殖培养基培养的苗龄40天的生长健壮的丛生苗，剪取1.5～2.5厘米左右杜梨丛生苗茎段，保留顶部一片叶片和一个叶芽。
生根培养基配方如下：
处理1：MS+0.3g/L活性炭+7g/L琼脂粉+20g/L蔗糖+0.25mg/L IBA
处理2∶1/2MS+0.3g/L活性炭+7g/L琼脂粉+20g/L蔗糖+0.25mg/L IBA
试验方法：将备用试管苗茎段分成两组，分别在上述两种不同MS无机盐含量的生根培养基中进行平行试验，具体是：试管苗茎段接种到培养基中后，观察培养，40天后统计数据，见表1。杜梨组培苗培养40天后的照片见图2(a、处理1；b、处理2)。
表1
处理方式 MS无机盐 生根率(％) 平均生根条数(条) 平均根长(厘米) 1 MS 40.2 1.95 1.56 2 1/2MS 75.7 3.01 3.10
由表1、图2可见，在观察期内，虽然两种处理条件下，杜梨组培苗都可以发根，但是无机盐含量低(MS大量元素减半)可使杜梨组培苗发根快，生根率高，根系发达，且根多而粗壮。在培养基1/2MS上培养生根比在培养基MS上培养生根的生根率提高了88.5％，平均生根条数增加了54.4％，平均根长增加了98.7％，并且成本降低。
实施例3：生长素IBA浓度的筛选实验
本实施例基于MS增殖培养基培养的苗龄40天的生长健壮的丛生苗，剪取1.5～2.5厘米左右杜梨丛生苗茎段，保留顶部一片叶片和一个叶芽。
培养基配方如下：
处理1：1/2MS+0.3g/L活性炭+7g/L琼脂粉+20g/L蔗糖+0.2mg/L IBA
处理2：1/2MS+0.3g/L活性炭+7g/L琼脂粉+20g/L蔗糖+0.25mg/L IBA
处理3：1/2MS+0.3g/L活性炭+7g/L琼脂粉+20g/L蔗糖+0.3mg/L IBA
处理4：1/2MS+0.3g/L活性炭+7g/L琼脂粉+20g/L蔗糖+0.4mg/L IBA
处理5：1/2MS+0.3g/L活性炭+7g/L琼脂粉+20g/L蔗糖+0.5mg/L IBA
处理6：1/2MS+0.3g/L活性炭+7g/L琼脂粉+20g/L蔗糖+1.0mg/L IBA
试验方法：将备用试管苗茎段分成六组，分别在1/2MS+0.3g/L活性炭+7g/L琼脂粉+20g/L蔗糖并附加不同浓度的IBA的生根培养基中进行平行试验，具体是：试管苗茎段接种到培养基中后，观察培养，40天后统计数据，见表2。
表2
由表2可见，当生长素IBA的浓度为0.25～0.5mg/L时，杜梨组培苗生根率可达68.1％以上，平均生根条数可达2.75厘米以上，平均根长可达2.88厘米以上。当生长素IBA的浓度为0.25mg/L时，杜梨组培苗生根效率最高，可达75.7％，平均生根条数3.01条，平均根长可达3.10厘米，并且成本用量较低。从表2明显能够看出，当生长素IBA的浓度不在范围内时杜梨组培苗生根率、平均生根条数、平均根长明显不如处理方式2～6。
实施例4：培养基溶剂酸碱度对杜梨组培苗生根效果的影响
本实施例基于MS增殖培养基培养的苗龄40天的生长健壮的丛生苗，剪取1.5～2.5厘米左右杜梨丛生苗茎段，保留顶部一片叶片和一个叶芽。
培养基配方如下：
处理1：1/2MS+0.3g/L活性炭+7g/L琼脂粉+20g/L蔗糖+0.25mg/L IBA。用蒸馏水溶解，酸碱度调节至5.8，定容。
处理2：1/2MS+0.3g/L活性炭+7g/L琼脂粉+20g/L蔗糖+0.25mg/L IBA。用煮沸后的自来水溶解，定容。
试验方法：将备用试管苗茎段分成两组，分别用蒸馏水调PH值至5.8与煮沸后的自来水为溶剂配制生根培养基进行平行试验，具体是：试管苗茎段接种到培养基中后，观察培养，40天后统计数据，见表3。杜梨组培苗培养40天后的照片见图3(a、处理1；b、处理2)。
表3
处理方式 培养基溶剂酸碱度 生根率 平均生根条数(条) 平均根长(厘米) 1 蒸馏水调PH值至5.8 75.3 3.10 3.0 2 煮沸后的自来水 75.7 3.11 3.1
由表3、图3可见，分别用蒸馏水调PH值至5.8与煮沸后的自来水为溶剂配制生根培养基，杜梨组培苗的生根效率差别不大。但从实际操作角度来说，用煮沸的自来水作为溶剂配制杜梨生根培养基，不但减少了成本而且简化了实际操作过程，提高了实际生产上效率。
实施例5：活性炭对杜梨组培苗生根效果的影响
本实施例基于MS增殖培养基培养的苗龄40天的生长健壮的丛生苗，剪取1.5～2.5厘米左右杜梨丛生苗茎段，保留顶部一片叶片和一个叶芽。
处理1：1/2MS+0.3g/L活性炭+7g/L琼脂粉+20g/L蔗糖+0.25mg/L IBA
处理2：1/2MS+7g/L琼脂粉+20g/L蔗糖+0.25mg/L IBA
试验方法：将备用试管苗茎段分成两组，分别在上述两种不同生根培养基中进行平行试验，具体是：试管苗茎段接种到培养基中后，观察培养，40天后统计数据，见表4。杜梨组培苗培养40天后的照片见图4(a、处理1；b、处理2)。
表4
处理方式 活性炭 生根率(％) 平均生根条数(条) 平均根长(厘米) 1 加活性炭 75.7 3.01 3.1 2 不加活性炭 64.6 2.50 2.0
由表4、图4可见，使用添加活性炭的培养基，杜梨组培苗的生根效率以及生根条数和根长等三个方面均高于不添加活性炭的培养基。添加活性炭有利于提供生根所需的暗环境，促进生根。除此之外，添加活性炭对防止外植体褐化有一定的作用。
实施例6：外植体类型对杜梨组培苗生根效果的影响
本实施例基于MS增殖培养基培养的苗龄40天的生长健壮的丛生苗茎段，接种培养基为1/2MS+0.3g/L活性炭+7g/L琼脂粉+20g/L蔗糖+0.25mg/L IBA。
处理1：外植体为保留一叶一芽的杜梨丛生苗茎段。
处理2：外植体为多叶多芽的杜梨丛生苗茎段。
试验方法：剪取1.5～2.5厘米左右杜梨丛生苗茎段，保留顶部一片叶片和一个叶芽，剪去其他多余的叶片及叶芽，接种于生根培养基上。剪去1.5～2.5厘米左右杜梨丛生苗茎段，直接接种于生根培养基。进行平行试验。40天后统计数据，见表5。杜梨组培苗培养40天后的照片见图5(a、一叶一芽外植体；b、多叶多芽外植体；c、处理1；d、处理2)。
表5
处理方式 外植体 生根率(％) 平均生根条数(条) 平均根长(厘米) 1 一叶一芽 75.7 3.01 3.1 2 多叶多芽 47.1 1.75 2.15
由表5、图5可见，外植体的类型对杜梨组培苗的生根效率有很大的影响。由于新生叶片及芽的数量影响着外植体内源激素的含量，因此，外植体的选取应结合培养基激素含量的水平。当杜梨组培苗茎段长度在1.5～2.5厘米之间，嫩芽嫩叶各保留一处时，与本发明中使用的生根培养基结合可以达到最佳的生根效果，此时，组培苗主枝清晰，根系发达。而当外植体为多叶多芽时，组培苗丛生严重，发根率较低。